Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

De auteurs zijn zeer dankbaar voor deskundige technische bijstand door Annabella Pittel en de piloot methode ontwikkeling door Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en geen concurrerende financiële belangen te verklaren. H. G. is CEOCSO op MoleculeCrafting. HuGs e.U. en mits acylpyruvates voor deze studie via aangepaste synthese. Het werk in P. J. D. 's Lab werd ondersteund door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF): projectnummer P 31582-B26. De publicatiekosten voor dit manuscript zijn deels gedekt door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF) onder projectnummer P 31582-B26. A. N. en B. R. worden gesteund door het Oostenrijkse Fonds van de wetenschap (FWF) onder project P28395-B26.

De fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)1,2 superfamilie van enzymen beschrijft een groep van enzymen die het aandeel van de zeer behouden katalytische Fahdomein 3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10. ondanks hun gemeenschappelijke katalytische centrum, zijn deze enzymen multi-functioneel, en de meesten worden gevonden in prokaryoten, waar zij worden gebruikt om samenstellingen te breken die van complexe koolstofbronnen worden teruggewonnen3. Slechts drie leden van deze familie werden geïdentificeerd in eukaryoten tot dusver: de naam die Fah2geeft, evenals Fah domein-bevattende proteïne 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 en Fah domein-bevattend PROTEÏNE 2 (FAHD2). Uitputting van FAHD1 is geassocieerd met verminderde mitochondriale ademhaling13,16 en geassocieerd met een omkeerbare type cellulaire senescentie fenotype14 dat is gekoppeld aan intermediair potentieel tekortkomingen in het elektron transportsysteem. De menselijke FAHD1 en zijn orthologues in modelsystemen (muis, nematode, kankercellen lijnen, installaties, enz.), evenals de geselecteerde varianten van de punt verandering, zijn druggable doelstellingen van potentieel belang geworden. Voor dit onderzoek, recombinant eiwit op hoge niveaus van zuiverheid, alsmede informatie over katalytische mechanismen geleid door kristalstructuren en selectieve antilichamen zijn van vitaal belang.
Dit manuscript beschrijft methodes voor de eiwituitdrukking van FAHD in E. coli, affiniteitchromatografie, ionen uitwisselings chromatografie, de precipitatie van het ammoniumsulfaat, voorbereidende en analytische gel filtratie, kristallisatie, X-straal diffractie, en fotometrische analyses. Het doel van de hier beschreven methoden en protocollen is om richtsnoeren te geven voor wetenschappers die werkzaam zijn op diverse gebieden, zoals Bacteriologie, plantenbiologie, alsmede dierlijke en menselijke studies, om de leden van de FAH superfamilie te karakteriseren, waaronder niet-gekenmerkte Superfamily-leden moeten ze relevant worden in een bepaald gebied. De hier beschreven protocollen kunnen waardevolle ondersteuning bieden voor projecten die gericht zijn op het karakteriseren van andere prokaryote of eukaryote FAH familieleden.
De reden achter de hier beschreven methodes is het feit dat voor karakterisering van slecht beschreven proteïnen (in het bijzonder, metabolische enzymen van onbekende fysiologische relevantie), de benadering om met gezuiverde recombinante proteïnen te beginnen de ontwikkeling van onschatbare, kwalitatief hoogwaardige onderzoeksmethoden, zoals in vitro actieve enzympreparaten, hoogwaardige antilichamen en krachtige en specifieke farmacologische remmers voor geselecteerde enzymen. De beschreven methoden vereisen een snelle eiwit vloeistofchromatografie (FPLC) en X-Ray kristallografie. Alternatieve methoden (bijvoorbeeld om eiwitten te uiten zonder chemische inductie, of om de eiwit zuivering door centrifugeren na warmtebehandeling, gevolgd door ontzouten en grootte uitsluiting chromatografie), kan elders worden gevonden17. Terwijl een breder spectrum van methoden beschikbaar is voor de expressie en reiniging van Fah superfamilie enzymen2,7,9,17,18, dit werk richt zich op de expressie en reiniging van FAHD-eiwitten in het bijzonder.
