Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
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作者非常感谢安纳贝拉·皮特尔的专家技术援助和海莫·皮尔彻的试验方法开发。

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作者没有什么可透露的,也没有宣布任何相互竞争的经济利益。H.G. 是分子工艺的CEOCSO.HuGs e.U.,并通过定制合成为本研究提供丙草酸盐。P.J.D.实验室的工作得到了奥地利科学基金(FWF)的支持:项目编号P 31582-B26。奥地利科学基金(FWF)在项目编号P 31582-B26下部分支付了该手稿的出版费。A. N. 和 B. R. 由奥地利科学基金(FWF)在P28395-B26项目下提供支持。

关键步骤
FAHD蛋白质对盐浓度非常敏感。在低NaCl浓度下,蛋白质在解冻时可能沉淀,但它们通常可以在较高的盐浓度下完全重组。也就是说,如果FAHD蛋白由于某种原因沉淀,它可能会恢复或重新折叠与较高的盐浓度(>300 μM)。然而,一些更多的疏水性蛋白质可能无法回收(例如,人类FAHD2),但洗涤剂如CHAPS(最大1%)或甘油 (10%)可用于将它们保存在稳定的溶液中。在任何情况下,建议使用液氮进行冲击冻结,并在-80°C下储存,因为它是一个温和而缓慢的解冻过程。
步骤 3.1.10 中的 Ni-NTA 纯化过程中可能会出现一些意外问题。值得注意的是,第二个采集的样品中比第一个样品的OD值高,表明甘油树脂的体积过高(注意一下,在下一个实验中使用更少的树脂)。此外,甘蔗树脂本身导致280nm的OD信号(即,对甘蔗树脂床的中断将发出人工信号)。如有疑问,建议使用其他方法,如布拉德福德或BSA测定来确定蛋白质浓度。
在酶测定中,需要考虑三个关键方面。首先,评估蛋白质浓度对于获得正确的特定活性至关重要。蛋白质的纯度水平正在影响结果,需要估计。在标记蛋白的情况下,必须计算标记部分的质量,并且必须相应地更正特定活动。对于协议第7节所述的简单检测,Ni-NTA纯度足以区分活性基基和非活性基质、辅助因子等。对于更复杂的Michaelis-Menten动力学,必须正确确定所有反应物和基板浓度。特别是在使用牛乙酸酯(随着时间的推移自动脱氧)时,反应的酶部分必须纠正为自动脱氧(假设两种反应同时发生)。必须考虑光密度信号的初始变化,这些信号是基板的酮-enol tautoininin。第三,必须调整浓度和体积。具有确定浓度的酶和基质的反应可能给出不同的结果,取决于测定量。如果每口井有太多的酶,液体的粘附实际上可能会偏袒结果。
为了评估Michaelis-Menten动力学,建议在100μL、200μL和300μL批次中进行初始实验,以找到最佳组合。类似的方面也适用于动力学测定的酶基质浓度的比例。每个基质的酶过多或每个酶的基板过多,使系统超出线性稳态 Michaelis 范围。需要进行初步实验以优化这些条件。第 8 节提供了人类 FAHD1(野生型)蛋白质的示范性调整,从而产生动力学图(如图5B所示)。
