Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Forskning som rapporterats i detta projekt stöddes av en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Grant nummer P20GM10342 till HH3, och av NSF Award Number IOS-1257217 till CGE.

1. Hardware Setup och beredning av material
Anmärkning: Vänligen se tabell 1 och tabell över material för beredning av lösningar, reagens och utrustningsdetaljer.
<ol><li>Ställ in en dissekera Mikroskop för att se ägg och vägleda injektionsnålen. (Figur 1a visar ett dissekera Mikroskop utrustat med fluorescens.) Fluorescensförmågan är fördelaktig men inte nödvändig.</li>
	<li>Placera en mikromani...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

De två största utmaningarna med denna teknik är de relaterade frågorna om optimal nål storlek och överlevnadsförmåga. Även mindre nålar förbättra överlevnadsförmåga, nålar med smalare lumen har en högre grad av kapillärkrafter på jobbet, vilket gör det mer sannolikt att äggula kommer att flytta in i nålen orsakar det att täppa. I bästa fall, blockeringar kan rensas helt enkelt genom att injicera ett annat ägg eller genom att rensa nålen som beskrivs ovan. Man kan också försöka öka balansen t...

Förmågan att modifiera arvsmassan eller påverka genuttrycket i organismer är grunden för utformningen av många typer av experiment som testar funktionell kausalitet. Det är också kritiskt för det komparativa och evolutionärt relevanta arbetet att teknikerna för genomisk och icke-genomisk modifiering finns tillgängliga i organismer utanför traditionella genetiska laboratorie modeller (t. ex. mus Musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans). Oavsett om det är viljan att förstå organismers mångfald1 eller en anslutning till Krogh princip, att för varje biologisk fråga finns en organism som är bäst lämpad för sin lösning2,3, förmågan att ändra genom eller inflytande genuttrycket är viktigt för modern experimentell design.
Cricket gryllus bimaculatus är ett framväxande modellsystem. Används för det senaste århundradet i neuroethology experiment4, de senaste två decennierna har bevittnat ett ökat experimentellt intresse för cricket, särskilt inriktad på utvecklingen och utvecklingen av denna organism5. Cricket är en hemimetabolous insekt som grenar basalt till väl studerade holometabolous insekter, såsom D. melanogaster och Tribolium Auktor6. På grund av sin användbara position på den evolutionära träd, forskare är intresserade av att ställa moderna, sofistikerade experimentella frågor i denna insekt, vilket har lett till ett växande intresse för att anpassa molekylära verktyg för användning i G. bimaculatus.
Injektioner av molekylära reagenser till Cricket ägg kan användas för genomisk modifiering experiment samt icke-genomisk manipulationer av genuttryck i embryon. Till exempel transgena G. bimaculatus redovisade egfp-infogningar har skapats med hjälp av transposase piggybac7,8. Utredare har framgångsrikt skapat knockout G. bimaculatus med zink-Fingernukleaser (ZFNs) och transkription Activator-liknande (tal) Effektornukleaser (talens) för att införa dubbelsträngade raster i specifika genomiska regioner9. Även om ZFNs och TALENs tillåter platsspecifik inriktning hos djur bortom de fyra stora modell systemen, har dessa reagenser snabbt överträffats av CRISPR/Cas9-systemet, vilket är enklare att använda, effektivare och mycket flexibelt10. CRISPR har använts i G. bimaculatus för att producera Knock-Out11 samt Knock-in-linjer12,13 utöver genomisk modifiering kan dsRNA injiceras i ägg för att slå ner mRNA-uttrycket i utvecklingen embryon, vilket gör det möjligt för utredarna att förstå de specifika Avskriftens roll under hela utvecklingen14,15. Några begränsade Detaljer om hur man injicerar cricket ägg har publicerats tidigare12.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att injicera tidiga G. bimaculatus -ägg. Detta protokoll är effektivt och lätt att anpassa till olika laboratorie inställningar, injektions material, och möjligen till andra insekter. Även om ytterligare Detaljer för utformning och genomförande av genomiska modifikationer och knockdown experiment har publicerats på andra ställen12,13, kommer dessa metoder i slutändan att förlita sig på det insprutnings protokoll som beskrivs här.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