In de besprekings sectie van dit manuscript, worden de katalytische mechanismen die voor het FAHD1 proteïne (hydrolase, decarboxylase)15 worden geïdentificeerd meer gedetailleerd beschreven om het chemische karakter van de gekatalysete reacties aan te tonen. De gegevens die zijn verkregen op basis van eerdere werkzaamheden7,15,18 (VOB: 6FOG, VOB: 6FOH) impliceren een derde activiteit van het enzym als Keto-Enol isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domein-bevattende proteïnen (FAHD) zijn geïdentificeerde leden van de familie FAH in eukaryoten. Enzymen van deze superfamilie over het algemeen weer te geven multi-functionaliteit, waarbij voornamelijk hydrolase en decarboxylase mechanismen. Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van FAHD eiwitten, voornamelijk FAHD Protein 1 (FAHD1) orthologues tussen soorten (mens, muis, nematoden, planten, enz.). De behandelde methodes zijn eiwituitdrukking in E. coli, affiniteitchromatografie, ionen uitwisselings chromatografie, voorbereidende en analytische gel filtratie, kristallisatie, röntgendiffractie, en fotometrische analyses. Geconcentreerd eiwit van hoge zuiverheidsniveaus (> 98%) kan voor kristallisatie of antilichamenproductie worden tewerkgesteld. De proteïnen van gelijkaardige of lagere kwaliteit kunnen in enzym analyses worden tewerkgesteld of als antigenen in opsporingssystemen worden gebruikt (westelijk-vlek, ELISA). In de bespreking van dit werk, worden de geïdentificeerde enzymatische mechanismen van FAHD1 geschetst om zijn hydrolase en decarboxylase BI-functionaliteit in meer detail te beschrijven.

Beginnend met een voor bereide het klonen vector en gekochte BL21 (DE3) PLysS E. coli, wordt de plasmide opgenomen in de bacteriën via hitte-schok of om het even welke aangewezen alternatieve methode (Figuur 1). Na een korte periode van versterking, zijn de omgezette bacteriën geplateerd op LB agar platen, om te groeien 's nachts. Platen op dit punt kan er anders uitzien, afhankelijk van een verscheidenheid van mogelijke foutbronnen. Platen kunnen leeg zijn (dat wil zeggen, geen kolonies), volledig overwoekerd door bacteriën, of iets tussen, respectievelijk. Twee voorbeelden van LB agar platen na optimale en niet-optimale transformatie zijn afgebeeld in figuur 7A. Te veel bacteriële kolonies geven ofwel dat er te veel bacteriën werden verzilverd (waarschijnlijk) of dat de antibiotica in gebruik kan worden verstreken (onwaarschijnlijk). Te weinig bacteriële kolonies kan erop wijzen dat ofwel niet genoeg plasmide werd gebruikt voor de transformatie (gebruik meer de volgende keer) of dat er te veel antibiotica werden gebruikt om de bacteriën te selecteren. In ieder geval, als kolonies aanwezig zijn, moeten ze wel goed, zoals het gebruik van twee selectieve antibiotica impliceert een vrij onbeduidende kans van ongetransformeerde bacteriën om te groeien. Geen kolonies bij allen, echter, wijst erop dat of de bacteriën hun transformatie bekwaamheid (wegens verkeerde opslag of opslag over langere periodes, herhaalde vorst en dooi, enz.) verloren, de hitte-schok niet succesvol was (geen opname van de plasmide of bacteriële dood door teveel hitte), is de het klonen vector bedorven, of door fout een verkeerde reeks selectieve antibiotica werd gebruikt (Controleer het weerstands gen op de plasmide vector).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figuur 7 : Representatieve resultaten voor bacteriën transformatie en iMac. (A) representatieve lb agar platen met getransformeerde BL21 (DE3) E. coli, verkregen door het volgen van protocol stap 1,1. Links: een bord met goed verdeelde kolonies (positief voorbeeld). Rechts: een bord met slechts een enkele kolonie (negatief voorbeeld). Witte cirkels markeren goede kolonies. De rode cirkel markeert kolonies die groeien te dicht bij elkaar en mag niet worden geplukt zolang geïsoleerde kolonies beschikbaar zijn. (B) een 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van een reeks inductie controles ("-" wijst vóór IPTG inductie aan; "+" geeft aan na IPTG inductie, vóór pellet oogst), aangepast aan gelijke hoeveelheden van het totale eiwit. Dit wordt beschreven in stap 1,2. (C) een voorbeeldige 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van ni-transatlantische zuivering van zijn-geëtiketteerde FAHD1 proteïne. Dit wordt beschreven