Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Les auteurs sont très reconnaissants pour l'assistance technique experte par Annabella Pittl et le développement de la méthode pilote par Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. 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K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer et ne déclarent aucun intérêt financier concurrent. H. G. est CEOCSO chez MoleculeCrafting.HuGs e.U. et a fourni des acylpyruvates pour cette étude par synthèse personnalisée. Les travaux du laboratoire de P. J. D. ont été soutenus par le Fonds autrichien pour la science (FWF) : numéro de projet P 31582-B26. Les frais de publication de ce manuscrit ont été en partie couverts par le Fonds scientifique autrichien (FWF) sous le numéro de projet P 31582-B26. A. N. et B. R. sont soutenus par le Fonds scientifique autrichien (FWF) dans le cadre du projet P28395-B26.

Le fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)1,2 superfamille d'enzymes décrit un groupe d'enzymes qui partagent le domaine CATalytique fah hautement conservé3,4,5,6 , 7 Annonces , 8 Annonces , 9 (en) , 10. Malgré leur centre catalytique commun, ces enzymes sont multifonctionnelles, et la plupart se trouvent dans les procaryotes, où elles sont utilisées pour décomposer les composés extraits de sources de carbone complexes3. Seulement trois membres de cette famille ont été identifiés dans les eucaryotes à ce jour: le nom donnant FAH2, ainsi que FAH protéine contenant le domaine 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 et FAH protéine contenant le domaine 2 (FAHD2). L'épuisement de FAHD1 a été associé à la respiration mitochondriale altérée13,16 et associé à un type réversible de phénotype14 de sénescence cellulaire qui est lié au potentiel intermédiaire lacunes dans le système de transport d'électrons. La FAHD1 humaine et ses orthologues dans les systèmes modèles (souris, nématode, lignées de cellules cancéreuses, plantes, etc.), ainsi que certaines variantes de mutation ponctuelle, sont devenus des cibles médicamenteuses d'intérêt potentiel. Pour cette recherche, les protéines recombinantes à des niveaux élevés de pureté, ainsi que des informations sur les mécanismes catalytiques guidés par des structures cristallines et des anticorps sélectifs sont vitales.
Ce manuscrit décrit des méthodes pour l'expression de protéine de FAHD dans E.coli, chromatographie d'affinité, chromatographie d'échange d'ion, précipitation de sulfate d'ammonium, filtration préparative et analytique de gel, cristallisation, diffraction de rayon X, et essais photométriques. Le but des méthodes et des protocoles décrits ici est de fournir des conseils aux scientifiques travaillant dans divers domaines tels que la bactériologie, la biologie végétale, ainsi que les études animales et humaines, pour caractériser les membres de la superfamille FAH, y compris les membres non caractérisés de la superfamille s'ils deviennent pertinents dans un domaine particulier. Les protocoles décrits ici peuvent fournir un soutien précieux pour des projets visant à caractériser d'autres membres de la superfamille de la FAH procaryotique ou eucaryotique.
La raison d'être des méthodes décrites ici est le fait que pour la caractérisation des protéines mal décrites (en particulier, les enzymes métaboliques d'une pertinence physiologique inconnue), l'approche pour commencer avec des protéines recombinantes purifiées permet à la développement d'outils de recherche inestimables et de haute qualité tels que des préparations d'enzymes actives in vitro, des anticorps de haute qualité et des inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques pour certaines enzymes. Les méthodes décrites exigent la chromatographie liquide rapide de protéine (FPLC) et la cristallographie de rayon X. Des méthodes alternatives (p. ex., pour exprimer des protéines sans induction chimique, ou pour afficher la purification des protéines par centrifugation après traitement thermique suivi d'une chromatographie de dessalement et d'exclusion de la taille), peuvent être trouvées ailleurs17. Alors qu'un plus large éventail de méthodes est disponible pour l'expression et la purification des enzymes de superfamille FAH2,7,9,17,18, ce travail se concentre sur l'expression et purification des protéines FAHD en particulier.