Att förändra gen funktionen i en utvecklande organism är central för olika typer av experiment. Medan oerhört kraftfulla genetiska verktyg har utvecklats i traditionella modellsystem, är det svårt att manipulera gener eller Messenger-RNA (mRNA) i de flesta andra organismer. Samtidigt förlitar sig evolutionära och komparativa metoder på en utforskning av genfunktion hos många olika arter, vilket nödvändiggör utveckling och anpassning av tekniker för att manipulera uttryck utanför för närvarande genetiskt tractable Arter. Detta protokoll beskriver en metod för att injicera reagenser i cricket ägg att analysen effekterna av en viss manipulation på embryonal eller larv utveckling. Anvisningar för hur man samlar in och injicerar ägg med avfasade nålar beskrivs. Denna relativt enkla teknik är flexibel och potentiellt anpassningsbar till andra insekter. Man kan samla och injicera dussintals ägg i ett enda experiment, och överlevnaden för buffert-bara injektioner förbättra med praktik och kan vara så hög som 80%. Denna teknik kommer att stödja flera typer av experimentella metoder, inklusive injektion av farmakologiska medel, in vitro-utjämnade mRNA att uttrycka gener av intresse, dubbelsträngad RNA (dsRNA) för att uppnå RNA-interferens, användning av klustrade regelbundet korta palindromiska repetitioner (CRISPR) i samförstånd med CRISPR-associerat protein 9 (Cas9) reagenser för genomisk modifiering, och överföras element för att generera övergående eller stabila transgena linjer.

Syrsor lätt lägga ägg i fuktigt material, och ger tillräckligt med material, såsom fuktig sand eller smuts, inducerar dem att lägga ett stort antal ägg. Detta är särskilt effektivt om syrsor först berövas ägg läggnings material för 8 – 10 h. ägg som läggs i ren sand kan lätt separeras, samlas in (figur 1b) och placeras i skräddarsydda ägg brunnar för injektion (figur 1c). Ett dissekerande Mikroskop, en mikro...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Injicera gryllus bimaculatus ägg

