Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Forfatterne er meget taknemmelige for ekspert teknisk assistance fra Annabella Pittl og pilot metodeudvikling af Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre og ikke erklære nogen konkurrerende finansielle interesser. H. G. er CEOCSO på MoleculeCrafting. HuGs i Europa og leverede acylpyruvates til dette studie via brugerdefineret syntese. Arbejdet i P. J. D. 's laboratorium blev støttet af den østrigske videnskabs fond (FWF): projektnummer P 31582-B26. Publikations gebyrerne for dette manuskript er delvis blevet dækket af den østrigske videnskabs fond (FWF) underprojekt nummer P 31582-B26. A. N. og B. R. støttes af den østrigske videnskabs fond (FWF) underprojekt P28395-B26.

Vigtige trin
FAHD-proteiner er meget følsomme over for saltkoncentrationer. Ved lave NaCl koncentrationer kan proteinerne udfælde ved optøning, men de kan normalt rekonstitueres fuldt ud ved højere saltkoncentrationer. Det vil være, hvis et FAHD-protein udfældes af en eller anden grund, kan det blive genvundet eller genfoldet med højere saltkoncentrationer (> 300 μM). Nogle mere hydrofobe proteiner kan dog ikke genanvendes (f. eks. Human FAHD2), men rengøringsmidler såsom CHAPS (maks. 1%) eller glycerol (10%) kan bruges til at holde dem i stabil opløsning. Under alle omstændigheder anbefales chok-frysning ved hjælp af flydende kvælstof og opbevaring ved-80 °C, da det er en blid og langsom proces med optøning.
Nogle uventede problemer kan opstå under ni-NTA rensning i trin 3.1.10. Af note, en højere OD i den anden indsamlede prøve end i den første prøve indikerer en for stor mængde af agopstået harpiks (tage en note og bruge mindre harpiks i det næste eksperiment). Også, den agopstået harpiks selv fører til et OD signal ved 280 Nm (dvs., afbrydelse af agopstået harpiks seng vil give kunstige signaler). I tvivlstilfælde tilrådes det at anvende andre metoder som en Bradford-eller BSA-analyse til at bestemme proteinkoncentrationen.
I enzymatiske assays, der er tre kritiske aspekter, der skal overvejes. For det første er det afgørende at vurdere proteinkoncentrationen for at opnå de korrekte specifikke aktiviteter. Graden af renhed af proteinet påvirker resultatet og skal anslås. I tilfælde af mærket protein skal massen af tagdelen beregnes, og den specifikke aktivitet skal korrigeres tilsvarende. For simple analyser, der er beskrevet i afsnit 7 i protokollen, er ni-NTA renhed tilstrækkelig til at skelne mellem aktive og inaktive substrater, cofactors, osv. I tilfælde af mere komplekse Michaelis-Menten-kinetik skal alle reaktant-og substrat koncentrationer bestemmes korrekt. Især ved brug af oxaloacetat (som Auto-decarboxylater over tid) skal den enzymatiske del af reaktionen korrigeres for auto-decarboxylering (under forudsætning af, at begge reaktioner forekommer samtidigt). Indledende ændringer i det optiske densitets signal, der er adresseret til keto-enol tautomerisering af substratet, skal overvejes. For det tredje skal koncentrationerne og mængderne justeres. En reaktion med definerede koncentrationer af enzym og substrat kan give forskellige resultater afhængig af analysens volumen. Hvis der er for meget enzym per brønd, kan adhæsion af væsken i virkeligheden bias resultatet.
Til vurdering af Michaelis-Menten kinetik anbefales det at udføre indledende eksperimenter i 100 μL, 200 μL og 300 μL batcher for at finde den optimale kombination. Lignende aspekter gælder for forholdet mellem enzym-substrat koncentrationer for kinetiske assays. For meget enzym pr. substrat eller for meget substrat pr. enzym sætter systemet uden for den lineære Steady-State Michaelis-serie. Indledende eksperimenter er nødvendige for at optimere disse betingelser. Eksemplarisk justering for human FAHD1 (Wild-type) protein er fastsat i afsnit 8, hvilket resulterer i kinetiske diagrammer (som præsenteret i figur 5b, for eksempel).
Til krystallisering pipettes en dråbe protein opløsning i midten af en dækglas og blandes med en dråbe af krystalliserings cocktail, som sædvanligvis består af en buffer (f. eks., Tris-HCl, Hepes) og en fælg (f. eks. polyethylenglycol, ammonium sulfat). En dråbe af inhibitor opløsning til co-krystallisering (såsom oxalat i denne protokol) kan eventuelt anvendes. Den dækglas er derefter placeret på hovedet over en brønd af reservoir indeholder krystalliserings cocktail, forsegling brønden lufttæt ved hjælp af fugemasse olie (figur 6b). Ideelt set sker der ingen nedbør inden for faldet i begyndelsen af eksperimentet, hvilket betyder, at proteinet forbliver i opløsning. Da den udfældnede koncentration i reservoiret er højere end i faldet, begynder faldet at miste vand ved fordampning i atmosfæren af brønden, indtil ligevægt med reservoiret er nået. Diffusion af vand ind i reservoiret forårsager en langsom volumen reduktion af faldet, som igen forårsager en stigning i både protein og udfældsindig koncentration i dråbe. Hvis protein opløsningen når den krævede tilstand af super mætning og dermed meta stabilitet, kan spontan Nukleering efterfulgt af krystalvækst forekomme. At nå den overmættede tilstand er en nødvendig, men ikke tilstrækkelig betingelse for krystallisering. Krystallisering af proteiner har brug for begge, gunstige termodynamiske og kinetiske forhold, og i høj grad afhænger af de uforudsigelige egenskaber af proteinet, der skal krystalliseres22.