in paragraaf 3 van het protocol. De affiniteitchromatografie levert proteïne van hoge zuiverheid (> 70%, zwarte pijl), echter, worden verscheidene kleine verontreinigingen ook waargenomen (rode pijlen). Deze verontreinigingen bestaan uit niet-FAHD eiwitten die binden aan de kolom, en van eiwitten die binden aan de FAHD-eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Gevalideerde kolonies worden geselecteerd en geplukt. Na versterking in voedend middel, wordt de eiwituitdrukking teweeggebracht door toepassing van chemische IPTG. De bacteriële pellet met de uitgedrukte eiwitten in milligram hoeveelheden wordt geoogst, en de expressie wordt geverifieerd via SDS-pagina (zie bijvoorbeeld figuur 7b). Sommige problemen kunnen optreden tijdens dit anders eenvoudige proces. Ten eerste, sommige eiwitten vormen inclusie lichamen, omdat ze blijkbaar een of andere manier interfereren met de natuurlijke stofwisseling van de gastheer bacteriën. Dit werd waargenomen voor sommige punt veranderingen van menselijke FAHD1 en FAHD2. In dergelijke gevallen, andere expressie systemen zoals insecten cellen kunnen meer geschikt en moet worden overwogen. Na het oogsten van een pellet uit insecten cellen, bijvoorbeeld, de zuivering van de eiwitten volgt dezelfde stappen als beschreven in dit protocol. Ten tweede, wordt het DE3-huisdieren systeem soms gevonden om "lekkend" te zijn (d.w.z., wordt het eiwit reeds uitgedrukt in zekere mate vóór IPTG inductie). De mogelijke reden hiervoor is niet goed begrepen, maar het kan helpen om het eiwit langzaam 's nachts uitdrukken in een koude ruimte incubator. Ten derde wordt geen proteïne uitgedrukt. Dit is waarschijnlijk het slechtst-geval scenario, aangezien het waarschijnlijk een bedorven plasmide vector en zo raadzaam aan opeenvolging de plasmide wijst.
Als een his-tag werd gebruikt om het eiwit tag, affiniteitchromatografie met ni-transatlantische agarose is een gemakkelijke en goedkope Capture methode elimineren van de meerderheid van de verontreinigingen (figuur 7C). Soortgelijke methoden bestaan voor andere tag-systemen (bijvoorbeeld, keelontsteking-II). Als geen markering werd gebruikt, kan een combinatie van de precipitatie van het ammoniumsulfaat en opeenvolgende hydrofobe uitwisselings chromatografie ook het eiwit van de meerderheid van andere proteïnen scheiden (figuur 8a). Echter, het vergelijken van de twee methoden (figuur 7C versus figuur 8a), de superioriteit van de ni-transatlantische methoden kan worden aangetoond door SDS-pagina analyse. Met behulp van zijn-gelabelde eiwitten is daarom geadviseerd.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figuur 8 : Representatieve resultaten voor FPLC experimenten (HIC, Ion Exchange, SEC). (A) een typische chromatogram en 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van hic-fenyl chromatografie na ammoniumsulfaat (als) precipitatie van untagged FAHD1 proteïne, zoals beschreven in punt 4 van het protocol. De groene lijn weerspiegelt de gradiënt van de buffer B die niet bevat als. Tijdens het proces zoals geleidelijk wordt uitgewassen uit het systeem. Vergelijking van dit paneel om figuur 7C geeft de kracht van ni-transatlantische affiniteitchromatografie in vergelijking met de HIC-fenyl methode, en het voordeel van het gebruik van een his-tag systeem voor eiwit zuivering. (B) een voorbeeldige chromatogram en 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van kationische uitwisselings chromatografie van zijn-geëtiketteerde FAHD na ni-transatlantische reiniging. Met behulp van een zout gradiënt, is de toegepaste steekproef gescheiden in individuele eiwitten. (C) een voorbeeldige chromatogram en 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van G75 grootte uitsluitings chromatografie van zijn-geëtiketteerde FAHD na kationische uitwisselings chromatografie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Achtereenvolgens, het eiwit is verder gescheiden van overgebleven verontreinigingen door kation/anion uitwisseling chromatografie (bijvoorbeeld, Zie figuur8 b), gevolgd door grootte-uitsluiting chromatografie (bijvoorbeeld, Zie figuur8 c). Het is aangeraden om in deze volgorde een initiële reinigings strategie in te stellen; echter, deze kolommen moeten worden gebruikt in combinatie, vervolgens en in variatie, totdat het eiwit is voldoende zuiver.