对于结晶,蛋白质溶液滴在盖玻片的中心移液,并与结晶鸡尾酒滴混合,通常由缓冲液(例如,Tris-HCl,HEPES)和沉淀物(例如聚乙烯乙二醇、铵)组成硫酸盐)。可选择应用用于共结晶的抑制剂溶液滴(如本协议中的草酸盐)。然后,盖玻片倒置在含有结晶鸡尾酒的储层井上方,在密封油的帮助下密封井气(图6B)。理想情况下,在实验开始时的落差中不会发生沉淀,这意味着蛋白质仍然存在于溶液中。由于储层中的沉淀浓度高于下降,下降开始通过蒸发到井内,直到达到与储层的平衡。水扩散到储层中会导致下降量缓慢下降,进而导致下降中蛋白质和沉淀浓度的增加。如果蛋白质溶液达到所需的超饱和状态,从而达到元稳定性,则会发生自发成核,随后是晶体生长。达到超饱和状态是结晶的必要条件,但不是充分条件。蛋白质的结晶既需要有利的热力学和动力学条件,又在很大程度上取决于要结晶的蛋白质的不可预知特性。
修改和故障排除
大肠杆菌中蛋白质的表达可能效率低下。不同的IPTG浓度、表达温度和扩增时间(如室温几个小时或在冷室过夜)可能需要针对每种新蛋白质进行测试,以找到最佳条件。有时观察到含有体中蛋白质的沉淀,以产生疏水性强的FAHD蛋白。在这种情况下,建议在昆虫细胞等其他模型系统中表达蛋白质,因为包含体不太可能形成26。
由于 FAHD 蛋白质对盐和副因子浓度以及 pH 敏感,因此不同同源体、正交和点突变变异的纯化策略在单个环境中可能有所不同。为野生型人和小鼠FAHD1蛋白开发了所述纯化方法。化学物质的浓度,如NaCl和imidazole,以及pH值,可能必须适应具有不同等电点(pI)的单个蛋白质。还值得注意的是,并不是每个他标记的蛋白质都能很好地与Ni-NTA树脂结合。如果与Ni-NTA柱结合的蛋白质效率不高,则适应的NaCl和imidazole浓度,以及Ni-NTA运行缓冲液中不同的pH条件可能有助于提高结果的质量。如果不是,跳过Ni-NTA步骤,继续离子交换色谱步骤,也可能导致成功的纯化策略。如果蛋白质与Ni-NTA列结合,但不能从该柱中洗脱,添加一些mM EDTA可能有助于破坏Ni2+复合物。
关于结晶过程,需要理解的是,将大而复杂的蛋白质分子自组织成一个定期的周期性晶格是一个固有的不可能的过程,它严重依赖难以控制的动力学参数。即使用于结晶的设置的微小变化也会显著地改变结果,并且不会形成晶体。蛋白质纯度通常至关重要。根据经验,严重超载的SDS-PAGE凝胶不应显示其他带。此外,执行步骤的顺序可能会影响结果。例如,为了确保可重复性,通常需要保持移液序列不变,然后首先添加蛋白质,最后向结晶液滴添加沉淀物(反之亦然)。无论使用哪种方法,在尝试复制或放大实验时,都应保持不变。如果按照此协议未观察到晶体,则化学沉淀成分、pH 值、滴大小和蛋白质与沉淀比可以以较小的增量变化。耐心和对滴的一贯观察是美德。
对FAHD1催化机制的讲话
所介绍的方法是专门为获得高质量的FAHD1蛋白而开发的。这促进了FAHD1晶体的生长,以及含有FAHD1复合物的晶体的工程(草酸盐,PDB:6FOG)。X射线结构提供酶催化腔的3D结构。这些结果建立了对残留物的全面描述,对于这种有趣的酶的催化机制可能很重要。FAHD1首先被描述为能够切化丙烯酸(乙酰丙酮酸盐,紫霉素)11。后来,发现FAHD1还作为甲氧乙酸酯12的脱血酶。