Ændringer og fejlfinding
Ekspression af protein i E. coli kan være ineffektivt. Varierende IPTG-koncentrationer, udtryks temperatur og amplifikationstid, såsom rumtemperatur i flere timer eller i koldt rum natten over, kan være nødvendigt at blive testet for hvert nyt protein for at finde optimale betingelser. Udfældning af protein i inklusions kroppe observeres sommetider for mere hydrofobe FAHD-proteiner. I sådanne tilfælde anbefales protein udtryk i andre modelsystemer såsom insekt celler, da inklusions organerne er mindre tilbøjelige til at danne26.
Da FAHD-proteiner er følsomme over for salt-og cofaktor koncentrationer samt pH, kan rensnings strategier for forskellige homologer, ortologer og punkt Mutations varianter variere i individuelle indstillinger. De beskrevne rensningsmetoder er udviklet til Wild-type menneske og mus FAHD1 protein. Koncentrationer af kemikalier, såsom NaCl og imidazol, samt pH, kan være nødvendigt at tilpasse for individuelle proteiner med et andet isoelektrisk punkt (pI). Bemærk også, at ikke alle hans-mærkede proteiner kan binde godt til en ni-NTA harpiks. Hvis proteinbindingen til ni-NTA-søjlen er ineffektiv, kan tilpassede koncentrationer af NaCl og imidazol samt varierende pH-forhold i ni-NTA-løbe bufferen bidrage til at forbedre kvaliteten af resultatet. Hvis det ikke er, kan det også føre til en vellykket rensningsstrategi at springe ni-NTA-trinnet over og fortsætte til trinnet for ionbytningskromatografi. Hvis et protein binder sig til ni-NTA-søjlen, men ikke kan elupes fra søjlen, kan tilsætning af nogle mM EDTA hjælpe med at forstyrre ni2 +- komplekset.
Med hensyn til processen med krystallisering skal det forstås, at selvorganisering af store og komplekse proteinmolekyler i et regulært periodisk gitter er en iboende usandsynlig proces, der er stærkt afhængig af svære at kontrollere kinetiske parametre. Selv små ændringer i den opsætning, der anvendes til krystallisering kan dramatisk ændre resultatet og ingen krystaller vil danne. Protein renhed er generelt af afgørende betydning. Som en tommelfingerregel bør en stærkt overbelastet SDS-PAGE gel ikke vise andre bands. Den sekvens, som trinnene udføres i, kan også påvirke resultatet. Som et eksempel, for at sikre reproducerbarhed, er det ofte nødvendigt at holde pipette Rings sekvensen den samme, derefter først tilføje proteinet, og endelig tilføje udfældnings middel til krystalliserings dråbe (eller omvendt). Uanset hvilken metode, der anvendes, bør det holdes det samme, når de forsøger at reproducere eller opskalering eksperimenter. Hvis der ikke observeres krystaller efter denne protokol, kan den kemiske bundfældning, pH, Dråbestørrelse og forholdet mellem protein og bundfald varieres i små intervaller. Tålmodighed og konsekvente observationer af dråberne er af dyd.