Eenvoudige activiteit assays, om te testen op "Ja of nee" beslissingen over actieve substraten en/of cofactoren, kan worden uitgevoerd met zijn-gelabelde eiwitten na ni-transatlantische zuivering, of niet-gecodeerde eiwitten na de Ionische uitwisseling kolom. Specifieke activiteiten en kinetische constanten moeten worden bepaald met eiwit van de hoogste zuiverheid. Kristallisatie kan met proteïnen na de Ionische uitwisselings kolom worden geprobeerd, maar de kwaliteit van kristallen correleert bijna altijd met eiwit zuiverheid. Polyclonale antilichamen kunnen in elke fase van het zuiverings Protocol tegen eiwitten worden verhoogd; Nochtans, hier correleert de kwaliteit ook met de eiwit zuiverheid.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ons protocol beschrijft methoden voor efficiënte expressie en zuivering van FAH domein met eiwitten, maar ook eiwitten in het algemeen. FHD protein-1 speelt een regulerende rol in de TCA-cyclus en het energiemetabolisme van mitochondriën. We waren in staat om FHD-1 downregulatie te koppelen aan cellulaire senescentie en informatie over enzymactiviteit en eiwitstructuur zijn over het algemeen nodig om moleculaire mechanismen achter waargenomen fenotypen te begrijpen.Het belangrijkste voordeel van het uitdrukken van eiwitten via IPTG inducible vectorsystemen is dat alle methoden relatief goedkoop en gemakkelijk te vestigen zijn in elk laboratorium. Door het gebruik van poly-histidine type eiwitten in combinatie met nikkel NTA agarose harsen, de immense selectiviteit van affiniteit chromatografie kan worden gebruikt tegen lage kosten. Voor de meeste doeleinden kan eiwit verkregen op deze kwaliteit al voldoende zijn.FPLC aan de andere handen, is een gevestigde en algemene methode met verschillende voordelen in vergelijking met andere methoden. Voeg eerst vijf tot 10 nanogram plasmide in 100 microliter van competente BL21-DE3 pLysS E.coli bacteriën op ijs. Tik iets op de buis om de inhoud te mengen.Houd de bacteriën op ijs voor 30 minuten, zachtjes tikken op de buis om de paar minuten. Verwarm een thermoshaker tot 42 graden celsius. Plaats de buis met de bacteriën in het apparaat en verwarm gedurende 90 seconden.Plaats de buis vervolgens onmiddellijk op ijs. Voeg na vijf tot tien minuten op ijs 600 microliters van NZCYM-medium toe en plaats de buis in een bacteriënbrocator. Schud de buis bij gemiddelde snelheid gericht langs de schudden richting op 37 graden Celsius voor een uur.Na incubatie, plaat 200 microliters van de bacteriële cultuur op een 10 centimeter LB agar plaat met de selectie antibiotica van keuze. Kweek de bacteriën op de LB agar plaat in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius 's nachts. Na succesvolle kolonievorming, kies een enkele kolonie en verspreid het in vijf milliliter NZCYM met de geselecteerde antibiotica.Cultuur in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius 's nachts. Na succesvolle bacteriële groei, versterken van de bacteriën in 250 milliliter, 500 milliliter of een liter partijen medium, afhankelijk van de vraag naar eiwit hoeveelheid. Dan, cultuur van de bacteriën, in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius voor twee tot drie uur.Teken na incubatie een monster voor fotometrische analyse. Als de optische dichtheid op 600 nanometer 0,4 heeft bereikt, moet u 200 micromolar toepassen tot één millimolar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Na drie tot vijf uur meer in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius eiwit expressie is uitgeput.Oogst de bacteriële pellet via centrifugatie op 5.000 keer G gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en bevries de pellet bij min 20 graden Celsius voor korte opslag. Voor elke 250 milliliter originele bacteriële suspensie, breng vijf milliliter van de geselecteerde buffer aan op de bacteriële pellet.Voeg 10 microliter bèta-mercaptoethanol per vijf milliliter toegepaste buffer toe. Gebruik een Pasteur pipet van 10 milliliter om de pellet mechanisch in ophanging te dwingen door krassen en pipetten. Breng alle ophanging over naar een buis van 50 milliliter.Dan sonicate de schorsing. Vervolgens centrifuge gedurende 30 minuten op hoge snelheid bij vier graden Celsius. Filter de supernatant achtereenvolgens met filterunits op ijs.Bereid een lege plastic of glazen kolom door het te bevestigen aan een stabiele retainer en wassen met nikkel NTA lopende buffer. Voor elke 10 milliliter eiwit suspensie van toepassing 500 microliter nikkel NTA agarose drijfmest op de kolom. Vul de kolom volledig