Här presenterar vi ett protokoll för att injicera cricket ägg, en teknik som fungerar som en grundläggande metod i många experiment i cricket, inklusive, men inte begränsat till, RNA-interferens och genomisk manipulation.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Denna teknik fungerar som en grundläggande metod för experiment som är utformade för att analysera den embryonala eller larvutveckling av cricket. Den största fördelen med denna teknik är att den är flexibel och kommer att stödja flera typer av experimentella metoder, såsom de som utnyttjar RNA-interferens eller genomisk manipulation. Visar förfarandet kommer att Hadley Wilson Horch, ansvarig utredare i laboratoriet.För att börja detta förfarande våt den snurrande kvarnplanet av avfasningsmaskinen med droppande vatten. Placera den dragna nålen i avfasningsspelaren och vrid den till 20 graders vinkel. Sänk nålen tills den bara vidrör slipplattan och avfasa den i två till tre minuter.Bedöm avfasningen genom att placera den avfasade nålen på dubbelstickstejp som har vidhäftats på ett glasmikroskopsglas. Placera bilden på scenen i en sammansatt mikroskop utrustad med en kamera och bild förvärv programvara. Förvärva en bild av nålen med hjälp av en 20x mål.Använd bildhanteringsprogram för att mäta den inre lumen diametern på nålen bara proximala till avfasade öppningen. Kassera eventuella nålar med en öppning som är mindre än åtta mikrometer eller större än 12 mikrometer. Först gör 40 milliliter av 1%uppstod i vatten och häll den i en 10 centimeter Petriskål.Placera ett ägg väl stämpel på ytan av agaros innan den stelnar. När agarosen är stelnat, ta bort stämpeln för att avslöja brunnarna. Fyll därefter agaros brunnsplattan med HBS som innehåller 1%penicillin streptomycin.Placera locket på skålen, linda in den i Parafilm och förvara den i fyra grader Celsius. Efter detta fyller du en 35 millimeter petriskål med vit lekplatssand för att göra en äggsamlingsrätt för syrsorna att lägga ägg i. Täck äggrätten med en pappershandduk fyrkantiga till cirka 18 av 18 centimeter.Fyll med kranvatten genom pappershandduken. Sedan, luta Petri-skålen och försiktigt pressa toppen för att ta bort överflödigt vatten. Tuck hörnen av pappershandduk torget under skålen och placera ägg skålen i en inverterad lock som hjälper till att hålla pappershandduken på plats.Placera äggrätten i cricketbehållaren och låt de vuxna honorna oviposit äggen i en till två timmar. Under tiden, låt agaros skålen att värma till rumstemperatur som förberedelse för att hålla äggen för injektion. När du är klar, ta bort äggsamlingsskålen, som nu innehåller nylagda ägg, från cricketbehållaren.Ta bort pappershandduken och lägg en sil med en porstorlek mellan 0,5 och en millimeter över en bägare. Skölj innehållet i äggläggningsfatet i silen under försiktigt rinnande kranvatten. Sandkornen kommer att falla genom silens nät i bägaren nedan medan cricketäggen ligger kvar i silkorgen.Fyll en behållare med omvänd osmos vatten och placera den i en bricka. Invertera silen över behållaren och knacka den mot skålen för att rubba äggen i vattnet. Äggen kommer att sjunka till botten av behållaren.Använd därefter sax för att skära spetsen av en P1000 pipett spets för att göra en öppning cirka tre millimeter i diameter. Placera detta tips på en P1000 pipetter, och använda den för att överföra äggen från behållaren till agarose äggformar skålen. Med hjälp av plastpincett, rada upp äggen i agaros brunnarna.Varje ägg kommer att sjunka till botten av en enskild brunn. Täck petriskålen med lock tills du är redo att injicera. Till att börja placera äggens rätt under dissekering mikroskop och välj en låg förstoring på runt 10x.Dra upp 1,5 mikroliter injektionslösning med hjälp av 20 st microliter-lastspetsar och en P10-pipett och sätt in lastspetsen i den breda änden av injektionsnålen. Utvisa injektionslösningen i injektionsnålen. Stick in nålen i injektionshuset och dra åt, se till att nålen är ordentligt och ordentligt införd i huset.Sätt sedan försiktigt in injektionshuset i mikromanipulatorn, var noga med att inte gå sönder eller skadas av nålen. Medan du tittar på både ägg och nål genom mikroskopet, flytta nålen nära X i det övre vänstra hörnet av skålen nätet. Sänk nålen tills spetsen kommer in i HBS plus penicillin streptomycin buffrad lösning i skålen.Centrera nålen i synfältet och flytta äggfatet så att nålen är några millimeter närmare kanten av skålen än äggen. Efter detta, ställ in mikroskopet till det filter som är lämpligt för Rhodamine att observera fluorescensen i nålen och fokusera på dess spets. På mikroinjektor vrid långsamt balansvredet medurs tills injektionslösningen börjar läcka ut ur nålen i fjädringslösningen.Vrid sedan ratten bakåt moturs något tills färgämnet bara slutar läcka ut ur nålen. Med nålen fortfarande centrerad i synfältet, flytta ägg skålen så att nålen är riktad mot ägget som ska injiceras först. Justera förstoringen till ca 50x så att ett enda ägg fyller det mesta av synfältet.Använd både mikromanipulator och en hand på äggfatet för att flytta nålen i läge för injektionen. Använd mikromanipulatorn för att föra fram nålen och för in spetsen i det första ägget som ska injiceras, se till att sätta in nålen vid 20 till 30%av ägglängden från den bakre änden av ägget vinkelrätt mot äggets långa axel. Injicera lösningen med antingen injektionsfotpedalen eller injektionsknappen på mikroinjektorn.En liten bolus av fluorescerande material inuti ägget kommer att indikera en lyckad injektion. Efter detta, dra tillbaka nålen från ägget. Om ägget oavsiktligt lyfts ur sin brunn vid tillbakadragning av nålen, använd små tänja för att trycka tillbaka ägget i brunnen medan du drar tillbaka nålen.I denna studie injiceras cricketägg med hjälp av en teknik som fungerar som en grundläggande metod i många experiment, inklusive men inte begränsat till, RNA-interferens och genomisk manipulation. Överlevnadsgraden är en viktig parameter för att bedöma framgången för detta experiment. De flesta döda ägg kan lätt identifieras genom synen som äggula och embryonal vävnad i ägget börjar klumpa ojämnt, och så småningom de flesta av äggulan kommer att migrera till ena sidan av ägget.Vid bedömning efter fyra till sex dagar överlevde större än 85% av icke-injekerade ägg, medan ägg som injicerades med experimentella reagenser i allmänhet hade en lägre överlevnadsgrad. Kontrollera för alla aspekter av injektionen sig, inklusive nålen punktering, införandet av färgämne och buffert, eller förekomsten av fordon eller dubbel strandsatta RNA, krävs för att förstå de verkliga effekterna av den experimentella manipulation försök. Sättet man bedömer de fenotypiska resultaten av injektion beror på vad som injicerades.Till exempel kan fenotypiska förändringar till följd av specifika mRNA knockdowns vara uppenbart på brutto anatomi nivå. Om å andra sidan en cDNA kodning en EGFP taggade hisstone 2B gen under kontroll av en G.bimaculatus aktin promotor sätts in i cricket genomet med hjälp av piggyback transposas, blir det möjligt att visualisera varje kärna i ägget med hjälp av fluorescens att excitera EG taggFPED hist 2B protein. Justera balansen så att nålarna inte täppa är ett kritiskt steg i denna procedur.Du kan behöva göra flera justeringar efter efterföljande injektioner eftersom äggula ibland täpper till nålspetsen. Syrsan är en hemimetabolous insekt som grenar basalt till väl studerade holometabolous insekter som Drosophila. Studera cricket utveckling kommer att hjälpa oss att förstå mer om evolution och utveckling i hela djurriket.Denna teknik tar lite övning. Vi rekommenderar att öva kontroll injektioner tills överlevnaden fyra eller fem dagar efter injektionen är minst 80%

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salthalt beroende toxicitet Analys av Silver Nanocolloids Använda Medaka ägg

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

I Ovo Matning av kommersiella slaktkycklingägg: En exakt och reproducerbar metod för att påverka muskelutveckling och tillväxt

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

Optogenetisk signalaktivering i zebrafiskembryon

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

Visualisering av proteiner med låg förekomst och posttranslationella modifieringar i levande Drosophila-embryon via injektion av fluorescerande antikroppar

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...