Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Bu projede bildirilen araştırmalar, P20GM10342 ile HH3 arasında yer alan Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ve NSF ödül numarası IOS-1257217 tarafından desteklenmiştir. Cge.

1. Donanım Kurulumu ve Malzemelerin Hazırlanması
NOT: Çözüm, reaktif ve ekipman ayrıntılarının hazırlanması için tablo 1 ve Malzeme Tablosu'na bakın.
<ol><li>Yumurtaları görmek ve enjeksiyon iğnesini yönlendirmek için bir kesme mikroskobu ayarlayın. (Şekil 1A floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu gösterir.) Floresan yeteneği avantajlıdır ancak gerekli değildir.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

Bu teknikile iki ana zorluklar optimal iğne boyutu ve hayatta kalma ile ilgili konulardır. Küçük iğneler hayatta kalma yeteneğini artırmak rağmen, dar lümenile iğneler iş yerinde kılcal kuvvetler daha büyük bir dereceye sahip, hangi sarısı iğne içine hareket edecek daha olası dır tıkanmasına neden. En iyi durumda, tıkanıklıklar sadece başka bir yumurta enjekte ederek veya yukarıda açıklandığı gibi iğne temizleyerek temizlenebilir. Bir de yumurta sarısı iğne dışarı itilir kadar mikr...

Organizmalarda genomu değiştirebilme veya gen ekspresyonunu etkileme yeteneği, fonksiyonel nedenselliği test eden birçok deney türünün tasarımının temelini oluşturur. Genomik ve genomik olmayan modifikasyon tekniklerinin geleneksel genetik laboratuvar hayvan model sistemleri dışındaki organizmalarda bulunması karşılaştırmalı ve evrimsel olarak ilgili çalışmalar için de önemlidir (örneğin, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, ve Caenorhabditis elegans). İster organizma çeşitliliğini anlamak için arzu1 veya Krogh ilkesine bir bağlılık, her biyolojik soru için en iyi çözüm 2 uygun bir organizma olduğunu,3, genomları değiştirmek için yeteneği ya da gen ekspresyonunun modern deneysel tasarımlar için gerekli olduğu etkidir.
Kriket Gryllus bimaculatus gelişmekte olan bir model sistemidir. Nöroethology deneylerde son yüzyılda kullanılan4, son yirmi yılda kriket artan bir deneysel ilgi tanık, özellikle bu organizmanın evrimi ve gelişimi üzerinde duruldu5. Kriket d. melanogaster ve Tribolyum castaneum6gibi iyi çalışılmış holometabolöz böcekler, bazal dalları hemimetabolous böcek. Evrim ağacı üzerindeki yararlı konumu nedeniyle, bilim adamları g. bimaculatuskullanımı için moleküler araçlar adapte artan bir ilgi yol açmıştır bu böcek, modern, sofistike deneysel sorular soran ilgileniyoruz.
Kriket yumurtalarına moleküler reaktif enjeksiyonları genomik modifikasyon deneyleri ve embriyolarda gen ekspresyonunun genomik olmayan manipülasyonları için kullanılabilir. Örneğin, transgenik G. eGFP eklemeleri taşıyan bimaculatus transposaz piggyBac7,8kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırmacılar başarıyla çinko-parmak nükleazlar kullanarak nakavt G. bimaculatus yarattık (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatör benzeri (TAL) efektör nükleazlar (TALENs) belirli genomik bölgelerde çift iplikli tatili tanıtmak için9. ZFN'ler ve TALEN'ler büyük dört model sistemlerinin ötesindeki hayvanlarda siteye özgü hedeflemeye izin vermesine rağmen, bu reaktifler kullanımı daha kolay, daha verimli ve son derece esnek10olan CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hızlı bir şekilde aşılmıştır. CRISPR, G. bimaculatus'ta nakavt11 ve knock-in hatları üretmek için kullanılmıştır12,13 Genomik modifikasyona ek olarak, dsRNA gelişmekte olan mRNA ekspresyonunu yıkmak için yumurtalara enjekte edilebilir embriyolar, araştırmacılar geliştirme 14 ,15boyuncabelirli transkript rolünü anlamak için izin . Kriket yumurtaları enjekte etmek için bazı sınırlı ayrıntılar daha önce12yayınlanmıştır .
Burada, erken G. bimaculatus yumurta enjekte etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu protokol çeşitli laboratuvar ayarlarına, enjeksiyon malzemelerine ve muhtemelen diğer böceklere etkili ve kolayca uyarlanabilir. Genomik modifikasyon ve nakavt deneylerinin tasarlanması ve uygulanması için ek ayrıntılar başka bir yerde yayınlanmış olsa da12,13, Bu yaklaşımlar sonuçta burada ayrıntılı enjeksiyon protokolü ne bağlı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