虽然基质丙烯酰胺和牛沙乙酸酯是不同的化学基质,但化学转化在机械上共享了共同单C 3-C4键的战略裂解,如果C 3,则大力促进-C4键轨道保持正交到C2-碳基15的+轨道。这种构象允许在裂解过程中瞬时形成的C3-卡巴尼的共振稳定。FAHD1基质(乙酸乙酯和丙烯酸盐)是柔性分子,可能存在于陶土(酮-醇)和C2-水合形式(图9A)。不同物种之间的平衡主要取决于使用的缓冲成分的性质、pH值和金属离子的存在。下面我们将讨论从X射线晶体结构分析中激发的假设力学情景,这些分析揭示了FAHD1的催化中心。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2.jpg"> 图 9:关于人类FAHD1的拟议催化机制的详情。 (A)氧化乙酸酯存在于晶体状态以及中性溶液中,主要存在于Z-enol形式24中。然而,在生理pH条件下,2-酮形式是主要表示25。(B) hFAHD1腔15的化学草图,含有Mg约束的甲氧乙酸酯(左)和丙烯酰胺(右,R1为有机休息;红色箭头表示相邻稳定水分子的核攻击)(见讨论)。(C) FAHD1的C 3-C4裂解(b至c)和氢酶(b'至c)机制的有利符合物的比较:这两种过程都会产生Mg复合丙酸酯(见讨论)。中间体 b 和 b' 预计将在 Q109 前稳定下来,如小组 B 中所勾画的(参见讨论)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
FAHD1的脱卡苯酶活性
奥萨洛乙酸盐存在于晶体状态以及中性溶液中,主要存在于Z-enol形式24中。 但研究表明,在生理pH条件(缓冲区条件在pH7.4)中,2-酮形式是牛乙酸酯25(图9A)的主要表现,而脱脂不是脱脂性的先决条件27.值得注意的是,Mg2+离子对pH值为7.4或低于28的甲氧乙酸酯物种的比例没有影响。 将牛油酸酮形式转置到FAHD1的催化中心(由复合酶中的结合草酸盐(PDB:6FOG15)引导)显示残留Q109作为界形甲酸酯15的构象调节器。如另一条第15条所述,氢键与Q109的卡巴莫基组结合稳定了围绕C2-C3键旋转产生的氧化乙酸-构象(图9B,左侧面板)。由于这种旋转,C 3-C4键(待切)采用相对于 C 2-碳基的 α-轨道的接近正交处理(图9C)。二氧化碳可以释放。这个过程的主要产物是共振稳定,是丙酮的Mg-enolate。据了解,从牛乙酸酯-Mg复合物的调查,乙酸酯形成最稳定的复合物28,29。假设Mg-pyruv酸酯-亚洛感复合物具有可比稳定性,FAHD1的副因子可以被阻断,但碱残留物K123可以在平衡中质子中使丙酸酯-eno酸,以禁止失去副因子15。
给出的解释表明,在FAHD1的催化ODx函数中,苯丙胺作为一种独特的中间体。在假设模型中的此步骤中,实验数据没有进一步说明为什么关闭的盖子应该打开以释放产品。然而,可以推断出,拟议的机制看起来像一种酶抑制产品:晶体结构揭示了一个保存的水分子保持方向向FAHD1催化中心由残留H30和E33呈现在短螺旋15,这是诱导在配体结合和盖关闭。如果原发性烯醇与酯酸盐保持平衡,则谐振稳定化的enolate可以被水分子淬火以灭酸。由此产生的羟基将能够取代丙酮酸盐从Mg-cofactor上盖子将打开。最后,催化中心将在线粒体环境中恢复。在这个假设场景中,腔水分子将分别作为酸运行。
FAHD1的氢酶活性