Bemærkninger til katalytiske mekanismer af FAHD1
De præsenterede metoder er udviklet specifikt for at opnå FAHD1 proteiner af høj kvalitet. Dette gav mulighed for vækst af FAHD1 krystaller samt konstruktion af krystaller, der indeholder FAHD1 kompleks bundet til en inhibitor (oxalat, PDB: 6fog). Røntgen strukturerne giver en 3D-arkitektur af enzymets katalytiske hulrum. Disse resultater etablerer en omfattende beskrivelse af rester, der potentielt er vigtige for katalysatoren af dette spændende enzym. FAHD1 blev først beskrevet for at kunne Cleave acylpyruvater (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senere blev det konstateret, at FAHD1 også fungerer som en decarboxylase af oxaloacetat12. Selv om substrater acylpyruvat og oxaloacetat er forskellige kemiske dele, de kemiske omdannelser deler mekanisk den strategiske spaltning af en fælles enkelt C3-c4 obligation, energisk lettet, hvis C3 -C4 obligations orbitaler forbliver ortogonale til π-orbitaler af C2-carbonyl15. En sådan konformation muliggør resonans stabilisering af C3-carbanion forbigående dannet under spaltnings processen. FAHD1 substrater (oxaloacetat og acylpyruvates) er fleksible molekyler og kan eksistere i tautomeric (keto-enol) samt C2-hydrerede former (figur 9a). Ligevægten mellem de forskellige arter bestemmes hovedsagelig af karakteren af den anvendte buffer sammensætning, pH og tilstedeværelsen af metalioner. I det følgende diskuterer vi hypotetiske mekanistiske scenarier inspireret af analyse af røntgen krystal strukturer, der afslørede det katalytiske centrum af FAHD1.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2.jpg"> Figur 9 : Nærmere oplysninger om den foreslåede katalysator for human FAHD1. (A) oxaloacetat findes i krystallinsk tilstand samt i neutral opløsning, hovedsagelig i Z-enol-form24. Men under fysiologiske pH-betingelser 2-keto form er den fremherskende repræsentation25. B) kemisk skitse af hFAHD1 hulrum15 med mg-bundet oxaloacetat (venstre) og acylpyruvat (højre, med R1 som organisk hvile; den røde pil angiver et nukleofile anfald af det tilstødende stabiliserede vandmolekyle) (Se diskussionen). (C) sammenligning af begunstigede konformationer for C3-C4 spaltning i decarboxylase (b til c) og lav affinitet (b ' til C) mekanisme af FAHD1: begge processer resulterer i mg-complexed pyruvate-enolat (Se diskussion). Mellemprodukter b og b ' forventes at blive stabiliseret med Q109, som skitseret i panel B (Se diskussion). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Decarboxylase-aktiviteten af FAHD1
Oxaloacetat findes i krystallinsk tilstand såvel som i neutral opløsning hovedsageligt i Z-enol-form24. Men det blev påvist, at under fysiologiske pH-betingelser (buffer betingelser ved pH 7,4) er 2-keto-formen den fremherskende repræsentation af oxaloacetat25 (figur 9a), og at enolisering ikke er en forudsætning for decarboxylering27 . Af note, mg2 + ioner har ingen indflydelse på forholdet mellem oxaloacetat arter ved en pH-værdi på 7,4 eller under28. Gennemførelsen af oxaloacetat keto-formen i det katalytiske centrum af FAHD1 (styret af det bundne oxalat i det kompleks bundet enzym (FBF: 6fog15)) afslørede rester Q109 som en konformationel regulator af den bundne oxaloacetat15. Som skitseret i en anden artikel15, stabiliserer hydrogen binding til carbamoylfosfatsyntetaseaktivatorer-gruppen af Q109 en oxaloacetat-konformation som følge af rotation omkring C2-C3 Bond (figur 9b, venstre panel). Som en konsekvens af denne rotation, C3-C4 Bond (der skal kløvet) vedtager en nær ortogononal disposition i forhold til π-orbitaler af c2-carbonyl (figur 9c). Kuldioxid kan frigives. Det primære produkt af denne proces ville være resonans stabiliseret mg-enolat af pyruvate. Det er kendt fra undersøgelser af oxaloacetat-mg komplekser, at enolate danner den mest stabile kompleks28,29. Hvis man antager en sammenlignelig stabilitet for en mg-pyruvat enolatkompleks, kan cofaktor of FAHD1 blokeres, men lysinrest K123 kan protonere pyruvat-enolat i en ligevægt for at forbyde tab af cofaktor15.
Den givne fortolkning antyder pyruvat enol som et særskilt mellemprodukt i katalytisk ODX-funktion af FAHD1. På dette trin i den hypotetiske model giver eksperimentelle data ikke yderligere oplysninger om, hvorfor det lukkede låg skal åbnes for at frigive produktet. Det kan dog udledes, at den foreslåede mekanisme ligner en enzym hæmning af produktet: Krystalstrukturen afslører et bevaret vandmolekyle, der holdes i retningsbestemt retning mod FAHD1 katalysatoren af rester H30 og E33 præsenteret i en kort Helix15, som induceres på ligand binding og låg lukning. Hvis den primære enol ville bo i en ligevægt med enolate, den resonans stabiliseret enolate kunne slukkes for pyruvat af vand molekylet. Den resulterende hydroxyl ville være i stand til at fortrænge pyruvatet fra den mg-cofactor, hvorpå låget ville åbne. Endelig vil den katalytiske Center blive genoprettet i mitokondriel miljø. I denne hypotetiske scenario, hulrum vand molekyle ville fungere som en syre, hhv.
Hydrolase aktivitet af FAHD1
Hydrolase aktivitet af et enzym kræver implicit den mellemliggende dannelse af en hydroxyl nucleophile. Denne mekanisme findes sædvanligvis i kombination med syre-base katalytisk aktivitet. Den midlertidige tilstand af reaktionen skal forberedes via konformationel kontrol af kritiske aminosyre sidekæder i hulrummet. Analogt med drøftelsen af decarboxylase-funktionen vil enzymbundet acylpyruvate i 2-keto-form blive sat under konformationel kontrol ved hydrogen binding af 4-carbonyl oxygen til Q109 (figur 9b, højre panel). Krystalstrukturen af oxalatbundet FAHD1 (PDB: 6FOG) afslører et bevaret vandmolekyle, der holdes i retningsbestemt retning mod det FAHD1 katalytiske Center af rester H30 og E33 præsenteret i en kort Helix15. E33-H30 DYAD er kompetent til at deprotonere det retningsbestemt placerede vand, og den resulterende hydroxyl er i ideel disposition til at angribe 4-carbonyl af acylpyruvate præsenteret under konformational kontrol af Q10915.
