Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Die Autoren sind sehr dankbar für die fachkundige technische Unterstützung durch Annabella Pittl und die Pilotmethodenentwicklung von Haymo Pircher.

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	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten und erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen. H. G. ist CEOCSO bei MoleculeCrafting.HuGs e.U. und stellte Acylpyruvate für diese Studie über die kundenspezifische Synthese zur Verfügung. Die Arbeit im Labor von P. J. D. wurde vom Wissenschaftsfonds (FWF) unterstützt: Projektnummer P 31582-B26. Die Veröffentlichungsgebühren für dieses Manuskript wurden teilweise vom Wissenschaftsfonds (FWF) unter der Projektnummer P 31582-B26 übernommen. A. N. und B. R. werden vom Wissenschaftsfonds (FWF) im Rahmen des Projekts P28395-B26 unterstützt.

Die Fumarylacetoacetathydrolase (FAH)1,2 Überfamilie von Enzymen beschreibt eine Gruppe von Enzymen, die die hochkonservierte katalytische FAH-Domäne3,4,5,6 teilen , 7 , 8 , 9 , 10. Trotz ihrer gemeinsamen katalytischen Zentrum, Diese Enzyme sind multifunktional, und die meisten sind in Prokaryotengefunden, wo sie verwendet werden, um Verbindungen aus komplexen Kohlenstoffquellen abgerufen 3 . Nur drei Mitglieder dieser Familie wurden bisher in Eukaryoten identifiziert: der Name, der FAH2gibt, sowie DAS FAH-Domänenhaltige Protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 und FAH-Domänen-haltiges Protein 2 (FAHD2). Die Erschöpfung von FAHD1 wurde mit einer beeinträchtigten mitochondrialen Atmung13,16 und mit einer reversiblen Art von zellulärem Seneszenzpnotyp14 in Verbindung gebracht, der mit dem Zwischenpotential Mängel im Elektronentransportsystem. Human FAHD1 und seine Orthologe in Modellsystemen (Maus, Nematode, Krebszelllinien, Pflanzen, etc.) sowie ausgewählte Punktmutationsvarianten sind zu medikamentenfähigen Zielen von potenziellem Interesse geworden. Für diese Forschung sind rekombinantes Protein bei hoher Reinheit sowie Informationen über katalytische Mechanismen, die von Kristallstrukturen und selektiven Antikörpern geleitet werden, von entscheidender Bedeutung.
Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur FAHD-Proteinexpression in E. coli, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Ammoniumsulfatfällung, präparative und analytische Gelfiltration, Kristallisation, Röntgenbeugung und photometrische Assays. Der Zweck der hier beschriebenen Methoden und Protokolle besteht darin, Wissenschaftlern, die in verschiedenen Bereichen wie Bakteriologie, Pflanzenbiologie sowie Tier- und Humanstudien arbeiten, Orientierungshilfen zu geben, um Mitglieder der FAH-Überfamilie zu charakterisieren, uncharakterisierte Überfamilienmitglieder, wenn sie in einem bestimmten Bereich relevant werden. Die hier beschriebenen Protokolle können wertvolle Unterstützung für Projekte bieten, die darauf abzielen, andere prokaryotische oder eukaryotische FA-Überfamilienmitgliedn zu charakterisieren.
Der Grund gedanke hinter den hier beschriebenen Methoden ist die Tatsache, dass für die Charakterisierung schlecht beschriebener Proteine (insbesondere metabolische Enzyme von unbekannter physiologischer Relevanz) der Ansatz, mit gereinigten rekombinanten Proteinen zu beginnen, die Entwicklung von unschätzbaren, qualitativ hochwertigen Forschungsinstrumenten wie in vitro aktiven Enzympräparaten, hochwertigen Antikörpern und potenten und spezifischen pharmakologischen Inhibitoren für ausgewählte Enzyme. Die beschriebenen Methoden erfordern eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) und Röntgenkristallographie. Alternative Methoden (z.B. zur Expression von Protein ohne chemische Induktion oder zur Anzeige der Proteinreinigung durch Zentrifugation nach Wärmebehandlung, gefolgt von Entsalzung und Größenausschlusschromatographie), können an anderer Stelle gefunden werden17. Während ein breiteres Spektrum von Methoden für die Expression und Reinigung von FAH-Superfamilienenzymen2,7,9,17,18zur Verfügung steht, konzentriert sich diese Arbeit auf die Expression und insbesondere die Reinigung von FAHD-Proteinen.