一种酶的氢酶活性隐含地要求羟基核亲基的中期形成。这种机制通常与酸碱催化活性相结合。反应的过渡状态必须通过腔内的关键氨基酸侧链的构象控制来制备。与脱碳酶功能的讨论类似,将4碳基氧与Q109氢结合(图9B,右侧面板)以2酮形式结合的乙酰乙酰乙酸酯置于构象控制之下。草酸盐结合FAHD1(PDB:6FOG)的晶体结构揭示了一个保存水分子,其方向是向FAHD1催化中心方向,由残留H30和E33在短螺旋15中呈现。E33-H30 dyad 能够对定向定位水进行脱质子处理,所得的羟基是理想的配置,可攻击 Q109 15 Q10915在构象控制下呈现的 4 碳基。
值得注意的是,已为FAH18提出了类似的机制。羟基核友的攻击预计将导致一个氧化物种,在轨道控制C 3-C4键裂解(图9C)上稳定。在此模型中,C 3-C4键旋转(图 9C)发生在图 9B所示的成形羟基核攻击后(即,它为粘结裂解准备丙烯酰胺)。主要产品为醋酸和甲酸酯。在此假设场景中,醋酸可以淬火苯丙酸,并随后帮助产品位移。在pH7.5以上,在Mg离子的存在下,丙烯酸盐在酮状和烯醇形式之间处于平衡状态,后者略偏30。很可能这两种形式都能够在随后盖闭合下与FAHD1的联因结合。由于苯醇形式的扁平结构,酶的乙酰乙酰乙酸基质的加工受到阻碍。C3-C4裂解会导致无共振稳定的乙烯基卡巴宁。
因此,我们提出了一个催化酮化步骤,为对甲基碳基的羟基核亲子细胞的攻击做准备。然而,这种酮化过程需要控制FAHD1残留物的质子转位,这将把固有的异构酶活性归因于FAHD1。据报道,与未复合的28型氢相比,镁结合的苯氢的酸度增加了一万倍。通过未质子的K123,Mg结合的苯丙酮的脱制是可行的。K123的脱胶可以通过D102的卡盒酸盐辅助。由残留物D102-K47-K123形成的氢键网络可以在FAHD115的催化中心作为必要的质子继电器运行。然后,在基板15的基质基化下,E33-H30-H2 0三重轴可以淬火这种成型的中间体。2酮形式将受到Q109的构象控制,同时形成的羟基会攻击丙基碳基。总结讨论意味着对FAHD1的控制,即通过腔形成残留物的相互作用,在酸和碱之间切换的水分子。
方法的未来应用或方向
此处描述的方法的未来应用很多。大量FAH超级家族的原核成员仍在等待功能特征。甚至关于已知FAH超级家庭成员催化活动的现有信息也很少,在大多数情况下,都是基于理论假设,而不是基于实验数据。此处描述的方法适用于原核FAH超家族成员取决于细菌学的具体研究兴趣。另一方面,最近证明真核FAH超级家族成员在各种细胞隔间(例如,细胞醇与线粒体)中起着至关重要的作用,这突出表明需要更好地描述这些蛋白质的特征(其中三种是特别是由于目前的数据表明,一些未定性的蛋白质在线粒体生物学、衰老研究和癌症研究方面可能具有不同的功能。建议对这些真核FAH超级家族成员进行完整的分子和生理特征,为生物医学领域当代研究的主要领域提供重要的见解。需要对FAHD1(和相关酶)的机制进行更多的研究,以更好地了解FAHD1双功能背后的机制,但还没有完全澄清。对FAHD1突变体、NMR-调查和抑制剂复合物结构研究的其他研究可能有助于解决FAHD1似乎有能力的真正机械情景。此外,计算机辅助设计的能与Mg-cofactor结合的苯醇模拟,最终将导致FAHD1的强效抑制剂。