Der er blevet foreslået en lignende mekanisme for FAH18. Angreb fra hydroxyl nukleofil forventes at resultere i en oxyanion arter, der er stabiliseret på orbital kontrolleret C3-C4 Bond spaltning (figur 9c). I denne model sker C3-c4 Bond rotation (figur 9c) efter det nukleofile angreb af den dannede hydroxyl, der er angivet i figur 9b (dvs. det forbereder acylpyruvate for obligationen spaltning). De primære produkter ville være eddikesyre og mg-pyruvate enolat. I dette hypotetiske scenarie kunne eddikesyren slukke for enol til pyruvat og efterfølgende hjælpe med at forrevne produktet. Over en pH-værdi på 7,5 og ved tilstedeværelse af mg-ioner findes acylpyruvater i ligevægt mellem keto-og enol-former, sidstnævnte i mindre præference30. Sandsynligvis begge former er i stand til at binde til cofaktor af FAHD1 under efterfølgende låg lukning. Behandling af enolic acylpyruvate substrater af enzymet hæmmes på grund af den flade struktur af enol-form. C3-C4 spaltning ville resultere i en vinylic carbanion uden resonans stabilisering.
Derfor foreslår vi et katalytisk ketonisation trin til at forberede angreb af hydroxyl nukleofil på acyl carbonyl. Denne proces af ketonisation, dog, ville kræve kontrol over proton transpositioner af FAHD1 rester, som ville tillægge en iboende isomerase aktivitet til FAHD1. Det er rapporteret, at surhedsgraden af mg-bundet enol hydrogen afslører en 10000-fold stigning i forhold til un-complexed form28. En Deprotoneringsligevægten af mg bundet enol-form ville være muligt ved un-protonated K123. Deprotonation af K123 kan bistås af carboxylatet af D102. Et brint bindings netværk dannet af rester D102-K47-K123 kunne fungere som det nødvendige proton relæ i det katalytiske centrum af FAHD115. En sådan formet intermediær enolat kunne derefter slukkes med en E33-H30-H20 Triad under ketonisation af substratet15. 2-keto form ville komme under konformationel kontrol af Q109, og den samtidig dannede hydroxyl ville angribe acyl carbonyl. Den opsummerede diskussion indebærer en kontrol af FAHD1 om et vand molekyle til at skifte mellem syre og base gennem samspil af hulrum-danner rester.
Fremtidige anvendelser eller retninger af metoden
Fremtidige anvendelser af de metoder, der er beskrevet her er talrige. Et væld af prokaryotiske medlemmer af FAH-super familien venter stadig på funktionel karakterisering. Selv de tilgængelige oplysninger om de katalytiske aktiviteter hos kendte FAH-super familiemedlemmer er knappe og er i de fleste tilfælde baseret på teoretiske antagelser snarere end eksperimentelle data. Anvendelse af de metoder, der er beskrevet her for prokaryote Fah super familiemedlemmer afhænger af de specifikke forskningsinteresser i bakteriologi. På den anden side, den nylige demonstration, at eukaryote Fah super familiemedlemmer spiller væsentlige roller i forskellige cellulære rum (f. eks cytosol vs. mitokondrier) fremhæver behovet for bedre at karakterisere disse proteiner (tre af dem er blevet identificeret indtil videre), især fordi de aktuelle data antyder, at nogle ukarakteriserede proteiner kan udføre forskellige funktioner i forbindelse med mitokondriel biologi, aldrende forskning og kræftforskning. Det foreslås, at den fulde molekylære og fysiologiske karakterisering af disse eukaryote Fah super familiemedlemmer kan give vigtig indsigt i store områder af moderne forskning i den biomedicinske sektor. Mere forskning i mekanismerne i FAHD1 (og relaterede enzymer) er nødvendige for bedre at forstå mekanismerne bag bi-funktionaliteten af FAHD1, som stadig ikke er helt afklaret. Yderligere undersøgelser med FAHD1 mutanter, NMR-undersøgelser, og strukturelle undersøgelser af inhibitor komplekser kan bidrage til at løse de sande mekanistiske scenarier, som FAHD1 synes at være kompetent. Desuden, computer-aided design af enol efterligner stand til at binde til mg-cofactor i sidste ende vil føre til potente hæmmere af FAHD1.