Im Diskussionsteil dieses Manuskripts werden die für das FAHD1-Protein (Hydrolase, Decarboxylase)15 identifizierten katalytischen Mechanismen ausführlicher beschrieben, um den chemischen Charakter der katalysierten Reaktionen zu demonstrieren. Die auf früheren Arbeiten7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) gewonnenen Daten implizieren eine dritte Aktivität des Enzyms als Keto-Enol-Isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Fumarylacetoacetathydrolase (FAH) domänenhaltige Proteine (FAHD) sind identifizierte Mitglieder der FAH-Überfamilie in Eukaryoten. Enzyme dieser Superfamilie zeigen in der Regel Multifunktionalität, die hauptsächlich Hydrolase- und Decarboxylase-Mechanismen beinhalten. Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von FAHD-Proteinen dar, hauptsächlich FAHD-Protein 1 (FAHD1) Orthologen unter Arten (Mensch, Maus, Nematoden, Pflanzen, etc.). Abgedeckte Methoden sind Proteinexpression in E. coli, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, präparative und analytische Gelfiltration, Kristallisation, Röntgenbeugung und photometrische Assays. Konzentriertes Protein mit hohem Reinheitsgrad (>98%) kann für die Kristallisation oder Antikörperproduktion verwendet werden. Proteine ähnlicher oder niedrigerer Qualität können in Enzymtests oder als Antigene in Detektionssystemen (Western-Blot, ELISA) verwendet werden. In der Diskussion dieser Arbeit werden die identifizierten enzymatischen Mechanismen von FAHD1 skizziert, um seine Hydrolase und Decarboxylase-Bifunktionalität genauer zu beschreiben.

Beginnend mit einem vorbereiteten Klonvektor und gekauftem BL21(DE3) pLysS E. coliwird das Plasmid über Einen Hitzeschock oder eine geeignete alternative Methode in die Bakterien eingeführt (Abbildung 1). Nach einer kurzen Phase der Verstärkung werden die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten plattiert, um über Nacht zu wachsen. Platten an dieser Stelle können unterschiedlich aussehen, abhängig von einer Vielzahl von potenziellen Fehlerquellen. Platten können leer sein (d.h. keine Kolonien), völlig von Bakterien überwuchert, oder etwas dazwischen, bzw. etwas dazwischen. Zwei Beispiele von LB-Agarplatten nach optimaler und nicht optimaler Transformation sind in Abbildung 7Adargestellt. Zu viele Bakterienkolonien deuten darauf hin, dass entweder zu viele Bakterien plattiert wurden (wahrscheinlich) oder dass die verwendeten Antibiotika abgelaufen sein können (unwahrscheinlich). Zu wenige Bakterienkolonien können darauf hindeuten, dass entweder nicht genügend Plasmid für die Transformation verwendet wurde (verwenden Sie beim nächsten Mal mehr) oder dass zu viele Antibiotika verwendet wurden, um die Bakterien auszuwählen. In jedem Fall, wenn Kolonien vorhanden sind, sollten sie in Ordnung sein, da die Verwendung von zwei selektiven Antibiotika eine ziemlich unbedeutende Chance von untransformierten Bakterien impliziert, zu wachsen. Keine Kolonien deutet jedoch darauf hin, dass entweder die Bakterien ihre Transformationskompetenz verloren haben (wegen falscher Lagerung oder Lagerung über längere Zeiträume, wiederholtes Einfrieren und Tauwetter usw.), der Hitzeschock war nicht erfolgreich (keine Plasmidaufnahme oder bakterielle Tod durch zu viel Hitze), ist der Klonvektor korrumpiert, oder versehentlich wurde ein falscher Satz selektiver Antibiotika verwendet (verifizieren Sie das Resistenzgen auf dem Plasmidvektor).