Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

المؤلفون ممتنون جدا للمساعدة التقنية الخبراء من قبل أنابيلا بيتل وتطوير الأسلوب التجريبي من قبل هايمو بيرشر.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه ولا يعلنون عنه عن أي مصالح مالية متنافسة. H. G. هو CEOCSO في MoleculeCrafting.HuGs e.U. وقدمت acylpyruvates لهذه الدراسة عن طريق توليف مخصص. تم دعم العمل في مختبر P. J. D. من قبل الصندوق العلمي النمساوي (FWF): رقم المشروع P 31582-B26. وقد تم تغطية رسوم النشر لهذه المخطوطة جزئياً من قبل الصندوق العلمي النمساوي تحت رقم المشروع P 31582-B26. أ. ن. و ب. ر. يدعمها صندوق العلوم النمساوي في إطار المشروع P28395-B26.

وfumarylacetoacetate hydrolase (FAH)1,2 عائلة فائقة من الإنزيمات يصف مجموعة من الإنزيمات التي تشترك في الحفاظ على نطاق حفية الحفازة 3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10. على الرغم من مركزها الحفاز المشترك، هذه الإنزيمات متعددة الوظائف، وتوجد معظمها في prokaryotes، حيث يتم استخدامها لكسر المركبات المستخرجة من مصادر الكربون المعقدة3. تم التعرف على ثلاثة أفراد فقط من هذه العائلة في eukaryotes حتى الآن: الاسم الذي يعطي FAH2،وكذلك البروتين الذي يحتوي على نطاق FAH 1 (FAHD1)11,12,13,14 15 والبروتين المحتوي على النطاق 2 من فاه (فهد 2). وقد ارتبط استنفاد FAHD1 مع ضعف التنفس الميتوكوندريا13،16 والمرتبطة بنوع قابل للعكس من النمط الظاهري الشيخوخة الخلوية14 التي ترتبط المحتملة المتوسطة أوجه القصور في نظام نقل الإلكترون. وقد أصبحت المتغيرات القابلة للدواء التي يمكن أن تكون ذات أهمية كبيرة هي HUMAN FAHD1 وتقويمها في الأنظمة النموذجية (الماوس، الخيطية، خطوط الخلايا السرطانية، النباتات، إلخ)، فضلاً عن متغيرات الطفرة التي تم اختيارها. لهذا البحث، البروتين المؤتلف في مستويات عالية من النقاء، فضلا عن معلومات عن الآليات الحفازة الموجهة من قبل هياكل الكريستال والأجسام المضادة الانتقائية أمر حيوي.
تصف هذه المخطوطة طرق التعبير عن بروتين فهد في القولونية،والكروماتوغرافيا التقاربية، والكروماتوغرافيا التبادلية للأيونات، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، والترشيح الجل إعدادي والتحليلي، والتبلور، وانعف الأشعة السينية، و الاختبارات الضوئية. الغرض من الأساليب والبروتوكولات المذكورة هنا هو توفير التوجيه للعلماء العاملين في مجالات متنوعة مثل علم الجراثيم والبيولوجيا النباتية، فضلا عن الدراسات الحيوانية والبشرية، لتمييز أعضاء الأسرة الكبرى من أجل الصحة، بما في ذلك يجب أن تصبح ذات الصلة في مجال معين. البروتوكولات المذكورة هنا قد توفر دعما قيما للمشاريع التي تهدف إلى توصيف أفراد الأسرة الفائقة الأخرى prokaryotic أو eukaryotic FAH.
الأساس المنطقي وراء الأساليب الموصوفة هنا هو حقيقة أنه لوصف البروتينات سيئة الوصف (على وجه الخصوص، الإنزيمات الأيضية غير معروفة الأهمية الفسيولوجية)، والنهج للبدء مع البروتينات المؤتلفة النقية يسمح لل تطوير أدوات بحثية لا تقدر بثمن وعالية الجودة مثل مستحضرات الإنزيم النشطة في المختبر، والأجسام المضادة عالية الجودة، ومثبطات دوائية قوية ومحددة للإنزيمات المختارة. الطرق الموصوفة تتطلب بروتين سريع السائل الكروماتوغرافيا (FPLC) وأشعة إكس البلورات. ويمكن العثور على طرق بديلة (مثل التعبير عن البروتين دون الاستقراء الكيميائي، أو لعرض تنقية البروتين عن طريق التنقية بعد المعالجة الحرارية تليها إزالة الملحة والكروماتوغرافيا استبعاد حجم)، في مكان آخر17. في حين أن مجموعة أوسع من الأساليب المتاحة للتعبير وتنقية من الإنزيمات الأسرة الفائقة فاه2,7,9,17,18, هذا العمل يركز على التعبير و تنقية بروتينات فهد على وجه الخصوص.