Dans la section de discussion de ce manuscrit, les mécanismes catalytiques identifiés pour la protéine FAHD1 (hydrolase, decarboxylase)15 sont décrits plus en détail, afin de démontrer le caractère chimique des réactions catalysées. Les données obtenues sur la base des travaux précédents7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) impliquent une troisième activité de l'enzyme comme l'isomérase keto-enol.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) protéines contenant du domaine (FAHD) sont identifiés membres de la superfamille FAH dans les eucaryotes. Les enzymes de cette superfamille affichent généralement des fonctionnalités multiples, impliquant principalement des mécanismes d'hydrolase et de décarboxylase. Cet article présente une série de méthodes consécutives pour l'expression et la purification des protéines FAHD, principalement des orthologues de protéines FAHD 1 (FAHD1) parmi les espèces (humains, souris, nématodes, plantes, etc.). Les méthodes couvertes sont l'expression de protéine dans E.coli, la chromatographie d'affinité, la chromatographie d'échange d'ion, la filtration préparative et analytique de gel, la cristallisation, la diffraction de rayon X, et les essais photométriques. Protéines concentrées de niveaux élevés de pureté peut être utilisé pour la cristallisation ou la production d'anticorps. Les protéines de qualité similaire ou inférieure peuvent être utilisées dans des analyses enzymatiques ou utilisées comme antigènes dans les systèmes de détection (Western-Blot, ELISA). Dans la discussion de ce travail, les mécanismes enzymatiques identifiés de FAHD1 sont décrits pour décrire sa bi-fonctionnalité d'hydrolase et de decarboxylase plus en détail.

Commençant par un vecteur de clonage préparé et acheté BL21(DE3) pLysS E. coli, le plasmide est inséré dans la bactérie par le choc thermique ou toute autre méthode appropriée (Figure 1). Après une courte période d'amplification, les bactéries transformées sont plaquées sur des plaques d'agar LB, afin de croître du jour au lendemain. Les plaques à ce stade peuvent sembler différentes, selon une variété de sources d'erreurs potentielles. Les plaques peuvent être vides (c.-à-d. pas de colonies), complètement envahies par des bactéries, ou quelque chose entre les deux, respectivement. Deux exemples de plaques d'agar LB après transformation optimale et non optimale sont décrits dans la figure 7A. Trop de colonies bactériennes indiquent soit qu'un trop grand nombre de bactéries ont été plaquées (probablement) ou que les antibiotiques utilisés peuvent être expirés (peu probable). Trop peu de colonies bactériennes peuvent indiquer que soit pas assez de plasmide a été utilisé pour la transformation (utiliser plus la prochaine fois) ou que trop d'antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner les bactéries. Dans tous les cas, si des colonies sont présentes, elles devraient être fines, car l'utilisation de deux antibiotiques sélectifs implique une chance plutôt insignifiante de bactéries non transformées de se développer. Aucune colonie n'indique toutefois que les bactéries ont perdu leur compétence en matière de transformation (en raison d'un mauvais stockage ou d'un mauvais stockage sur de plus longues périodes, d'un gel et d'un dégel répétitifs, etc.), le choc thermique n'a pas été couronné de succès (pas d'apport plasmique ou bactérien mort par trop de chaleur), le vecteur de clonage est corrompu, ou par erreur un mauvais ensemble d'antibiotiques sélectifs a été utilisé (vérifier le gène de résistance sur le vecteur plasmide).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figure 7 : Résultats représentatifs pour la transformation des bactéries et l'IMAC. (A) Plaques d'agar LB représentatives avec BL21(DE3) E. colitransformé, obtenue en suivant l'étape 1.1 du protocole. Gauche : Une plaque avec des colonies bien réparties (exemple positif). Droite : Une plaque avec une seule colonie (exemple négatif). Les cercles blancs marquent les bonnes colonies. Le cercle rouge marque les colonies qui grandissent trop près les unes des autres et ne doivent pas être cueillies tant que des colonies isolées sont disponibles. (B) Une analyse SDS-PAGE de 12,5 % d'acrylamide d'une série de contrôles d'induction (« -» indique avant l'induction de l'IPTG; « » indique après l'induction de l'IPTG, avant la récolte des granulés), ajusté à des quantités égales de protéines totales. Ceci est décrit à l'étape 1.2. (C) Une analyse exemplaire de 12,5% d'acrylamide SDS-PAGE de la purification de Ni-NTA de saprotéine FAHD1 marquée. Ceci est décrit à la section 3 du protocole. La chromatographie d'affinité donne des protéines de haute pureté (-gt;70%, flèche noire), cependant, plusieurs petites contaminations sont également observées (flèches rouges). Ces contaminations se composent de protéines