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Abbildung 7 : Repräsentative Ergebnisse für die Bakterientransformation und IMAC. (A) Repräsentative LB-Agarplatten mit transformiertem BL21(DE3) E. coli, erhalten durch Protokollschritt 1.1. Links: Eine Platte mit gut verteilten Kolonien (positives Beispiel). Rechts: Eine Platte mit nur einer einzigen Kolonie (negatives Beispiel). Weiße Kreise markieren gute Kolonien. Der rote Kreis markiert Kolonien, die zu nah beieinander wachsen und nicht gepflückt werden sollten, solange isolierte Kolonien verfügbar sind. (B) Eine 12,5%-Acrylamid-SDS-PAGE-Analyse einer Reihe von Induktionskontrollen ("-" zeigt vor IPTG-Induktion; "+" zeigt nach der IPTG-Induktion vor der Pelleternte an, angepasst an die gleichen Mengen des Gesamtproteins. Dies wird in Schritt 1.2 beschrieben. (C) Eine beispielhafte 12,5% Acrylamid SDS-PAGE Analyse der Ni-NTA-Reinigung seines-tagged FAHD1 Proteins. Dies wird in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Die Affinitätschromatographie liefert Protein von hoher Reinheit (>70%, schwarzer Pfeil), aber auch einige kleine Verunreinigungen werden beobachtet (rote Pfeile). Diese Kontaminationen bestehen aus Nicht-FAHD-Proteinen, die an die Säule binden, und aus Proteinen, die an das FAHD-Protein binden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Validierte Kolonien werden ausgewählt und ausgewählt. Nach der Amplifikation im nährenden Medium wird die Proteinexpression durch Anwendung der Chemikalie IPTG ausgelöst. Das bakterielle Pellet, das das exprimierte Protein in Milligrammmengen enthält, wird geerntet und die Expression wird über SDS-PAGE überprüft (siehe z.B. Abbildung 7B). Einige Probleme können während dieses ansonsten einfachen Prozesses auftreten. Erstens bilden einige Proteine Inklusionskörper, weil sie offenbar irgendwie den natürlichen Stoffwechsel der Wirtsbakterien stören. Dies wurde bei einigen Punktmutationen von humanen FAHD1 und FAHD2 beobachtet. In solchen Fällen können andere Expressionssysteme wie Insektenzellen geeigneter sein und sollten in Betracht gezogen werden. Nach der Ernte eines Pellets aus Insektenzellen beispielsweise folgt die Reinigung der Proteine den gleichen Schritten wie in diesem Protokoll beschrieben. Zweitens wird das DE3-pET-System manchmal als "leaky" (d. h. Protein wird bereits in gewissem Umfang vor der IPTG-Induktion exprimiert) gefunden. Der mögliche Grund dafür ist nicht gut verstanden, aber es kann helfen, das Protein langsam über Nacht in einem KaltenRaum-Inkubator auszudrücken. Drittens wird kein Protein exprimiert. Dies ist wahrscheinlich das Worst-Case-Szenario, da es wahrscheinlich auf einen beschädigten Plasmidvektor hindeutet und daher ratsam ist, das Plasmid zu sequenzieren.