في قسم المناقشة من هذه المخطوطة، تم وصف الآليات الحفازة المحددة لبروتين FAHD1 (هيدرولاز، ديكاربوكسيلاس)15 بمزيد من التفصيل، من أجل إظهار الطابع الكيميائي للتفاعلات المحفزة. البيانات التي تم الحصول عليها استنادا إلى العمل السابق7،15،18 (PDB: 6FOG، PDB: 6FOH) يعني نشاط ثالث من الإنزيم كما الكيتو ايزول إيزوماراز.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

البروتينات التي تحتوي على حقول هيدرولاز (فهد) هي من أفراد الأسرة الفائقة التابعة لـ FAH في الإيكريوتيات. تعرض إنزيمات هذه العائلة الفائقة بشكل عام وظائف متعددة، تتضمن بشكل رئيسي آليات هيدرولاز وديكاربوكسيلاس. يعرض هذا المقال سلسلة من الطرق المتتالية للتعبير عن بروتينات فهد وتنقيتها، وأساساً ببروتين فهد 1 (فهد 1) تقويم العظام بين الأنواع (الإنسان، الفأر، الديدان الخيطية، النباتات، إلخ). والأساليب المغطاة هي تعبير البروتين في E. coli، والكروماتوغرافيا التقارب ، والكروماتوغرافيا التبادل الأيون ، والترشيح جل إعدادي والتحليلي ، تبلور ، وانعراج الأشعة السينية ، واختبارات قياس ضوئي. بروتين مركز عالي النقاء (98٪ قد تستخدم لبلورة أو إنتاج الأجسام المضادة. البروتينات ذات الجودة المماثلة أو الأقل قد تستخدم في اختبارات الإنزيم أو تستخدم كمستضدات في أنظمة الكشف (غرب-Blot، ELISA). في مناقشة هذا العمل، تم تحديد آليات الأنزيمية من FAHD1 لوصف هيدرولاز وdecarboxylase ثنائية الأداء في مزيد من التفاصيل.

بدءا من ناقلات الاستنساخ المعدة واشترى BL21 (DE3) plysS E. القولونية، يتم إدراج البلازميد في البكتيريا عن طريق صدمة الحرارة أو أي طريقة بديلة مناسبة (الشكل1). بعد فترة قصيرة من التضخيم، يتم طلاء البكتيريا المحولة على لوحات أجار LB، من أجل النمو بين عشية وضحاها. قد تبدو اللوحات في هذه المرحلة مختلفة، اعتماداً على مجموعة متنوعة من مصادر الخطأ المحتملة. قد تكون الأطباق فارغة (أي لا مستعمرات)، متضخمة تماما من البكتيريا، أو شيء في ما بين، على التوالي. ويصور الشكل 7 ألفمثالين للوحات الغار LB بعد التحويل الأمثل وغير الأمثل. تشير المستعمرات البكتيرية كثيرة جدا ً إما إلى أن الكثير من البكتيريا كانت مطلية (على الأرجح) أو أن المضادات الحيوية التي تستخدم قد تنتهي صلاحيتها (على الأرجح). عدد قليل جدا من المستعمرات البكتيرية قد تشير إلى أنه إما لم يكن يستخدم ما يكفي من البلازميد للتحول (استخدام أكثر في المرة القادمة) أو أن الكثير من المضادات الحيوية استخدمت لتحديد البكتيريا. على أي حال، إذا كانت المستعمرات موجودة، ينبغي أن تكون على ما يرام، واستخدام اثنين من المضادات الحيوية الانتقائية يعني فرصة ضئيلة إلى حد ما من البكتيريا غير المحولة في النمو. ومع ذلك، لا توجد مستعمرات على الإطلاق، تشير إلى أن البكتيريا فقدت كفاءتها التحول (بسبب التخزين الخاطئ أو التخزين على مدى فترات أطول، والتجميد المتكرر والذوبان، وما إلى ذلك)، لم تكن صدمة الحرارة ناجحة (لا امتصاص البلازميد أو البكتيرية الموت عن طريق حرارة أكثر من اللازم)، وتلف ناقلات الاستنساخ، أو عن طريق الخطأ تم استخدام مجموعة خاطئة من المضادات الحيوية الانتقائية (تحقق من الجين المقاومة على ناقلات البلازميد).