non-FAHD qui se lient à la colonne, et de protéines qui se lient à la protéine FAHD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Les colonies validées sont sélectionnées et cueillies. Après amplification dans le milieu nourrissant, l'expression de protéine est déclenchée par l'application de l'IPTG chimique. La granule bactérienne contenant la protéine exprimée en quantités milligrammes est récoltée, et l'expression est vérifiée via SDS-PAGE (voir par exemple Figure 7B). Certains problèmes peuvent se produire au cours de ce processus autrement simple. Tout d'abord, certaines protéines forment des corps d'inclusion, parce qu'ils semblent en quelque sorte interférer avec le métabolisme naturel des bactéries hôtes. Ceci a été observé pour quelques mutations ponctuelles de FAHD1 humain et de FAHD2. Dans de tels cas, d'autres systèmes d'expression comme les cellules d'insectes peuvent être plus appropriés et devraient être considérés. Après la récolte d'une pastille à partir de cellules d'insectes, par exemple, la purification des protéines suit les mêmes étapes que décrites dans ce protocole. Deuxièmement, le système DE3-pET est parfois jugé « fuyant » (c.-à-d. que les protéines sont déjà exprimées dans une certaine mesure avant l'induction de l'IPTG). La raison potentielle de ceci n'est pas bien comprise, mais elle peut aider à exprimer la protéine lentement pendant la nuit dans un incubateur de chambre froide. Troisièmement, aucune protéine n'est exprimée. C'est probablement le pire scénario, car il indique probablement un vecteur plasmide corrompu et donc conseillé de séquencer le plasmide.
Si un His-tag a été utilisé pour marquer la protéine, chromatographie d'affinité avec Ni-NTA agarose est une méthode de capture facile et bon marché éliminant la majorité des contaminations (Figure 7C). Des méthodes similaires existent pour d'autres systèmes d'étiquettes (p. ex., STREP-II). Si aucune étiquette n'a été utilisée, une combinaison de précipitations de sulfate d'ammonium et de chromatographie hydrophobe consécutive d'échange peut également séparer la protéine de la majorité des autres protéines (figure 8A). Toutefois, la comparaison des deux méthodes (figure7C vs figure 8A),la supériorité des méthodes Ni-NTA peut être démontrée par l'analyse SDS-PAGE. L'utilisation de saprotéine étiquetée est donc conseillée.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figure 8 : Résultats représentatifs des expériences FPLC (HIC, échange d'ions, SEC). (A) Un chromatogramme typique et 12,5% analyse sDS-PAGE d'acrylamide-PAGE de chromatographie HIC-phényl après précipitation de sulfate d'ammonium (AS) de la protéine FAHD1 non étiquetée, comme décrit dans la section 4 du protocole. La ligne verte reflète le gradient de tampon B qui ne contient pas as. Pendant le processus AS est progressivement lavé du système. La comparaison de ce panneau à la figure 7C montre la puissance de la chromatographie d'affinité Ni-NTA par rapport à la méthode HIC-phényl, et l'avantage d'utiliser un système His-tag pour la purification des protéines. (B) Un chromatogramme exemplaire et 12,5% analyse acrylamide SDS-PAGE de la chromatographie d'échange cationic de son-marqué FAHD suivant la purification de Ni-NTA. À l'aide d'un gradient de sel, l'échantillon appliqué est séparé en protéines individuelles. (C) Un chromatogramme exemplaire et 12,5% analyse sDS-PAGE d'acrylamide-PAGE de chromatographie d'exclusion de taille de G75 de sonFAHD marqué suivant la chromatographie d'échange cationic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Consécutivement, la protéine est encore séparée des contaminations restantes par chromatographie d'échange de cation/anion (par exemple, voir Figure 8B), suivie de la chromatographie d'exclusion de taille (par exemple, voir Figure 8C). Il est conseillé de mettre en place une stratégie initiale de purification dans cet ordre; cependant, ces colonnes doivent être utilisées en combinaison, par la suite et dans la variation, jusqu'à ce que la protéine soit suffisamment pure.
Des analyses d'activité simples, afin de tester les décisions « oui ou non » sur les substrats actifs et/ou les cofacteurs, peuvent être effectuées avec sesprotéines étiquetées après la purification de Ni-NTA, ou des protéines non étiquetées après la colonne d'échange ionique. Les activités spécifiques et les constantes cinétiques doivent être déterminées avec des protéines de la plus haute pureté. La cristallisation peut être tentée avec des protéines après la colonne d'échange ionique, mais la qualité des cristaux est presque toujours en corrélation avec la pureté des protéines. Les anticorps polyclonales peuvent être soulevés contre les protéines à n'importe quel stade du protocole de purification; cependant, ici la qualité est également en corrélation avec la pureté des protéines.