Wenn ein His-Tag verwendet wurde, um das Protein zu markieren, ist die Affinitätschromatographie mit Ni-NTA-Agarose eine einfache und kostengünstige Erfassungsmethode, die die Mehrheit der Kontaminationen eliminiert (Abbildung 7C). Ähnliche Methoden gibt es auch für andere Tag-Systeme (z.B. STREP-II). Wenn kein Tag verwendet wurde, kann eine Kombination aus Ammoniumsulfat-Ausfällung und aufeinanderfolgender hydrophober Austauschchromatographie auch das Protein von der Mehrheit der anderen Proteine trennen (Abbildung 8A). Ein Vergleich der beiden Methoden (Abbildung 7C vs. Abbildung 8A) kann jedoch die Überlegenheit der Ni-NTA-Methoden durch SDS-PAGE-Analysen demonstriert werden. Die Verwendung seines-getaggten Proteins wird daher empfohlen.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Abbildung 8 : Repräsentative Ergebnisse für FPLC-Experimente (HIC, Ionenaustausch, SEC). (A) Eine typische Chromatogramm- und 12,5%-Acrylamid-SDS-PAGE-Analyse der HIC-Phenylchromatographie nach Ammoniumsulfat (AS) Ausfällung des nicht markierten FAHD1-Proteins, wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben. Die grüne Linie spiegelt den Gradienten von Puffer B wider, der as nicht enthält. Während des Prozesses wird AS nach und nach aus dem System ausgewaschen. Der Vergleich dieses Panels mit Abbildung 7C zeigt die Leistungsfähigkeit der Ni-NTA-Affinitätschromatographie im Vergleich zur HIC-Phenyl-Methode und den Vorteil der Verwendung eines His-tag-Systems zur Proteinreinigung. (B) Ein beispielhaftes Chromatogramm und 12,5% Acrylamid SDS-PAGE Analyse der kationischen Austauschchromatographie seiner-tagged FAHD nach Ni-NTA-Reinigung. Mit Hilfe eines Salzverlaufs wird die aufgetragene Probe in einzelne Proteine getrennt. (C) Ein beispielhaftes Chromatogramm und 12,5% Acrylamid SDS-PAGE Analyse der G75 Größe Ausschlusschromatographie seiner-tagged FAHD nach kationischer Austauschchromatographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Nacheinander wird das Protein durch Kation/Anionenaustauschchromatographie weiter von Restkontaminationen getrennt (siehe Abbildung 8B),gefolgt von größenausschlusschromatographie (siehe Abbildung 8C). Es wird empfohlen, in dieser Reihenfolge eine erste Reinigungsstrategie zu entwickeln; diese Säulen sollten jedoch in Kombination, anschließend und in Variation verwendet werden, bis das Protein ausreichend rein ist.
Einfache Aktivitätstests, um "Ja oder Nein"-Entscheidungen auf aktive Substrate und/oder Kofaktoren zu testen, können mit seinen-markierten Proteinen nach der Ni-NTA-Reinigung oder nicht markierten Proteinen nach der Ionenaustauschsäule durchgeführt werden. Spezifische Aktivitäten und kinetische Konstanten müssen mit Protein von höchster Reinheit bestimmt werden. Die Kristallisation kann mit Proteinen nach der ionenaustauschenden Säule versucht werden, aber die Qualität der Kristalle korreliert fast immer mit der Proteinreinheit. Polyklonale Antikörper können in jeder Phase des Reinigungsprotokolls gegen Proteine aufgebracht werden; Hier korreliert die Qualität aber auch mit der Proteinreinheit.

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Die Expression und Reinigung von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen wird anhand von Beispielen beschrieben (Expression in E. coli, FPLC). Gereinigte Proteine werden zur Kristallisation und Antikörperproduktion verwendet und für Enzym-Assays eingesetzt. Ausgewählte fotometrische Assays werden vorgestellt, um die Multifunktionalität von FAHD1 als Oxaloacetat-Decarboxylase und Acylpyruvathydrolase darzustellen.