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> الشكل 7 نتائج تمثيلية لتحويل البكتيريا وIMAC. (أ) لوحات أجار LB تمثيلية مع BL21(DE3) E. coli، التي تم الحصول عليها عن طريق اتباع الخطوة 1.1 للبروتوكول. يسار: لوحة مع جيّدا يوزّع مستعمرات (مثال إيجابيّة). يمين: لوحة بمستعمرة واحدة فقط (مثال سلبي). الدوائر البيضاء علامة المستعمرات جيدة. الدائرة الحمراء علامات المستعمرات التي تنمو قريبة جدا من بعضها البعض، وينبغي عدم انتقاؤها طالما المستعمرات المعزولة متوفرة. (ب) تحليل 12.5٪ من الأكريلاميد SDS-PAGE لسلسلة من الضوابط التعريفي ("-" يشير قبل التعريفي IPTG؛ "+" يشير بعد الحث IPTG، قبل حصاد بيليه)، وتعديلها لكميات متساوية من البروتين الكلي. يتم وصف هذا في الخطوة 1.2. (ج) تحليل مثالي 12.5٪ أكريلاميد SDS-PAGE من تنقية ني-NTA من له- الموسومة FAHD1 البروتين. ويرد هذا في القسم 3 من البروتوكول. ينتج اللونيّة تقارب بروتين من عال نقاوة ([>]70%, سهم سوداء), مهما, عدّة تلوثات صغيرة أيضا لاحظت (سهام حمراء). وتتألف هذه الملوثات من بروتينات غير من نوع فهد ترتبط بالعمود، ومن بروتينات ترتبط ببروتين فهد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتم اختيار المستعمرات المصادق عليها وانتقاءها. بعد التضخيم في المتوسط المغذي، يتم تشغيل التعبير البروتين عن طريق تطبيق IPTG الكيميائية. يتم حصاد بيليه البكتيرية التي تحتوي على البروتين الذي تم التعبير عنه بكميات مليغرام، ويتم التحقق من التعبير عن طريق SDS-PAGE (انظر على سبيل المثال الشكل 7B). قد تحدث بعض المشاكل أثناء هذه العملية بسيطة خلاف ذلك. أولا، بعض البروتينات تشكل هيئات الشمول، لأنها تتداخل على ما يبدو بطريقة أو بأخرى مع الأيض الطبيعي للبكتيريا المضيفة. وقد لوحظ ذلك بالنسبة لبعض الطفرات في الإنسان فهد 1 وفهد 2. في مثل هذه الحالات ، قد تكون أنظمة التعبير الأخرى مثل خلايا الحشرات أكثر ملاءمة وينبغي النظر فيها. بعد حصاد بيليه من خلايا الحشرات ، على سبيل المثال ، يتبع تنقية البروتينات نفس الخطوات كما هو موضح في هذا البروتوكول. ثانياً، يُوجد في بعض الأحيان أن نظام DE3-pET "مُسَحَّب" (أي أن البروتين يُعبر عنه بالفعل إلى حد ما قبل الحث على الـ IPTG). السبب المحتمل لذلك ليس مفهوما جيدا، ولكن قد يساعد على التعبير عن البروتين ببطء بين عشية وضحاها في حاضنة غرفة باردة. ثالثاً، لا يتم التعبير عن أي بروتين. هذا هو على الأرجح السيناريو أسوأ الحالات، كما أنه يشير على الأرجح إلى متجه بلازميد تالف، وبالتالي من المستحسن لتسلسل البلازميد.