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

L'expression et la purification des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate sont décrites avec des exemples (expression dans E. coli, FPLC). Les protéines purifiées sont utilisées pour la cristallisation et la production d'anticorps et utilisées pour les analyses d'enzymes. Des essais photométriques sélectionnés sont présentés pour afficher la multifonctionnalité de FAHD1 comme oxaloacetate decarboxylase et hydrolase d'acylpyruvate.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Notre protocole décrit les méthodes d’expression et de purification efficaces du domaine FAH contenant des protéines mais aussi des protéines en général. FHD protein-1 joue un rôle de régulation dans le cycle TCA et le métabolisme énergétique des mitochondries. Nous avons pu associer la downregulation FHD-1 à la sénescence cellulaire et des informations sur l’activité enzymatique et la structure protéique sont généralement nécessaires afin de comprendre les mécanismes moléculaires derrière les phénotypes observés.Le principal avantage de l’expression des protéines par l’intermédiaire de systèmes vectoriels inductibles IPTG est que toutes les méthodes sont relativement bon marché et faciles à établir dans n’importe quel laboratoire. En utilisant des protéines de type poly-histidine en combinaison avec des résines d’agarose NTA nickel, l’immense sélectivité de la chromatographie d’affinité peut être utilisée à faible coût. Pour la plupart des fins, les protéines obtenues à cette qualité peuvent déjà suffire.FPLC sur les autres mains, est une méthode bien établie et générale avec plusieurs avantages par rapport à d’autres méthodes. Tout d’abord, insérez de cinq à 10 nanogrammes de plasmide dans 100 microlitres de bactéries BL21-DE3 pLysS E.coli compétentes sur la glace. Appuyez légèrement sur le tube pour mélanger le contenu.Gardez les bactéries sur la glace pendant 30 minutes, en tapant doucement sur le tube toutes les quelques minutes. Chauffer un thermo-shaker à 42 degrés Celsius. Placez le tube contenant les bactéries dans l’appareil et chauffez pendant 90 secondes.Ensuite, placez le tube sur la glace immédiatement. Après cinq à dix minutes sur la glace, ajouter 600 microlitres de NZCYM moyen et placer le tube dans un incubateur de bactéries. Secouez le tube à vitesse moyenne orienté le long de la direction secouant à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après incubation, plaque 200 microlitres de la culture bactérienne sur une plaque d’agar de 10 centimètres LB contenant les antibiotiques de sélection de choix. Culture des bactéries sur la plaque d’agar LB dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après la formation réussie de la colonie, choisissez une seule colonie et dispersez-la en cinq millilitres de NZCYM avec les antibiotiques sélectionnés.Culture dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une croissance bactérienne réussie, amplifier les bactéries en lots de 250 millilitres, 500 millilitres ou un litre de milieu selon la demande de protéines. Ensuite, la culture de la bactérie, dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures.Après l’incubation, dessiner un échantillon pour l’analyse photométrique. Si la densité optique à 600 nanomètres a atteint 0,4, appliquer 200 micromolaires jusqu’à un millimolaire d’isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranosid. Après trois à cinq heures de plus dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius expression des protéines est épuisé.Récoltez la pastille bactérienne par centrifugation à 5000 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le supernatant et congelez la pastille à moins 20 degrés Celsius pour un bref stockage. Pour chaque 250 millilitres de suspension bactérienne originale, appliquez cinq millilitres du tampon sélectionné sur la pastille bactérienne.Ajouter 10 microlitres de bêta-mercaptoéthanol par cinq millilitres de tampon appliqué. Utilisez un tuyau Pasteur de 10 millilitres pour forcer mécaniquement la pastille en suspension en grattant et en pipetting. Transférer toute la suspension dans un tube de 50 millilitres.Puis sonicate la suspension. Ensuite, centrifugeuse pendant 30 minutes à grande vitesse à quatre degrés Celsius. Filtrer le supernatant consécutivement avec des unités filtrantes sur la glace.Préparez une colonne en plastique ou en verre vide en l’attachant à un retenue stable et en lavant avec un tampon de fonctionnement NTA nickel. Pour chaque 10 millilitres de suspension protéique appliquer 500 microlitres de boue d’agarose NTA nickel à la colonne. Remplissez complètement la colonne avec du tampon de fonctionnement nickel NTA assurant de ne