Fumarylacetoacetat lav affinitet (Fah)1,2 superfamily af enzymer beskriver en gruppe af enzymer, der deler det meget bevaret katalytiske område3,4,5,6 , 7 af , 8 ud af , 9 ud af , 10. på trods af deres fælles katalytiske Center, er disse enzymer multi-funktionelle, og de fleste findes i prokaryoter, hvor de bruges til at nedbryde forbindelser hentet fra komplekse kulstofkilder3. Kun tre medlemmer af denne familie blev identificeret i eukaryoter indtil videre: navnet giver Fah2, samt Fah domæne-holdige protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 og Fah-domæne indeholdende protein 2 (FAHD2). Nedbrydningen af FAHD1 har været forbundet med svækket mitokondriel respiration13,16 og forbundet med en reversibel type cellulær senescens fænotype14 , der er forbundet med mellemliggende potentiel mangler i elektrontransport systemet. Human FAHD1 og dens ortologer i modelsystemer (mus, nematode, kræft cellelinjer, planter, osv.), samt udvalgte punkt mutation varianter, er blevet stoflig mål af potentiel interesse. Til denne forskning, rekombinant protein på høje niveauer af renhed, samt oplysninger om katalytiske mekanismer styret af krystal strukturer og selektive antistoffer er afgørende.
Dette manuskript beskriver metoder til FAHD-proteinekspression i E. coli, affinitet kromatografi, ionbytningskromatografi, ammoniumsulfat nedbør, præparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, røntgen diffraktion og fotometrisk assays. Formålet med de metoder og protokoller, der er beskrevet her, er at vejlede videnskabsfolk, der arbejder på forskellige områder, såsom bakteriologi, Plantebiologi samt dyre-og humane studier, til at karakterisere medlemmer af FAH-super familien, herunder ukarakteriserede super familiemedlemmer bør de blive relevante på et bestemt område. De protokoller, der beskrives her, kan give værdifuld støtte til projekter, der har til formål at karakterisere andre prokaryotiske eller eukaryotiske FAH-super familiemedlemmer.
Begrundelsen for de metoder, der er beskrevet her, er, at for karakterisering af dårligt beskrevne proteiner (især metaboliske enzymer af ukendt fysiologisk relevans) giver tilgangen til Start med rensede rekombinante proteiner mulighed for udvikling af uvurderlige forskningsværktøjer af høj kvalitet, såsom in vitro-aktive enzympræparater, antistoffer af høj kvalitet og potente og specifikke farmakologiske hæmmere for udvalgte enzymer. De beskrevne metoder kræver hurtig protein væskekromatografi (FPLC) og X-ray krystallografi. Andre metoder (f. eks. til at udtrykke protein uden kemisk induktion eller til at udvise protein rensning ved centrifugering efter varmebehandling, efterfulgt af afsaltning og størrelses udelukkelses kromatografi) kan findes andetsteds17. Mens et bredere spektrum af metoder er til rådighed for ekspression og rensning af Fah superfamily enzymer2,7,9,17,18, fokuserer dette arbejde på udtryk og især rensning af FAHD-proteiner.
I diskussionsafsnittet i dette manuskript er de katalytiske mekanismer, der er identificeret for FAHD1-proteinet (hydrolase, decarboxylase)15 , beskrevet mere detaljeret for at påvise den kemiske karakter af de katalyserede reaktioner. De data, der er indhentet på grundlag af tidligere arbejde7,15,18 (FBF: 6fog, PDB: 6foh), indebærer en tredje aktivitet af enzymet som keto-enol isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Fumarylacetoacetat lav affinitet (Fah) domæne-holdige proteiner (Fahd) er identificeret medlemmer af Fah superfamily i eukaryoter. Enzymer i denne super familie udviser generelt multifunktionalitet, der hovedsagelig involverer lav affinitet-og decarboxylase-mekanismer. Denne artikel præsenterer en række på hinanden følgende metoder til ekspression og rensning af FAHD-proteiner, hovedsagelig FAHD-protein 1 (FAHD1)-ortologer blandt arterne (mennesker, mus, nematoder, planter osv.). Dækkede metoder er protein udtryk i E. coli, Affinity kromatografi, ionbytningskromatografi, præparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, røntgen diffraktion og fotometriske assays. Koncentreret protein af høj renhedsgrad (> 98%) kan anvendes til krystallisering eller antistof produktion. Proteiner af tilsvarende eller ringere kvalitet kan anvendes i enzym analyser eller anvendes som antigener i detekteringssystemer (Western-blot, Elisa). I diskussionen af dette arbejde, de identificerede enzymatiske mekanismer af FAHD1 er skitseret for at beskrive sin lav affinitet og decarboxylase BI-funktionalitet i flere detaljer.