إذا كان له-tag تم استخدامها لوضع علامة على البروتين، والكروماتوغرافيا التقارب مع ني-NTA أغاروز هو وسيلة سهلة ورخيصة التقاط القضاء على معظم التلوث (الشكل 7C). وتوجد أساليب مماثلة لأنظمة الوسم الأخرى (مثل STREP-II). إذا لم يتم استخدام أي علامة، مزيج من هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم والتوالي chromatography تبادل هيدروفوبيك قد أيضا فصل البروتين من غالبية البروتينات الأخرى (الشكل8A). ومع ذلك، مقارنة طريقتين (الشكل7C مقابل الشكل 8A)،يمكن أن تظهر تفوق أساليب ني-NTA عن طريق تحليل SDS-PAGE. ولذلك ينصح باستخدام البروتين له الموسومة. 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> الشكل 8 نتائج تمثيلية لتجارب FPLC (HIC, تبادل الأيون, لجنة الأوراق المالية والبورصة). (أ) تحليل نموذجي للكروماتوغرام و12.5 في المائة من الأكريلاميد SDS-PAGE لتحليل الكروماتوغرافيا HIC-phenylبعد هطول الترسيبات من بروتين فهد 1 غير الموسوم بعلامات الصوديوم (AS) من كبريتات الأمونيوم، كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول. يعكس الخط الأخضر تدرج المخزن المؤقت B الذي لا يحتوي على AS. خلال عملية يتم غسلها تدريجيا من النظام. مقارنة هذه اللوحة إلى الشكل 7C يعرض قوة لونية تقارب ني-NTA مقارنة مع طريقة HIC-فينيل، وميزة استخدام له-tag نظام لتنقية البروتين. (ب) تحليل نموذجي للكروماتوغرام و12.5% من مادة الأكريلاميد SDS-PAGE للكروماتوغرافيا التبادلية الموجبة لـ"فهد" بعد تنقية Ni-NTA. باستخدام تدرج الملح، يتم فصل العينة المطبقة إلى بروتينات فردية. (ج) تحليل نموذجي للكروماتوغرام و12.5% من مادة الأكريلاميد SDS-PAGE لـ G75 من الكروماتوغرافيا التي تحمل علامة "فهد" بعد أن قام بتمييز اللوني في التبادل الموجبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وعلى التوالي، يفصل البروتين أكثر من بقايا التلوث بواسطة chromatography تبادل الموجبة /anion (على سبيل المثال، انظر الشكل 8B)،تليها الكروماتوغرافيا الحجم والاستبعاد (على سبيل المثال، انظر الشكل 8C). وينصح بإعداد استراتيجية تنقية أولية بهذا الترتيب؛ ومع ذلك، يجب أن تستخدم هذه الأعمدة في تركيبة، في وقت لاحق وفي الاختلاف، حتى البروتين هو نقي بما فيه الكفاية.
يمكن إجراء فحوصات بسيطة للنشاط، من أجل اختبار قرارات "نعم أو لا" بشأن الركائز النشطة و/أو العوامل المساعدة، مع بروتيناته الموسومة بعد تنقية Ni-NTA، أو البروتينات غير الموسومة بعد عمود التبادل الأيوني. يجب تحديد الأنشطة المحددة والثوابت الحركية مع البروتين من أعلى نقاء. قد تكون محاولة التبلور مع البروتينات بعد العمود تبادل الأيونية، ولكن نوعية بلورات يرتبط دائما تقريبا مع نقاء البروتين. يمكن رفع الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد البروتينات في أي مرحلة من بروتوكول تنقية; ومع ذلك، هنا ترتبط أيضا نوعية مع نقاء البروتين.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

التعبير وتنقية البروتينات التي تحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetatee مع أمثلة (التعبير في E. القولونية، FPLC). وتستخدم البروتينات النقية لإنتاج التبلور والأجسام المضادة وتستخدم في اختبارات الإنزيم. يتم تقديم اختبارات ضوئية مختارة لعرض وظائف متعددة من FAHD1 كما ديكاربوكسيلاز أوكسالوأسيتات وأسيلففات هيدرولاز.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