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Unser Protokoll beschreibt Methoden zur effizienten Expression und Reinigung von FAH-Domänen, die Proteine, aber auch Proteine im Allgemeinen enthalten. FHD-Protein-1 spielt eine regulierende Rolle im TCA-Zyklus und im Energiestoffwechsel von Mitochondrien. Wir waren in der Lage, FHD-1-Downregulation mit zellulärer Seneszenz in Verbindung zu bringen und Informationen über Enzymaktivität und Proteinstruktur sind in der Regel erforderlich, um molekulare Mechanismen hinter beobachteten Phänotypen zu verstehen.Der Hauptvorteil der Exdinziption von Proteinen über IPTG induzierbare Vektorsysteme ist, dass alle Methoden relativ billig und einfach in jedem Labor zu etablieren sind. Durch die Verwendung von Polyhistidin-Proteinen in Kombination mit Nickel-NTA-Agaroseharzen kann die immense Selektivität der Affinitätschromatographie kostengünstig eingesetzt werden. Für die meisten Zwecke kann das bei dieser Qualität gewonnene Protein bereits ausreichen.FPLC auf der anderen Seite, ist eine etablierte und allgemeine Methode mit mehreren Vorteilen im Vergleich zu anderen Methoden. Legen Sie zunächst fünf bis zehn Nanogramm Plasmid in 100 Mikroliter kompetenter BL21-DE3-PLysS E.coli-Bakterien auf Eis ein. Tippen Sie leicht auf die Röhre, um den Inhalt zu mischen.Halten Sie die Bakterien 30 Minuten auf Eis und tippen Sie alle paar Minuten sanft auf die Röhre. Erhitzen Sie einen Thermo-Shaker auf 42 Grad Celsius. Legen Sie das Rohr, das die Bakterien enthält, in das Gerät und erhitzen Sie 90 Sekunden lang.Dann legen Sie die Röhre sofort auf Eis. Nach fünf bis zehn Minuten auf Eis 600 Mikroliter NZCYM-Medium hinzufügen und die Röhre in einen Bakterien-Inkubator geben. Schütteln Sie das Rohr mit mittlerer Geschwindigkeit entlang der Schüttelrichtung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Nach der Inkubation 200 Mikroliter der Bakterienkultur auf einer 10 Zentimeter großen LB-Agarplatte mit den Selektionsantibiotika der Wahl. Kultur die Bakterien auf der LB AgarPlatte im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach erfolgreicher Koloniebildung eine einzelne Kolonie pflücken und in fünf Milliliter NZCYM mit den ausgewählten Antibiotika dispergieren.Kultur im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach erfolgreichem Bakterienwachstum, verstärken Sie die Bakterien in 250 Milliliter, 500 Milliliter oder ein Liter Chargen von Medium je nach Bedarf an Proteinmenge. Dann, Kultur der Bakterien, im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden.Zeichnen Sie nach der Inkubation eine Stichprobe für die photometrische Analyse. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 erreicht hat, tragen Sie 200 Mikromolar bis zu einem Millimolar Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid auf. Nach drei bis fünf weiteren Stunden im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius ist die Proteinexpression erschöpft.Das bakterielle Pellet fünf Minuten lang über Zentrifugation bei 5 000 mal G ernten. Dann entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius für eine kurze Lagerung ein. Für jede 250 Milliliter original bakterielle Suspension fünf Milliliter des ausgewählten Puffers auf das bakterielle Pellet auftragen.Fügen Sie 10 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol pro fünf Milliliter aufgebrachten Puffer hinzu. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Pasteur Pipet, um das Pellet durch Kratzen und Pipetieren mechanisch in die Suspension zu zwingen. Übertragen Sie die gesamte Suspension in ein 50-Milliliter-Rohr.Dann beschallen Sie die Suspension. Als nächstes Zentrifuge für 30 Minuten bei hoher Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius. Filtern Sie den Überstand nacheinander mit Filtereinheiten auf Eis.Bereiten Sie eine leere Kunststoff- oder Glassäule vor, indem Sie sie an einem stabilen Halter befestigen und mit Nickel NTA Laufpuffer waschen. Für je 10 Milliliter Proteinsuspension 500 Mikroliter Nickel NTA-Agarose-Gülle auf die Säule auftragen. Füllen Sie die Säule vollständig mit Nickel NTA Laufpuffer, um sicherzustellen, dass das Agaroseharz nicht gestört wird und der Puffer durch die Schwerkraft durchläuft.Als Nächstes wenden Sie die Proteinsuspension auf die Säule an und lassen Sie die Probe durch die Schwerkraft laufen. Nachdem die Probe durchlaufen wurde, füllen Sie die Spalte mit einem Nickel-NTA-Laufpuffer. Legen Sie eine UV-transparente Küvette unter die Säule und sammeln Sie einen Milliliter Nickel NTA-Elutionspuffer.