Begyndende med en forberedt kloning vektor og købt BL21 (DE3) Plyss E. coli, plasmid er indsat i bakterierne via varmechok eller enhver passende alternativ metode (figur 1). Efter en kort periode med forstærkning, er de transformerede bakterier belagt med LB agar plader, for at vokse natten over. Plader på dette tidspunkt kan se anderledes ud, afhængigt af en række potentielle fejlkilder. Pladerne kan være tomme (dvs. ingen kolonier), helt overgroet af bakterier, eller noget i mellem, hhv. To eksempler på LB-agar-plader efter optimal og ikke-optimal transformation er afbildet i figur 7a. For mange bakteriekolonier indikerer enten, at for mange bakterier blev belagt (sandsynligvis), eller at de antibiotika i brug kan være udløbet (usandsynligt). For få bakterielle kolonier kan indikere, at enten ikke nok plasmid blev brugt til omdannelsen (brug mere næste gang), eller at for meget antibiotika blev brugt til at vælge bakterier. Under alle omstændigheder, hvis kolonier er til stede, bør de være fint, som ved hjælp af to selektive antibiotika indebærer en temmelig ubetydelig chance for utransformerede bakterier til at vokse. Ingen kolonier overhovedet, indikerer dog, at enten bakterierne mistede deres transformation kompetence (på grund af forkert opbevaring eller opbevaring over længere perioder, gentagne fryse-og optøning, osv.), var varmechok ikke vellykket (ingen plasmid optagelse eller bakteriel døden ved for meget varme), klonings vektoren er beskadiget, eller ved en fejltagelse blev der anvendt et forkert sæt selektive antibiotika (Kontroller resistens genet på plasmid-vektoren).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figur 7 : Repræsentative resultater for bakterie transformation og iMac. A) repræsentative lb-agar-plader med TRANSFORMEREDE BL21 (DE3) E. colifremstillet ved følgende protokol trin 1,1. Venstre: en plade med godt fordelte kolonier (positivt eksempel). Til højre: en plade med kun en enkelt koloni (negativt eksempel). Hvide cirkler markerer gode kolonier. Den røde cirkel markerer kolonier, der vokser for tæt på hinanden og ikke bør plukkes, så længe isolerede kolonier er tilgængelige. (B) en 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af en række induktions kontroller ("-" indikerer før iptg induktion; "+" indikerer efter IPTG induktion, før pellet høst), justeret til lige store mængder af det samlede protein. Dette er beskrevet i trin 1,2. (C) en eksemplarisk 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af ni-NTA rensning af hans-mærkede FAHD1 protein. Dette er beskrevet i protokollens afsnit 3. Affinitets kromatografi giver protein af høj renhed (> 70%, sort pil), men der observeres også flere små forureninger (røde pile). Disse forureninger består af ikke-FAHD-proteiner, der binder sig til kolonnen, og fra proteiner, der binder sig til FAHD-proteinet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Validerede kolonier udvælges og plukkes. Efter amplifikation i nærende medium, protein udtryk udløses ved anvendelse af den kemiske IPTG. Den bakterielle pellet, der indeholder det udtrykte protein i milligram mængder høstes, og udtrykket er verificeret via SDS-PAGE (Se for eksempel figur 7b). Nogle problemer kan opstå under denne ellers simple proces. Første, nogle proteiner form inklusion organer, fordi de tilsyneladende eller anden måde forstyrre den naturlige metabolisme af værten bakterier. Dette blev observeret for nogle punktmutationer af menneskelige FAHD1 og FAHD2. I sådanne tilfælde kan andre udtryks systemer som insekt celler være mere hensigtsmæssige og bør overvejes. Efter høst af en pellet fra insekt celler, for eksempel, rensning af proteinerne følger de samme trin som beskrevet i denne protokol. For det andet, DE3-pET system er undertiden fundet at være "utætte" (dvs., protein er allerede udtrykt til en vis grad før iptg induktion). Den potentielle årsag til dette er ikke godt forstået, men det kan bidrage til at udtrykke proteinet langsomt natten over i et koldt rum inkubator. For det tredje udtrykkes intet protein. Dette er sandsynligvis den værst tænkelige scenario, da det sandsynligvis indikerer en beskadiget plasmid vektor og dermed tilrådeligt at sekvens plasmid.
Hvis et hans-tag blev brugt til at tagge proteinet, er affinitets kromatografi med ni-NTA agopstået en nem og billig fangstmetode, der eliminerer størstedelen af kontamineringer (figur 7c). Lignende metoder findes for andre tag systemer (f. eks STREP-II). Hvis der ikke er anvendt nogen mærkning, kan en kombination af ammoniumsulfat nedbør og efterfølgende hydrofob-udvekslings kromatografi også adskille proteinet fra størstedelen af andre proteiner (figur 8a). Ved at sammenligne de to metoder (figur 7c vs. figur 8a) kan ni-NTA-metodernes OVERLEGENHED imidlertid PÅVISES ved SDS-Page-analyse. Det tilrådes derfor at bruge hans-mærkede protein.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figur 8 : Repræsentative resultater for FPLC-eksperimenter (HIC, ion Exchange, SEK). (A) en typisk kromatogram og 12,5% acrylamid SDS-side analyse af HIC-phenyl-kromatografi efter ammoniumsulfat (AS) udfældning af UKODET FAHD1 protein, som beskrevet i afsnit 4 i protokollen. Den grønne linje afspejler den graduering af buffer B, der ikke indeholder AS. I løbet af processen som er gradvist vaskes ud fra systemet. Sammenligning af dette panel til figur 7c viser kraften i ni-NTA Affinity kromatografi sammenlignet med HIC-phenyl metoden, og fordelen ved at bruge en hans-tag system til protein rensning. (B) et eksemplarisk kromatogram og 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af kationisk bytnings kromatografi af hans-mærkede Fahd efter ni-NTA rensning. Ved hjælp af en salt gradient adskilles den anvendte prøve i individuelle proteiner. (C) et eksemplarisk kromatogram og 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af G75 size udelukkelse kromatografi af hans-mærkede Fahd efter kationisk bytnings kromatografi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Efter hinanden adskilles proteinet yderligere fra rester af kontaminering ved kation/anionbytnings kromatografi (Se f. eks. figur 8b), fulgt af størrelses-udelukkelses kromatografi (Se f. eks. figur 8c). Det tilrådes at oprette en indledende rensningsstrategi i denne rækkefølge; disse kolonner bør dog anvendes i kombination, efterfølgende og i variation, indtil proteinet er tilstrækkeligt rent.