يصف البروتوكول لدينا طرق التعبير الفعال وتنقية مجال FAH الذي يحتوي على البروتينات ولكن أيضًا البروتينات بشكل عام. FHD البروتين-1 يلعب دورا تنظيميا في دورة TCA واستقلاب الطاقة من الميتوكوندريا. كنا قادرين على ربط FHD-1 downregulation إلى الشيخوخة الخلوية ومعلومات عن نشاط الانزيم وهيكل البروتين مطلوبة بشكل عام من أجل فهم الآليات الجزيئية وراء الأنماط الظاهرية الملاحظة.والميزة الرئيسية للتعبير عن البروتينات عبر أنظمة ناقلات IPTG غير قابلة للانحلال هي أن جميع الطرق رخيصة نسبيًا وسهلة التركيب في أي مختبر. باستخدام بروتينات من نوع الهستيدين المتعددة بالاقتران مع راتنجات النيكل NTA agarose، يمكن استخدام الانتقائية الهائلة لخرونية التقارب بتكلفة منخفضة. لمعظم الأغراض، قد البروتين التي تم الحصول عليها في هذه النوعية بالفعل كافية.FPLC على اليد الأخرى، هو أسلوب راسخ وعامة مع العديد من المزايا مقارنة مع أساليب أخرى. أولاً، أدخل خمسة إلى 10 نانوجرامات من البلازميد إلى 100 ميكرولترات من بكتيريا BL21-DE3 pLyss E.coli المختصة على الجليد. اضغط قليلا على الأنبوب من أجل خلط المحتويات.إبقاء البكتيريا على الجليد لمدة 30 دقيقة، والنقر بلطف الأنبوب كل بضع دقائق. سخني شاكراً حرارياً إلى 42 درجة مئوية. وضع أنبوب يحتوي على البكتيريا في الجهاز والحرارة لمدة 90 ثانية.ثم، ضع الأنبوب على الجليد على الفور. بعد خمس إلى 10 دقائق على الجليد، إضافة 600 ميكرولترات من المتوسط NZCYM ووضع الأنبوب في حاضنة البكتيريا. يهز أنبوب في سرعة متوسطة المنحى على طول اتجاه اهتزاز في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة، لوحة 200 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية على 10 سم LB agar لوحة تحتوي على المضادات الحيوية اختيار الاختيار. ثقافة البكتيريا على لوحة أجار LB في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد تكوين مستعمرة ناجحة، واختيار مستعمرة واحدة وتفريقه في خمسة ملليلتر من NZCYM مع المضادات الحيوية المختارة.الثقافة في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد النمو البكتيري الناجح ، تضخيم البكتيريا في 250 ملليلتر ، 500 ملليلتر أو دفعات لتر واحد من المتوسطة اعتمادا على الطلب على كمية البروتين. ثم، ثقافة البكتيريا، في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.بعد الحضانة، رسم عينة للتحليل الضوئي. إذا كانت الكثافة البصرية في 600 نانومتر قد وصلت إلى 0.4، وتطبيق 200 ميكرومولر تصل إلى ملليمتر واحد من ايزوبروبيل-بيتا-D-thiogalactopyranosid. بعد ثلاث إلى خمس ساعات أخرى في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية من التعبير البروتين استنفدت.حصاد بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 5،000 مرات G لمدة خمس دقائق. ثم، والتخلص من افرط وتجميد بيليه في ناقص 20 درجة مئوية لتخزين وجيزة. لكل 250 ملليلتر من التعليق البكتيري الأصلي، وتطبيق خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المحدد إلى بيليه البكتيرية.إضافة 10 ميكرولترات من بيتا ميركابتوتانول لكل خمسة ملليلتر من العازلة التطبيقية. استخدام 10 ملليلتر باستور pipet لفرض ميكانيكيا بيليه في التعليق عن طريق الخدش و pipetting. نقل كل من تعليق أنبوب 50 ملليلتر.ثم سونيكات التعليق. بعد ذلك، جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة بسرعة عالية في أربع درجات مئوية. تصفية supernatant على التوالي مع وحدات التصفية على الجليد.إعداد عمود من البلاستيك أو الزجاج فارغة عن طريق إرفاقه إلى التجنيب مستقرة وغسل مع النيكل NTA تشغيل العازلة. لكل 10 ملليلتر من تعليق البروتين تطبيق 500 ميكرولترات من النيكل NTA agarose الطين إلى العمود. ملء العمود تماما مع النيكل NTA تشغيل العازلة ضمان عدم تعطيل راتنج agarose والسماح للمخزن المؤقت لتشغيل من خلال الجاذبية.بعد ذلك، تطبيق تعليق البروتين على العمود والسماح للعينة لتشغيل من خلال الجاذبية. بعد أن مرت العينة من خلال، تعبئة العمود مع النيكل NTA تشغيل المخزن المؤقت. وضع cuvette الأشعة فوق البنفسجية شفافة تحت العمود وجمع ملليلتر واحد من النيكل NTA العازلة elution.