紫软糖酯水酶(FAH)1,2酶的超级系列描述了一组酶,这些酶共享高度保守的催化FAH域3,4,5,6,7,8,9,10.尽管这些酶具有共同的催化中心,但它们是多功能的,而且大多数是在原核生物中发现的,它们被用来分解从复杂碳源中回收的化合物3。到目前为止,这个家族中只有三个成员被鉴定为真核生物:给FAH2的名字,以及含有FAH域的蛋白质1(FAHD1)11,12,13,14 ,15和 FAH 域含域蛋白 2 (FAHD2)。FAHD1 的消耗与线粒体呼吸受损13、16相关,并与与中间电位相关的可逆型细胞衰老表型14相关电子运输系统的缺陷。人类FAHD1及其在模型系统(小鼠、线虫、癌细胞系、植物等)中的矫形器,以及选定的点突变变异,已成为潜在感兴趣的药物靶点。对于这项研究,高纯度的重组蛋白,以及晶体结构和选择性抗体引导的催化机制的信息至关重要。
本手稿描述了大肠杆菌中FAHD蛋白表达的方法、亲和色谱、离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、准备和分析凝胶过滤、结晶、X射线衍射和光度测定。本文所述的方法和协议的目的是为在细菌学、植物生物学以及动物和人类研究等不同领域工作的科学家提供指导,以描述FAH超级家族的成员,包括无名超家庭成员,如果他们成为相关的特定领域。此处描述的协议可能为旨在描述其他原核生物或真核FAH超级家族成员的项目提供有价值的支持。
这里描述的方法背后的原理是,对于描述不佳的蛋白质(特别是未知生理相关性的代谢酶)的表征,从纯化重组蛋白开始的方法允许开发宝贵的高质量研究工具,如体外活性酶制剂、高质量抗体以及选定酶的强效和特异性药理抑制剂。所述方法要求快速蛋白质液相色谱(FPLC)和X射线晶体学。替代方法(例如,表达蛋白质没有化学诱导,或显示蛋白质纯化后,热处理后,脱盐和大小排除色谱),可在其他地方找到17。虽然有更广泛的方法可用于FAH超级家族酶2、7、9、17、18的表达和纯化,但这项工作侧重于表达和特别是FAHD蛋白的纯化。
在本手稿的讨论部分,更详细地描述了为FAHD1蛋白(水酶、脱碳酶)15确定的催化机制,以展示催化反应的化学性质。根据先前工作7,15,18(PDB:6FOG,PDB:6FOH)获得的数据暗示酶的第三种活性为酮-醇异构酶。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