Simple aktivitets analyser, for at teste for "ja eller nej" beslutninger om aktive substrater og/eller cofactors, kan udføres med hans-mærkede proteiner efter ni-NTA rensning, eller umærkede proteiner efter ionbytnings søjlen. Specifikke aktiviteter og kinetiske konstanter skal bestemmes med protein af højeste renhed. Krystallisering kan forsøges med proteiner efter ionbytnings søjlen, men kvaliteten af krystaller er næsten altid korrelerer med protein renhed. Polyklonale antistoffer kan rejses mod proteiner på et hvilket som helst tidspunkt i rensnings protokollen. men her kvaliteten også korrelerer med protein renhed.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Udtryk og rensning af fumarylacetoacetat lav affinitet domæne-holdige proteiner er beskrevet med eksempler (udtryk i E. coli, fplc). Rensede proteiner bruges til krystallisering og antistof produktion og anvendes til enzym assays. Udvalgte fotometriske analyser er præsenteret for at vise multi-funktionaliteten af FAHD1 som oxaloacetat decarboxylase og acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Vores protokol beskriver metoder til effektiv ekspression og rensning af FAH domæne, der indeholder proteiner, men også proteiner i almindelighed. FHD protein-1 spiller en regulerende rolle i TCA cyklus og energi metabolisme af mitokondrier. Vi var i stand til at knytte FHD-1 downregulation til cellulære senescens og oplysninger om enzymaktivitet og proteinstruktur er generelt nødvendige for at forstå molekylære mekanismer bag observerede fænotyper.Den største fordel ved at udtrykke proteiner via IPTG inducerende vektorsystemer er, at alle metoder er relativt billige og nemme at etablere i ethvert laboratorium. Ved at anvende poly-histidin type proteiner i kombination med nikkel NTA agarose harpiks, den enorme selektivitet af affinitetkromatografi kan anvendes til lave omkostninger. Til de fleste formål, protein fremstillet ved denne kvalitet kan allerede være tilstrækkeligt.FPLC på de andre hænder, er en veletableret og generel metode med flere fordele i forhold til andre metoder. Først indsætte fem til 10 nanogram plasmid i 100 mikroliter af kompetente BL21-DE3 pLysS E.coli bakterier på is. Let banke på røret for at blande indholdet.Hold bakterierne på is i 30 minutter, forsigtigt trykke røret med få minutters mellemrum. Varm en termokande til 42 grader celsius. Rør, der indeholder bakterierne, anbringes i apparatet og opvarmes i 90 sekunder.Derefter placere røret på isen med det samme. Efter fem til 10 minutter på is, tilsæt 600 mikroliter af NZCYM medium og læg røret i en bakterieinkubator. Ryst røret ved medium hastighed orienteret langs rysteretningen ved 37 grader celsius i en time.Efter inkubation, plade 200 mikroliter af bakteriekulturen på en 10 centimeter LB agar plade, der indeholder udvælgelsen antibiotika valg. Kultur bakterierne på LB agar plade i bakterier inkubator ved 37 grader celsius natten over. Efter en vellykket kolonidannelse skal du vælge en enkelt koloni og sprede den i fem milliliter NZCYM med de valgte antibiotika.Kultur i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius natten over. Efter vellykket bakterievækst forstærkes bakterierne i 250 milliliter, 500 milliliter eller en liter partier af medium afhængigt af efterspørgslen efter proteinmængde. Derefter kultur bakterierne, i bakterier inkubatoren ved 37 grader celsius i to til tre timer.Efter inkubation udtages en prøve til fotometrisk analyse. Hvis den optiske massen ved 600 nanometer har nået 0,4, anvende 200 mikromolar op til en millimolar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Efter tre til fem timer mere i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius proteinudtryk er opbrugt.Høst den bakterielle pellet via centrifugering på 5,000 gange G i fem minutter. Derefter kasseres supernatant og fryse pellet ved minus 20 grader celsius for kort opbevaring. For hver 250 milliliter original bakteriel suspension, anvende fem milliliter af den valgte buffer til bakteriel pellet.Der tilsættes 10 mikroliter beta-mercaptoethanol pr. 5 ml påført buffer. Brug en 10 milliliter Pasteur pipet til mekanisk at tvinge pellet i suspension ved ridser og pipettering. Hele suspensionen overføres til et 50 milliliterrør.Derefter sonikere suspensionen. Dernæst centrifuge i 30 minutter ved høj hastighed ved fire grader celsius. Supernatanten filtreres fortløbende med filterenheder på is.Forbered en tom plast eller glas søjle ved at fastgøre den til en stabil holder og vask med nikkel NTA kører buffer. For hver 10 milliliter proteinsuspension påføres 500 mikroliter nikkel NTA agarose gylle på kolonnen. Fyld kolonnen helt med nikkel NTA