Überprüfen Sie die optische Dichte der Probe mit 280 Nanometern im Vergleich zu einer leeren Probe. Optimalerweise zeigt die Probe eine optische Dichte von mehr als 2,5 an. Da FAHD-Proteine und Nickel-NTA-Elutionspuffer beim Einfrieren und Auftauen ausfällt, dialysieren Sie das Protein über Nacht mit einem Mikroliter DTT pro 100 Milliliter Dialysepuffer gegen einen anderen Puffer auf Demeis.Richten Sie ein FPLC-System ein und waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumen von 20% Ethanol, gefolgt von fünf Säulenvolumen Wasser. Nachdem Sie die Spalte ausgeglichen haben, wenden Sie die dialyzierte Probe auf die Spalte an, und sammeln Sie den Durchfluss durch. Richten Sie eine Gradientenelution ein.Führen Sie nach Abschluss des Farbverlaufs mit hohem Salzpuffer aus, bis keine weiteren Spitzen über den Bereich eines Spaltenvolumens erkannt werden. Starten Sie einen Mikroplattenleser und equilibrate für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Milliliter einer 20 Millimolaren Lösung eines Substrats vor, das im Enzym-Assay-Puffer getestet werden soll.Nach dem Pipettierschema im Textprotokoll bereiten Sie das Enzym Leer- und Probenbrunnen vor, indem Sie 90 Mikroliter Enzym-Assay-Puffer mit fünf MikroliterEnzymlösung in die Brunnen pfeifen. Dann bereiten Sie das Substrat leer und Probe Brunnen durch Pipettier95 Mikroliter Enzym Assay Puffer in die Brunnen. Unmittelbar vor der Messung fünf Mikroliter Enzym-Assay-Puffer auf die sechs leeren Brunnen auftragen.Fünf Mikroliter der 20 Millimolaren Substratlösung auf die Probenbrunnen auftragen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette bei 50 Mikroliter Einstellung, um die Brunnen sanft zu mischen. Legen Sie dann die Platte in den Mikroplattenleser ein und messen Sie jeden Brunnen mit 255 Nanometern.Führen Sie schließlich die Analyse in einer Kalkulationstabelle aus. Zwei Beispiele LB Agarplatten nach optimaler und nicht optimaler Transformation sind hier dargestellt. Zu viele Bakterienkolonien deuten darauf hin, dass entweder zwei viele Bakterien plattiert wurden oder dass die Antibiotika abgelaufen sein können.Zu wenige Bakterienkolonien können darauf hindeuten, dass entweder nicht genügend Plasmid für die Transformation verwendet wurde oder dass zu viele Antibiotika verwendet wurden, um die Bakterien auszuwählen. Das bakterielle Pellet, das das exprimierte Protein in Milligrammmengen enthält, wird geerntet und die Expression wird über die SDS-Seite überprüft. Einige Probleme können während dieses ansonsten einfachen Prozesses auftreten, einschließlich der Proteine, die Einschlusskörper bilden oder das Protein nicht exprimiert wird.Wenn ein His-Tag verwendet wird, um das Protein zu markieren, ist die Affinitätschromatographie mit Nickel-NTA-Agarose eine einfache und kostengünstige Erfassungsmethode, die die Meisten Kontaminationen eliminiert. Wenn kein Tag verwendet wird, kann eine Kombination aus Ammoniumsulfat-Ausfällung und einer aufeinanderfolgenden hydrophoben Austauschchromatographie auch das Protein von der Mehrheit anderer Proteine trennen. Das Protein wird durch Ionenaustauschchromatographie weiter von Restkontaminationen getrennt, gefolgt von der Größenausschlusschromatographie, um ein ausreichend reines Protein zu erhalten.Keine der beschriebenen Methoden ist besonders schwierig. Aber alle Methoden erfordern Eine Ausbildung. Erste Versuche können fehlschlagen, aber die Experimente werden nach einigen zusätzlichen Anpassungen erfolgreich sein.Alle hier vorgestellten Methoden sind allgemeine Methoden der Proteinreinigung. Obwohl das Protokoll auf FAHD-Proteine spezialisiert ist, kann es an jedes Protein angepasst werden, das man reinigen möchte. Rekombinantes menschliches FAHD-1 wurde durch die beschriebenen Methoden gewonnen und hochauflösende Röntgenstrukturen trugen massiv zu unserem Verständnis von FAHD-1 bei, indem sie sowohl als Decarboxylase als auch als Hydrolase fungierten.Bakterien, die bei dieser Arbeit verwendet werden, sind Sicherheitsstämme und nicht gefährlich. Allgemeine Sicherheitshinweise gelten für alle Chemikalien und FPLC-Säulen sollten mit Vorsicht behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...