富玛莱沙酸氢酶 (FAH) 含域蛋白 (FAHD) 是真核生物中 FAH 超级家族的成员。这种超级系列的酶通常表现出多功能性,主要涉及水酶和脱碳酶机制。本文介绍了一系列连续的法脱蛋白表达和纯化方法,主要是FAHD蛋白1(FAHD1)在物种(人类、小鼠、线虫、植物等)之间的矫形。覆盖的方法包括大肠杆菌中的蛋白质表达、亲和色谱、电子交换色谱、预准备和分析凝胶过滤、结晶、X射线衍射和光度测定。高纯度的浓缩蛋白(>98%)可用于结晶或抗体生产。类似或低质量的蛋白质可用于酶测定,或用作检测系统中的抗原(西布洛特、ELISA)。在讨论这项工作时,概述了FAHD1的识别酶机制,以更详细地描述其水酶和脱碳酶的双功能。

从制备的克隆载体和购买的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌开始,质粒通过热休克或任何适当的替代方法插入细菌中(图1)。经过短暂的扩增后,转化后的细菌被镀在LB琼脂板上,以便一夜之间生长。此时的板可能看起来不同,具体取决于各种潜在的误差源。板可能是空的(即没有菌落),完全由细菌过度生长,或介于两者之间。图7A中描述了在最佳和非最佳变换后LB琼脂板的两个示例。细菌菌落过多表明,有太多的细菌被镀(可能),或者正在使用的抗生素可能过期(不太可能)。细菌菌落太少可能表明,要么没有足够的质粒用于转化(下次使用更多),要么使用太多的抗生素来选择细菌。在任何情况下,如果菌落存在,它们应该很好,因为使用两种选择性抗生素意味着细菌生长的机会相当渺茫。然而,没有菌落表明细菌失去了转化能力(由于储存不当或储存时间过长、重复冷冻和解冻等),热休克不成功(没有质粒的接收或细菌死亡过热),克隆载体被损坏,或误用一组错误的选择性抗生素(验证质粒载体上的抗药性基因)。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> 图 7:细菌转化和IMAC的代表性结果。 (A)代表LB琼脂板与转化BL21(DE3)大肠杆菌,通过以下协议步骤1.1获得。左图:具有分布良好的菌落的盘子(正面示例)。右:只有一个殖民地的盘子(负例)。白色圆圈标记良好的殖民地。红色圆圈标记彼此生长太近的殖民地,只要有孤立的殖民地,就不应该采摘。(B)对一系列感应控制进行12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析("-"表示在IPTG感应之前;"+"表示IPTG诱导后,在颗粒收获之前),调整为总蛋白质的等量。步骤 1.2 中对此进行了说明。(C)对尼-NTA纯化的NI-NTA纯化的他标记的FAHD1蛋白的示范性12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。该协议的第 3 节对此进行了说明。亲和色谱产生高纯度蛋白质(>70%,黑色箭头),然而,也观察到几个小污染(红色箭头)。这些污染由与柱结合的非FAHD蛋白质和与FAHD蛋白结合的蛋白质组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
选择并选取经过验证的菌落。在滋养介质中扩增后,通过施用化学IPTG触发蛋白质表达。含有以毫克为单位的表达蛋白质的细菌颗粒被收获,并通过SDS-PAGE验证表达(参见图7B)。在这个否则简单的过程中,可能会出现一些问题。首先,一些蛋白质形成内含体,因为它们显然以某种方式干扰宿主细菌的自然代谢。在人类FAHD1和FAHD2的某些点突变中观察到这一点。在这种情况下,其他表达系统,如昆虫细胞可能更合适,应考虑。例如,从昆虫细胞中采集颗粒后,蛋白质的纯化遵循本协议中所述的步骤。其次,DE3-pET 系统有时被发现是"泄漏的"(即,在 IPTG 诱导之前,蛋白质已经在某种程度上表达)。潜在的原因还没有得到很好的理解,但它可能有助于在冷室孵化器中缓慢地表达蛋白质。第三,不表达蛋白质。这可能是最坏的情况,因为它可能表示一个损坏的质粒载体,因此建议对质粒进行测序。
如果使用His-tag 标记蛋白质,则使用 Ni-NTA 抗氧化剂进行亲和色谱是一种简单且廉价的捕获方法,可消除大多数污染(图 7C)。其他标签系统(例如,STREP-II)也有类似的方法。如果没有使用标记,硫酸铵沉淀和连续疏水交换色谱的组合也可以将蛋白质从大多数其他蛋白质中分离出来(图8A)。然而,比较这两种方法(图7C与图8A),可以通过SDS-PAGE分析来证明Ni-NTA方法的优越性。因此,建议使用他标记的蛋白质。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> 图 8:FPLC实验(HIC、子交换、SEC)的代表性结果。 (A)在未标记的FAHD1蛋白沉淀后,对HIC-苯基质图进行典型的色谱图和12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析,如协议第4节所述。绿线反映缓冲区 B 的渐变,其中不包含 AS。在此过程中,AS 逐渐从系统中洗出。将此面板与图 7C进行比较,显示了与 HIC-phenyl 方法相比,Ni-NTA 亲缘色谱的威力,以及使用His标记系统进行蛋白质纯化的优势。(B)在Ni-NTA纯化后,对标记其标记的FAHD的阳离子交换色谱进行示范性色谱图和12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。使用盐梯度,应用的样品被分离成单个蛋白质。(C)在阳离子交换色谱调查后,对G75尺寸排除色谱的G75尺寸排除色谱进行示范性色谱图和12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
连续,蛋白质通过阳离子/离子交换色谱法进一步从剩余污染中分离出来(例如,参见图8B),然后是大小排除色谱(例如,参见图8C)。建议按此顺序建立初始纯化策略;然而,这些柱应该结合使用,随后和变化,直到蛋白质是足够纯净。
简单的活性测定,为了测试活性基质和/或辅助因子上的"是或否"决定,可在Ni-NTA纯化后使用His标记蛋白,或在离子交换柱后使用未标记的蛋白质进行。特定活动和动力学常数必须用纯度最高的蛋白质确定。离子交换柱后可以尝试与蛋白质结晶,但晶体的质量几乎总是与蛋白质纯度相关。在纯化方案的任何阶段,可针对蛋白质升高多克隆抗体;然而,这里的质量也与蛋白质纯度有关。