løbebuffer, der sikrer, at agarose harpiksen ikke forstyrres, og lade bufferen løbe igennem af tyngdekraften.Derefter påføres proteinsuspensionen på kolonnen, og lad prøven løbe igennem af tyngdekraften. Når prøven er passeret igennem, fyldes kolonnen med nikkel-NTA-løbebufferen. Placer en UV gennemsigtig kuvette under kolonnen og indsamle en milliliter nikkel NTA elution buffer.Prøvens optiske massetæthed kontrolleres ved 280 nanometer i forhold til en blindprøve. Optimalt viser prøven en optisk tæthed på over 2,5. Da FAHD-proteiner og nikkel NTA-elutionbufferen vil udløse ved frysning og optøning, dialyserer proteinet mod en anden buffer natten over på is ved hjælp af en mikroliter DTT pr. 100 milliliter dialysebuffer.Opret et FPLC-system, og vask kolonnen med fem kolonnemængder på 20 % ethanol efterfulgt af fem kolonnemængder vand. Efter at kolonnen er ligevægt, påføres den dialyserede prøve på kolonnen, og strømmen opsamles. Konfigurer en graduerings-elution.Når forløbet er færdigt, køres med høj saltbuffer, indtil der ikke registreres flere toppe over området med én kolonnevolumen. Start en mikropladelæser og ligevægt i 30 minutter ved 25 grader celsius. Der klargør en milliliter en 20 millimolaropløsning af et substrat, der skal testes i enzymanalysebufferen.Ifølge pipetteringsordningen i tekstprotokollen skal enzymblyten og prøveblydene tilberedes med 90 mikroliter enzymanalysebuffer i brøndene med fem mikroliter enzymopløsning. Derefter forberede substrat blank og prøve brønde ved pipettering 95 mikroliter af enzym assay buffer i brøndene. Lige før måling, anvende fem mikroliter af enzym assay buffer til de seks tomme brønde.Der påføres fem mikroliter af 20 millimolar substrateopløsningen på prøvebondene. Brug en multi-kanal pipet ved 50 mikroliter indstilling til forsigtigt at blande brønde. Sæt derefter pladen ind i mikropladelæseren og mål hver brønd ved 255 nanometer.Endelig udføre analysen i et regneark. To eksempler LB agar plader efter optimal og ikke-optimal transformation er afbildet her. Alt for mange bakteriekolonier indikerer enten, at to mange bakterier var belagt, eller at antibiotika kan være udløbet.For få bakteriekolonier kan indikere, at enten ikke nok plasmid blev brugt til transformationen, eller at for meget antibiotika blev brugt til at vælge bakterierne. Den bakterielle pellet, der indeholder det udtrykte protein i milligram mængder er høstet og udtryk er verificeret via SDS-side. Nogle problemer kan opstå under denne ellers enkle proces, herunder de proteiner, der danner inklusionsorganer, eller proteinet, der ikke udtrykkes.Hvis en His-tag bruges til at mærke protein, affinitetkromatografi med nikkel NTA agarose er en nem og billig fangst metode fjerne de fleste forureninger. Hvis der ikke anvendes et mærke, kan en kombination af ammoniumsulfatuddældning og en sammenhængende hydrofobisk udvekslingskromatografi også adskille proteinet fra de fleste andre proteiner. Proteinet er yderligere adskilt fra sidesten forureninger med ionbytterkromatografi efterfulgt af størrelse udelukkelse kromatografi for at opnå et tilstrækkeligt rent protein.Ingen af de beskrevne metoder er især vanskelige. Men alle metoder kræver uddannelse. Første forsøg kan mislykkes, men forsøgene vil lykkes efter nogle yderligere tilpasninger.Alle metoder, der præsenteres her, er generelle metoder til proteinrensning. Selv om specialiseret til FAHD proteiner, protokollen kan tilpasses til ethvert protein, man gerne vil rense. Rekombinant menneskelige FAHD-1 er opnået ved de beskrevne metoder og høj opløsning x-ray strukturer bidraget massivt til vores forståelse af FAHD-1 ved funktionalitet fungerer som både, decarboxylase og hydrolase.Bakterier, der anvendes i dette arbejde er sikkerhedsstammer og ikke farlige. Generelle sikkerhedsvejledninger gælder for alle kemikalier, og FPLC-kolonner skal håndteres med forsigtighed.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våd og tør Lab Techniques Guide krystallisering af store coiled-coil indeholdende proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Protein Ekspression, Krystallisering og Biofysiske Studier af a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserveret nucleotidpyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Udtryk, oploesning og rensning af eukaryote Borat transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Expression, Fast Protein Rensning Protokoller og krystallisering af wild type og mutant former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriel ekspression og oprensning af human matrixmetalloproteinase-3 ved anvendelse af affinitetskromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...