Gelişmekte olan bir organizmada gen işlevini değiştirmek farklı deney türlerinin merkezinde yer alıyor. Geleneksel model sistemlerinde son derece güçlü genetik araçlar geliştirilmiş olmakla birlikte, diğer organizmalarda genleri veya haberci RNA'yı (mRNA) işlemek zordur. Aynı zamanda, evrimsel ve karşılaştırmalı yaklaşımlar birçok farklı türde gen fonksiyonunun araştırılmasına dayanıyor, bu da şu anda genetik olarak kontrol edilebilir olan dış ifadeyi manipüle etme tekniklerinin geliştirilmesini ve uyarlanmasına ihtiyaç diliyor. Tür. Bu protokol, belirli bir manipülasyonun embriyonik veya larva gelişimi üzerindeki etkilerini tetkiklemek için kriket yumurtalarına reaktif enjekte etme yöntemini tanımlar. Yontucu iğnelerle yumurtaların nasıl toplanıp enjekte edilene ilgili talimatlar açıklanmıştır. Bu nispeten basit teknik esnek tir ve diğer böceklere karşı potansiyel olarak uyarlanabilir. Tek bir deneyde düzinelerce yumurta toplayıp enjekte edilebilen bir kişi, tampon aparatların sağkalım oranları pratikte iyileşir ve %80'e kadar çıkabilir. Bu teknik, farmakolojik ajanların enjeksiyonu, ilgi genlerini ifade etmek için in vitro kapaklı mRNA, RNA girişimini sağlamak için çift iplikli RNA (dsRNA), kümelenmiş düzenli olarak kullanımı gibi çeşitli deneysel yaklaşımları destekleyecektir. genomik modifikasyon için CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) reaktifleri ve geçici veya kararlı transgenik çizgiler oluşturmak için geçirilebilir elementler ile birlikte uzaya kısa palindromik tekrarlar (CRISPR).