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

富玛莱酸氢酶含含蛋白质的表达、纯化、结晶和酶测定

用实例描述了含紫酯水酶的表达和纯化(在大肠杆菌、FPLC中的表达)。纯化蛋白用于结晶和抗体生产,并用于酶测定。提出了选定的光度测定法,以显示FAHD1的多功能性,如牛酸脱碳酶和丙烯酰胺水酶。

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

我们的协议描述了有效表达和纯化FAH域的方法，这些方法含有蛋白质，但也含有一般蛋白质。FHD蛋白-1在TCA周期和线粒体的能量代谢中起着调节作用。我们能够将FHD-1下调节与细胞衰老关联，一般需要有关酶活性和蛋白质结构的信息，以便了解观察到的表型背后的分子机制。通过IPTG可感染载体系统表达蛋白质的主要优点是，所有方法都相对便宜，而且易于在任何实验室中建立。通过将多组蛋白型蛋白质与镍NTA agarose树脂结合使用，可以低成本地利用亲和力色谱的巨大选择性。在大多数情况下，这种质量获得的蛋白质可能就足够了。另一方面，FPLC 是一种成熟且通用的方法，与其他方法相比具有若干优点。首先，在冰上插入5至10纳米的质粒，放入100微升的可胜任的BL21-DE3 pLysS大肠杆菌中。稍微轻点管子，以混合内容物。将细菌放在冰上30分钟，每隔几分钟轻轻敲击一次管子。将热摇床加热至 42 摄氏度。将装有细菌的管子放在仪器中加热90秒。然后，立即将管子放在冰上。在冰上放置5至10分钟后，加入600微升的NZCYM介质，将管子放入细菌培养箱。以中等速度在 37 摄氏度的摇动方向上摇动管子一小时。孵育后，在含有选择抗生素的10厘米LB加糖板上培养200微升的细菌。在37摄氏度的温度下培养细菌培养箱中LB阿加板上的细菌。成功形成菌落后，选择一个菌落，用选定的抗生素将它分散在NZCYM的五毫升中。细菌孵化器中的培养在37摄氏度过夜。细菌生长成功后，根据蛋白质数量的需求，在250毫升、500毫升或1升批次的介质中扩增细菌。然后，培养细菌，在37摄氏度的细菌培养箱中繁殖两到三个小时。孵育后，绘制一个样本进行光度分析。如果600纳米的光学密度达到0.4，则应用200微摩尔至1毫摩尔的异丙基-贝塔-D-thiogalactopyranosid。在37摄氏度的细菌培养箱中，三到五个小时后，蛋白质表达就耗尽了。通过离心收集细菌颗粒，在5000次G下收获5分钟。然后，丢弃上一杯，将颗粒冷冻在零下20摄氏度，进行短暂储存。对于原始细菌悬浮液的每 250 毫升，将所选缓冲液的 5 毫升涂抹到细菌颗粒中。每5毫升应用缓冲液中加入10微升β-甲醇。使用 10 毫升巴斯德移液器通过刮擦和移液机械地将颗粒强制悬浮。将所有悬浮液转移到 50 毫升管中。然后对悬浮液进行声波化。接下来，在4摄氏度的高速下离心机30分钟。在冰上连续过滤上清液。通过将空塑料或玻璃柱连接到稳定的固定器，并用镍 NTA 运行缓冲液进行清洗，准备空塑料或玻璃柱。对于每10毫升的蛋白质悬浮液，将500微升镍NTA阿加罗斯浆料涂抹到柱子上。用镍 NTA 运行缓冲液完全填充柱，确保不破坏加糖树脂，并允许缓冲液通过重力运行。接下来，将蛋白质悬浮液应用到柱子上，让样品通过重力运行。样品通过后，用镍 NTA 运行缓冲区填充列。在柱子下面放置一个紫外线透明玻璃，并收集一毫升镍 NTA 洗脱缓冲液。检查样品的光学密度为 280 纳米，与空白样品。以最佳方式，样品的光学密度大于 2.5。由于FAHD蛋白和镍NTA洗脱缓冲液在冷冻和解冻时会沉淀，因此每100毫升透析缓冲液使用一微升DTT在冰上对另一个缓冲液进行透析。设置一个FPLC系统，用五列卷20%乙醇，然后五列水洗涤柱。平衡列后，将拨号样本应用于列并收集流。设置渐变洗脱。渐变完成后，使用高盐缓冲器运行，直到在一列卷范围内不再检测到峰值。启动微板读卡器，在 25 摄氏度下平衡 30 分钟。