pas perturber la résine agarose et de permettre au tampon de passer par gravité.Ensuite, appliquez la suspension protéique sur la colonne et laissez l’échantillon passer par gravité. Une fois l’échantillon passé, remplissez la colonne d’un tampon de fonctionnement nickel NTA. Placez une cuvette transparente UV sous la colonne et recueillez un millilitre de tampon d’élitution NTA nickel.Vérifiez la densité optique de l’échantillon à 280 nanomètres par rapport à un échantillon vierge. De façon optimale, l’échantillon affiche une densité optique supérieure à 2,5. Étant donné que les protéines FAHD et le tampon d’élitution du nickel NTA se précipiteront lors de la congélation et de la décongélation, dialysez la protéine contre un tampon différent pendant la nuit sur la glace à l’aide d’un microlitre de TNT par 100 millilitres de tampon de dialyse.Mettre en place un système FPLC et laver la colonne avec cinq volumes de colonne de 20% d’éthanol suivie de cinq volumes de colonne d’eau. Après avoir équilibré la colonne, appliquez l’échantillon dialysé sur la colonne et recueillez le flux à travers. Configurer une elution de gradient.Une fois le gradient terminé, courez avec un tampon de sel élevé jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de pics détectés sur la plage d’un volume de colonne. Démarrez un lecteur de micro-plaques et équilibrez pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius. Préparez un millilitre d’une solution de 20 millimlaires d’un substrat à tester dans le tampon d’analyse enzymatique.Selon le schéma de pipetage dans le protocole de texte, préparer l’enzyme vierge et échantillonner les puits en pipetant 90 microlitres de tampon d’analyse enzymatique dans les puits avec cinq microlitres de solution enzymatique. Ensuite, préparez le substrat vierge et échantillonner les puits en pipetant 95 microlitres de tampon d’analyse enzymatique dans les puits. Juste avant de mesurer, appliquez cinq microlitres de tampon d’analyse enzymatique sur les six puits vierges.Appliquer cinq microlitres de la solution de substrat de 20 millimlaires sur les puits de l’échantillon. Utilisez un pipet multicanal à réglage de 50 microlitres pour mélanger délicatement les puits. Ensuite, insérez la plaque dans le lecteur de micro-plaque et mesurez chaque puits à 255 nanomètres.Enfin, effectuez l’analyse dans une feuille de calcul. Deux exemples de plaques d’agar LB après transformation optimale et non optimale sont représentés ici. Trop de colonies bactériennes indiquent soit que deux nombreuses bactéries ont été plaquées, soit que les antibiotiques peuvent être expirés.Trop peu de colonies bactériennes peuvent indiquer que ni assez de plasmide n’a été utilisé pour la transformation, soit que trop d’antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner les bactéries. La pastille bactérienne contenant la protéine exprimée en quantités milligrammes est récoltée et l’expression est vérifiée via la page SDS. Certains problèmes peuvent survenir au cours de ce processus autrement simple, y compris les protéines formant des organismes d’inclusion ou la protéine n’étant pas exprimée.Si un his-tag est utilisé pour étiqueter la protéine, la chromatographie d’affinité avec le nickel NTA agarose est une méthode de capture facile et bon marché éliminant la majorité des contaminations. Si aucune étiquette n’est utilisée, une combinaison de précipitations de sulfate d’ammonium et d’une chromatographie d’échange hydrophobe consécutive peut également séparer la protéine de la majorité des autres protéines. La protéine est encore séparée des restes de contaminations par chromatographie d’échange d’ion suivie de la chromatographie d’exclusion de taille pour obtenir une protéine suffisamment pure.Aucune des méthodes décrites n’est difficile en particulier. Mais toutes les méthodes nécessitent une formation. Les premières tentatives peuvent échouer, mais les expériences réussiront après quelques adaptations supplémentaires.Toutes les méthodes présentées ici sont des méthodes générales de purification des protéines. Bien que spécialisé pour les protéines FAHD, le protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine que l’on voudrait purifier. Fahd-1 humain recombinant a été obtenu par les méthodes décrites et les structures de rayon X à haute résolution ont contribué massivement à notre compréhension de FAHD-1 par la fonctionnalité agissant comme les deux, la décarie et l’hydrolase.Les bactéries utilisées dans ce travail sont des souches de sécurité et non dangereuses. Les guides généraux de sécurité s’appliquent à tous les produits chimiques et les colonnes FPLC doivent être manipulées avec soin.

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