Kriket kolayca nemli malzeme içinde yumurta yatıyordu ve nemli kum veya kir gibi yeterli malzeme sağlayan, onları yumurta çok sayıda koymak için neden olur. Bu özellikle kriketlerin ilk olarak 8-10 saat boyunca yumurtlama materyalinden yoksun bırakılması durumunda etkilidir. Bir diseksiyon mikroskobu, bir mikroenjektör ve bir mikromanipülatör (Şekil1A)çeşitli malzemeler (Şekil<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Bu teknik, kriketin embriyonik veya larva gelişimini teşpetmek için tasarlanmış deneyler için temel bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı esnek olması ve RNA girişim veya genomik manipülasyon kullananlar gibi çeşitli deneysel yaklaşımları desteklemesidir. Prosedürü gösteren Hadley Wilson Horch, laboratuvarda baş araştırmacı olacaktır.Bu prosedüre başlamak için damlama su ile beveler iplik öğütücü düzlemi ıslak. Çekilen iğneyi bevene yerleştirin ve 20 derecelik bir açıya çevirin. İğneyi öğütme plakasına değene kadar indirin ve 2-3 dakika yaslayın.Bir cam mikroskop slayt yapıştırılmış olan çift sopa bant üzerine yaslı iğne yerleştirerek bevel değerlendirin. Slaytı, kamera ve görüntü edinme yazılımıyla donatılmış bileşik bir mikroskobun sahnesine yerleştirin. 20x hedefi kullanarak iğne nin görüntüsünü elde edin.İğnenin iç lümen çapını ölçmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Sekiz mikrometreden daha küçük veya 12 mikrometreden daha büyük bir açıklık olan iğneleri atın. İlk olarak, suda% 1 agarose 40 mililitre yapmak ve 10 santimetre Petri kabına dökün.Katılaşmadan önce agarose yüzeyine bir yumurta kuyusu damgası yerleştirin. Agarose katılaştırıladıktan sonra, kuyuları ortaya çıkarmak için damgayı çıkarın. Daha sonra agarose iyi plakayı %1 penisilin streptomisin içeren HBS ile doldurun.Yemeğin kapağını yerleştirin, Parafilm'e sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Bundan sonra, kriket ler için yumurta koymak için bir yumurta toplama çanak yapmak için beyaz oyun kum ile 35 milimetrelik Petri çanak doldurun. Yaklaşık 18 tarafından 18 santimetre kesilmiş bir kağıt havlu kare ile yumurta çanak kapağı.Kağıt havlu ile musluk suyu ile doldurun. Sonra, Petri kabını yatırın ve fazla suyu çıkarmak için üstçe hafifçe sıkın. Çanak altında kağıt havlu kare köşelerini tuck ve yerinde kağıt havlu tutmaya yardımcı olacak bir ters kapak içinde yumurta çanak yerleştirin.Kriket kutusuna yumurta çanak yerleştirin ve yetişkin kadın bir ila iki saat boyunca yumurta oviposit sağlar. Bu arada, agarose çanak enjeksiyon için yumurta tutmak için hazırlık oda sıcaklığına ısınmak için izin verin. Hazır olduğunda, kriket kutusundan taze yumurtlu yumurtluyon içeren yumurta toplama kabını çıkarın.Kağıt havlu çıkarın ve bir beher üzerinde 0,5 ve bir milimetre arasında bir gözenek boyutu ile bir süzgeç yerleştirin. Yavaşça akan musluk suyu altında süzgeç içine yumurtlama çanak içeriğini durulayın. Kriket yumurtaları süzgeç sepetinde kalırken kum taneleri süzgeç örgüsünün içinden aşağıdaki kabın içine düşecektir.Ters ozmoz suyu ile bir kap doldurun ve bir tepsiye yerleştirin. Süzgeci kabın üzerine ters çevirin ve yumurtaları suya çıkarmak için çanağa dokunun. Yumurtalar kabın dibine batar.Daha sonra, çapı yaklaşık üç milimetre lik bir açıklık yapmak için bir P1000 pipet ucu kapalı ucu kesmek için makas kullanın. Bir P1000 pipetter bu ucu yerleştirin ve agarose yumurta kalıpları çanak için konteyner yumurta aktarmak için kullanabilirsiniz. Plastik cımbız kullanarak, agarose kuyularında yumurta sıraya.Her yumurta bir kuyunun dibine batar. Petri kabını enjekte etmeye hazır olana kadar bir kapakla kapatın. Başlamak için, diseksiyon mikroskobu altında yumurta çanak yerleştirin ve yaklaşık 10x düşük büyütme seçin.20 mikrolitre yükleme uçları ve P10 pipetkullanarak 1,5 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi çizin ve yükleme ucunu enjeksiyon iğnesinin geniş ucuna yerleştirin. Enjeksiyon çözeltisini enjeksiyon iğnesine at. İğneyi enjeksiyon gövdesine takın ve sıkın, iğnenin gövdeye düzgün ve sağlam bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.Daha sonra enjeksiyon gövdesini mikromanipülatöre dikkatlice takın, iğneyle kırılmamaya veya yaralanmamaya dikkat edin. Hem yumurtaya hem de iğneye mikroskoptan bakarken, iğneyi çanak ızgaranın sol üst köşesindeki X'e yakın hareket ettirin. Ucu HBS artı penisilin streptomisin kabına tamponlu çözelti girene kadar iğne düşürün.