准备一毫升20毫升基板溶液，在酶测定缓冲液中进行测试。根据文本协议中的移液方案，用5微升酶溶液将90微升酶测定缓冲液移液到井中，制备酶空白和样品井。然后通过将95微升酶测定缓冲液移入井中制备基板空白和样品井。在测量之前，在六个空白井上应用五微升酶测定缓冲液。将 20 毫摩尔基板溶液的五微升涂在样品井上。在 50 微升设置下使用多通道移液器轻轻混合油井。然后，将板插入微板读卡器，并在 255 纳米下测量每个井。最后，在电子表格中执行分析。此处描述了两个示例 LB agar 板在最佳和非最佳变换之后。太多的细菌菌落表明，两种细菌被镀上，或者抗生素可能过期。太少的细菌菌落可能表明，要么没有足够的质粒用于转化，要么使用太多的抗生素来选择细菌。含有以毫克为单位的表达蛋白的细菌颗粒被收获，并通过SDS页面验证表达。在这个本来简单的过程中，可能会出现一些问题，包括形成内含物体或未表达的蛋白质。如果使用 His-tag 标记蛋白质，则使用镍 NTA agarose 的亲和力色谱是一种简单而廉价的捕获方法，可消除大多数污染。如果不使用标签，硫酸铵沉淀和连续疏水交换色谱的组合也可能将蛋白质与大多数其他蛋白质分离。蛋白质通过离子交换色谱进一步从残留的污染中分离，然后通过大小排除色谱获得足够纯的蛋白质。描述的方法都不难。但所有方法都需要培训。第一次尝试可能会失败，但经过一些额外的调整后，实验将成功。这里介绍的所有方法都是蛋白质纯化的一般方法。虽然该协议专门用于FAHD蛋白质，但可以适应任何人们希望净化的蛋白质。通过所述方法获得了重组人类FAHD-1，高分辨率X射线结构通过作为脱卡基酶和水解酶的功能，极大地促进了我们对FAHD-1的理解。这项工作中使用的细菌是安全菌株，不危险。一般安全指南适用于所有化学品，应谨慎处理 FPLC 柱。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到<em&gt;取值</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

科研

生物化学

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

结合干湿实验室技术指导大型卷曲螺旋含有蛋白质的结晶

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12的表达，纯化和抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

重组蛋白表达，结晶和生物物理研究<em&gt;芽孢杆菌</em&gt; - 保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

哺乳动物 Bestrophin 离子通道的表达与纯化

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

真核硼酸背液转运体的表达、增溶及纯化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

无核酸酶的表达和纯化原氧基质 3，4-二氧酶

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟水稻的横向切片（米 苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR 突变体、克隆、表达、快速蛋白质纯化协议和色氨酸合成酶野生类型和突变形式的结晶

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

亲和色谱法表达和纯化人基质金属蛋白酶-3

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...