تحقق من الكثافة البصرية للعينة عند 280 نانومتر مقابل عينة فارغة. على النحو الأمثل، يعرض العينة كثافة بصرية أكبر من 2.5. منذ البروتينات والنيكل NTA العازلة elution سوف تترسب عند تجميد وذوبان الجليد، dialyze البروتين ضد عازلة مختلفة بين عشية وضحاها على الجليد باستخدام ميكرولتر واحد من DTT لكل 100 ملليلتر من عازلة غسيل الكلى.قم بإعداد نظام FPLC وغسل العمود بخمسة أعمدة من 20٪ إيثانول متبوعة بخمسة مجلدات أعمدة من الماء. بعد اكويفيرتينغ العمود، تطبيق نموذج dialyzed على العمود وجمع تدفق من خلال. إعداد elution تدرج.بعد انتهاء التدرج، قم بتشغيل مع المخزن المؤقت الملح العالي حتى يتم الكشف عن المزيد من القمم عبر نطاق وحدة تخزين عمود واحد. بدء قارئ لوحة صغيرة وتككيل لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية. إعداد ملليلتر واحد من محلول 20 ملليمولار من الركيزة ليتم اختبارها في إنزيم تحليل مؤقت.وفقا لمخطط الأنابيب في بروتوكول النص، وإعداد إنزيم فارغة وعينة الآبار عن طريق الأنابيب 90 ميكرولترات من إنزيم المخزن المؤقت في الآبار مع خمسة ميكرولترات من محلول انزيم. ثم إعداد الركازة فارغة وعينة الآبار عن طريق الأنابيب 95 ميكرولترات من إنزيم المخزن المؤقت في الآبار. الحق قبل القياس، وتطبيق خمسة ميكرولترات من إنزيم المخزن المؤقت لمخزن الآبار الفارغة الستة.تطبيق خمسة ميكرولترات من محلول الركيزة 20 ملليمولار على آبار العينة. استخدام الأنابيب متعددة القنوات في 50 microliter الإعداد لخلط بلطف الآبار. ثم، أدخل اللوحة في قارئ اللوحة الدقيقة وقم بقياس كل بئر في 255 نانومتر.وأخيراً، قم بإجراء التحليل في جدول بيانات. يتم تصوير مثالين لوحات LB agar بعد التحول الأمثل وغير الأمثل هنا. تشير العديد من المستعمرات البكتيرية إما إلى أن اثنين من البكتيريا كانت مطلية أو أن المضادات الحيوية قد تكون منتهية الصلاحية.قد تشير بعض المستعمرات البكتيرية إلى أنه إما لم يتم استخدام ما يكفي من البلازميد للتحول أو أن الكثير من المضادات الحيوية استخدمت لتحديد البكتيريا. يتم حصاد الكريه البكتيرية التي تحتوي على البروتين المعبّر عنه بكميات مليغرام ويتم التحقق من التعبير عبر صفحة SDS. قد تحدث بعض المشاكل أثناء هذه العملية البسيطة، بما في ذلك البروتينات التي تشكل أجساماً شاملة أو البروتين الذي لا يتم التعبير عنه.إذا تم استخدام العلامة له للإشارة إلى البروتين، اللونية تقارب مع النيكل NTA agarose هو وسيلة سهلة ورخيصة التقاط القضاء على غالبية الملوثات. إذا لم يتم استخدام علامة، قد مزيج من ترسيب كبريتات الأمونيوم والكروماتوغرافيا التبادلية المائية على التوالي فصل البروتين عن غالبية البروتينات الأخرى. ويفصل البروتين كذلك من بقايا التلوث عن طريق اللوني التبادل الأيوني تليها الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم للحصول على بروتين نقي بما فيه الكفاية.ولا توجد أي من الطرق الموصوفة من الصعب على وجه الخصوص. ولكن جميع الأساليب تتطلب التدريب. قد تفشل المحاولات الأولى ولكن التجارب ستنجح بعد بعض التعديلات الإضافية.جميع الأساليب المعروضة هنا هي طرق عامة لتنقية البروتين. على الرغم من تخصصه في بروتينات فهد، فقد يتم تكييف البروتوكول مع أي بروتين يرغب في تنقيته. تم الحصول على الإنسان المؤتلف فهد-1 من خلال الطرق الموصوفة والهياكل عالية الدقة الأشعة السينية ساهمت بشكل كبير في فهمنا لـ FAHD-1 من خلال وظيفة تعمل على حد سواء، decarboxylase وهيدرولاز.البكتيريا المستخدمة في هذا العمل هي سلالات السلامة وغير الخطرة. وتنطبق أدلة السلامة العامة على جميع المواد الكيميائية وينبغي معالجة أعمدة FPLC بعناية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل<em&gt; العصوية</em&gt; -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

التعبير البكتيري وتنقية ميتالوبروتيناز المصفوفة البشرية -3 باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...