İğneyi görüş alanında ortalayın ve yumurta kabını hareket ettirin, böylece iğne yemeğin kenarına yumurtalardan birkaç milimetre daha yakın dır. Bundan sonra mikroskobu Rhodamine'nin iğnedeki floresangözlemlemesi ve ucuna odaklanması için uygun filtreye ayarlayın. Mikroenjektörde, enjeksiyon çözeltisi iğneden süspansiyon çözeltisine sızmaya başlayana kadar denge topuzlarını saat yönünde yavaşça çevirin.Daha sonra boya sadece iğne dışarı sızıntı durur kadar biraz saat yönünün tersine geri düğmeyi açın. İğne hala görüş alanında ortalanmış ile, iğne ilk enjekte edilecek yumurta hedefleniyor böylece yumurta çanak hareket ettirin. Tek bir yumurta görüş alanının çoğunu dolduracak şekilde büyütmeyi yaklaşık 50x'e ayarlayın.İğneyi enjeksiyon için pozisyona sokmak için hem mikromanipülörü hem de elini yumurta kabında kullanın. İğneyi ilerletmek için mikromanipülörü kullanın ve ucunu enjekte edilecek ilk yumurtaya takın, yumurtanın arka ucundan yumurtanın arka ucundan yumurtanın uzun eksenine doğru 20 ila %30 oranında iğne yi takın. Çözeltiyi enjeksiyon ayak pedalı veya mikroenjektörüzerindeki enjeksiyon düğmesi ile enjekte edin.Yumurtanın içindeki küçük bir floresan madde bolusu başarılı bir enjeksiyona işaret eder. Bundan sonra, yumurtadan iğneyi geri çek. Yumurta, iğnenin geri çekilmesi üzerine istemeden kuyusundan çıkarılırsa, iğneyi geri çekerken yumurtayı kuyuya geri itmek için küçük forsepsler kullanın.Bu çalışmada, kriket yumurtaları, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik kullanılarak enjekte edilmektedir. Hayatta kalma oranı bu deneyin başarısını değerlendirmek için önemli bir parametredir. Yumurtanın içindeki yumurta ve embriyonik doku düzensiz bir şekilde kümelenmeye başladığından ve sonunda sarının çoğu yumurtanın bir tarafına göç ederken, ölü yumurtaların çoğu kolayca görülebiliyor.Dört ila altı gün sonra değerlendirildiğinde, enjekte edilmemiş yumurtaların %85'inden fazlası hayatta kalırken, deneysel reaktiflerle enjekte edilen yumurtaların sağkalım oranı genellikle daha düşüktü. İğne delinmesi, boya ve tampon un piyasaya sürülmesi veya aracın varlığı veya çift iplikli RNA'nın bulunması da dahil olmak üzere enjeksiyonun tüm yönlerini kontrol etmek, deneysel manipülasyon girişiminin gerçek etkilerini anlamak için gereklidir. Enjeksiyonun phenotipik sonuçlarını değerlendirme şekli, enjekte edilene bağlıdır.Örneğin, belirli mRNA knockdowns bir sonucu olarak henotik değişiklikler brüt anatomi düzeyinde belirgin olabilir. Öte yandan bir EGFP kodlayan bir cDNA bir G.bimaculatus actin organizatörü kontrolü altında histon 2B geni etiketli piggyback transposase kullanarak kriket genomuna yerleştirilir, egfp etiketli hist 2B protein heyecanlandırmak için floresan kullanarak yumurta her çekirdek görselleştirmek mümkün olur. İğnelerin tıkanmamalarını sağlamak bu işlemde kritik bir adımdır.Sarısı bazen iğne ucunu tıkadığı için sonraki enjeksiyonlardan sonra birkaç ayarlama yapmanız gerekebilir. Kriket, Drosophila gibi iyi çalışılmış holometabolöz böceklere bazal olarak dallayan hemimetabolöz bir böcektir. Kriket gelişimi üzerinde çalışmak, hayvanlar alemindeki evrim ve gelişim hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olacaktır.Bu teknik bazı pratik alır. Enjeksiyondan 4-5 gün sonra sağkalım oranı en az %80 olana kadar kontrol enjeksiyonları uygulamanızı öneririz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Medaka Yumurta kullanma Gümüş Nanocolloids tuzluluk bağımlı zehirlilik Deneyi

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

Burada: Ovo Ticari Broiler Yumurtalarının Beslenmesi: Kas Gelişimini ve Büyümesini Etkilemek İçin Doğru ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...