met nikkel NTA lopende buffer ervoor te zorgen niet te verstoren de agarose hars en laat de buffer te lopen door de zwaartekracht.Breng vervolgens de eiwitsuspensie aan op de kolom en laat het monster door de zwaartekracht lopen. Nadat het monster is doorgegeven, vul de kolom met nikkel NTA lopende buffer. Plaats een UV transparante cuvette onder de kolom en verzamel een milliliter nikkel NTA elutie buffer.Controleer de optische dichtheid van het monster op 280 nanometer ten opzichte van een blanco monster. Optimaal geeft het monster een optische dichtheid van meer dan 2,5 weer. Aangezien FAHD-eiwitten en nikkel NTA elutiebuffer neerslaan bij het bevriezen en ontdooien, dialyseert het eiwit tegen een andere buffer 's nachts op ijs met behulp van een microliter DTT per 100 milliliter dialysebuffer.Stel een FPLC-systeem in en was de kolom met vijf kolomvolumes van 20% ethanol, gevolgd door vijf kolomvolumes water. Nadat u de kolom in evenwicht hebt gebracht, past u het dialyseerde monster toe op de kolom en verzamelt u de stroom door. Stel een verloopeution in.Nadat het verloop is voltooid, wordt u uitgevoerd met een hoge zoutbuffer totdat er geen pieken meer worden gedetecteerd over het bereik van één kolomvolume. Start een micro-plaatlezer en equilibrate gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius. Bereid een milliliter van een 20 millimolar oplossing van een substraat te worden getest in enzym test buffer.Volgens het pipettingschema in het tekstprotocol, bereid het enzym leeg en monster putten door pipet 90 microliters van enzym test buffer in de putten met vijf microliters van enzym oplossing. Bereid vervolgens het substraat leeg en monster putten door pipet 95 microliters van enzym test buffer in de putten. Breng vlak voor het meten vijf microliters enzymtestbuffer aan op de zes lege putten.Breng vijf microliter van de 20 millimolar substraatoplossing aan op de monsterputten. Gebruik een multi-channel pipet op 50 microliter instelling om voorzichtig mengen de putten. Steek vervolgens de plaat in de microplaatlezer en meet elke put op 255 nanometer.Ten slotte voert u de analyse uit in een spreadsheet. Twee voorbeelden LB agar platen na optimale en niet-optimale transformatie worden hier afgebeeld. Te veel bacteriële kolonies geven ofwel aan dat twee veel bacteriën werden verguld of dat de antibiotica kunnen worden verlopen.Te weinig bacteriële kolonies kunnen erop wijzen dat ofwel niet genoeg plasmide werd gebruikt voor de transformatie of dat te veel antibiotica werden gebruikt om de bacteriën te selecteren. De bacteriële pellet die het uitgedrukte eiwit in milligramhoeveelheden bevat, wordt geoogst en expressie wordt geverifieerd via SDS-pagina. Sommige problemen kunnen optreden tijdens dit anders eenvoudige proces, met inbegrip van de eiwitten vormen opname lichamen of het eiwit niet wordt uitgedrukt.Als een His-tag wordt gebruikt om het eiwit tag, affiniteit chromatografie met nikkel NTA agarose is een eenvoudige en goedkope capture methode elimineren van de meerderheid van de verontreinigingen. Als er geen tag wordt gebruikt, kan een combinatie van ammoniumsulfaatneerslag en een opeenvolgende hydrofobe uitwisselingschromatografie het eiwit ook scheiden van de meerderheid van andere eiwitten. Het eiwit wordt verder gescheiden van restantenbesmettingen door ionuitwisselingschromatografie gevolgd door de chromatografie van de grootteuitsluiting om een voldoende zuiver eiwit te verkrijgen.Geen van de beschreven methoden is moeilijk in het bijzonder. Maar alle methoden vereisen training. Eerste pogingen kunnen mislukken, maar de experimenten zullen slagen na een aantal extra aanpassingen.Alle hier gepresenteerde methoden zijn algemene methoden van eiwitzuivering. Hoewel gespecialiseerd voor FAHD-eiwitten, kan het protocol worden aangepast aan elk eiwit dat men zou willen zuiveren. Recombinant menselijke FAHD-1 is verkregen door de beschreven methoden en hoge resolutie x-ray structuren massaal bijgedragen aan ons begrip van FAHD-1 door functionaliteit die fungeert als beide, decarboxylase en hydrolase.Bacteriën die in dit werk worden gebruikt zijn veiligheidsstammen en niet gevaarlijk. Algemene veiligheidshandleidingen zijn van toepassing op alle chemicaliën en FPLC-kolommen moeten met zorg worden behandeld.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Proteïne Expressie, Kristallisatie en Biofysische Studies van a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conserveerd nucleotide pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...