Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

המחברים מודים מאוד על סיוע טכני מומחה על ידי Annabella Pittl ופיתוח שיטת הטייס על ידי Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף ולהכריז על אינטרסים פיננסיים מתחרים. ה. ג. הינו CEOCSO ב-מלארג ' חיבוקים האיחוד וסיפק acylpyruvates עבור מחקר זה באמצעות סינתזה מותאמת אישית. העבודה במעבדה של פ. ג. ד. נתמכת על ידי הקרן האוסטרית למדע (FWF): מספר פרוייקט P 31582-B26. דמי הפרסום עבור כתב יד זה כבר מכוסים בחלקו על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF) תחת מספר הפרויקט P 31582-B26. א. נ. ו. ר. נתמכים על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF) תחת פרויקט P28395-B26.

הידרולז אצטט (פה)1,2 סופרמשפחה של אנזימים מתאר קבוצה של אנזימים החולקים את התחום הקטליטי שימור מאוד3,4,5,6 , מיכל סבן , בן שמונה , מיכל בן 10 , 10. למרות מרכז קטליטי המשותף שלהם, אנזימים אלה הם רב תפקודי, ורובם נמצאים prokaryotes, שם הם משמשים כדי לשבור תרכובות שאוחזרו ממקורות פחמן מורכבים3. רק שלושה מבני משפחה זו זוהו ב-eukaryotes עד כה: השם נותן פה2, כמו גם את פה הדומיין המכיל חלבון 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 ו פה המכילים חלבון 2 (FAHD2). דלדול של FAHD1 כבר קשור עם הנשמה מיטוכונדריאלי לקויי13,16 ו הקשורים עם סוג הפיך של הסביון הסלולר פניטיפ14 המקושרת פוטנציאל ביניים חסרונות. במערכת התחבורה האלקטרונית האדם FAHD1 וorthologues שלה במערכות מודל (העכבר, nematode, תאי התאים הסרטניים, צמחים, וכו '), כמו גם מוטציה בנקודות שנבחרו, הפכו druggable מטרות של עניין פוטנציאלי. עבור מחקר זה, חלבון רקומביננטי ברמות גבוהות של טוהר, כמו גם מידע על מנגנונים קטליטיים המודרכת על ידי מבני גביש ונוגדנים סלקטיבית הם חיוניים.
כתב יד זה מתאר שיטות לביטוי החלבון של פהד ב -E. coli, כרומטוגרפיה של זיקה, כרומטוגרפיה של החלפת יונים, משקעים אמוניום סולפט, הכנת סינון ג'ל אנליטי, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן ו . בסדר. מטרת השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן היא לספק הנחיות למדענים העובדים בתחומים שונים כגון בדיקות, ביולוגיה של הצמח, כמו גם בעלי חיים ומחקרים אנושיים, כדי לאפיין את החברים של משפחת פה-על, כולל בני-משפחה בלתי מאופיינים צריכים להיות רלוונטיים בתחום מסוים. הפרוטוקולים המתוארים כאן עשויים לספק תמיכה רבת-ערך לפרויקטים שמטרתה לאפיין מבני-משפחה מבית-המשפחה האחרים prokaryotic או איקריוטית.
הרציונל מאחורי השיטות המתוארות כאן הוא העובדה כי לאפיון של חלבונים מתוארים בצורה גרועה (במיוחד, אנזימים מטבוליים של רלוונטיות פיזיולוגית לא ידוע), הגישה להתחיל עם מטוהרים רקומביננטי חלבונים מאפשר את ה פיתוח של כלי מחקר באיכות גבוהה, כגון ההכנות של אנזימים פעילים מחוץ לתחום, נוגדנים באיכות גבוהה, ומעכבי תרופתי רב עוצמה וספציפיים עבור אנזימים שנבחרו. השיטות המתוארות מחייבות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון (FPLC) וקריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטות אלטרנטיביות (למשל, לבטא חלבון ללא אינדוקציה כימית, או להציג טיהור חלבונים על-ידי צנטריפוגה לאחר טיפול בחום ולאחריו כרומטוגרפיה התפלה והגודל ההדרה), ניתן למצוא במקום אחר17. בעוד שספקטרום רחב יותר של שיטות זמין לביטוי וטיהור של משפחת פה-משפחה אנזימים2,7,9,17,18, עבודה זו מתמקדת בביטוי ו טיהור של חלבוני פהד בפרט.
בחלק הדיון של כתב היד הזה, המנגנונים הקטליטיים שזוהו עבור חלבון FAHD1 (הידרולז, decarboxylase)15 מתוארים ביתר פירוט, על מנת להדגים את האופי הכימי של תגובות הזרז. הנתונים המתקבלים בהתבסס על עבודה קודמת7,15,18 (pdb: 6fog, PDB: 6foh) לרמוז פעילות שלישית של האנזים כמו כתו-enol איזומראז.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

הידרוקלז (פה)-מחשבים המכילים חלבונים (פהד) מזוהים כחברים של משפחת פה-על באאוקריוטס. אנזימים של משפחה זו מציגים בדרך כלל ריבוי פונקציונליות, הכולל בעיקר הידרולז ו decarboxylase מנגנונים. מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי ולטיהור של חלבוני פהד, בעיקר חלבון פהד 1 (FAHD1) orthologues בין מינים (אדם, עכבר, מתקנים, צמחים, וכו '). שיטות מכוסות הן ביטוי חלבונים ב -E. coli, כרומטוגרפיה של אהדה, כרומטוגרפיה של המרת יונים, סינון ג'ל אנליטי, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן ומאמר. חלבון מרוכז של רמות טוהר גבוהות (> 98%) עשוי להיות מועסק על ייצור התגבשות או נוגדנים. חלבונים בעלי איכות דומה או נמוכה יותר עשויים להיות מועסקים בתחום האנזים או משמש כאנטיגנים במערכות איתור (מערב לכתם, אליסה). בדיון בעבודה זו, המנגנונים האנזימטיים המזוהים של FAHD1 מתוארים על מנת לתאר את ההידרולז ואת הפונקציונליות הדו ביתר פירוט.

החל עם וקטור שיבוט מוכן לרכוש BL21 (DE3) החיידק של E. coli, הפלביניים מוכנס לתוך החיידקים באמצעות הלם חום או כל שיטה חלופית הולמת (איור 1). לאחר תקופה קצרה של הגברה, החיידקים שהפכו מצופים בצלחות LB אגר, על מנת לצמוח לילה. לוחות בנקודה זו עשויים להיראות שונים, בהתאם למגוון של מקורות שגיאה פוטנציאליים. לוחות עשויים להיות ריקים (כלומר, לא מושבות), מגודלים לחלוטין על ידי חיידקים, או משהו בין, בהתאמה. שתי דוגמאות של צלחות LB אגר לאחר שינוי אופטימלי ולא אופטימלי מתוארים באיור 7A. מושבות חיידקי רבות מדי מצביעות על כך שחיידקים רבים מדי מצופים (סביר) או שהאנטיביוטיקה בשימוש עלולה להיות שפג תוקפם (לא סביר). מעט מדי מושבות חיידקי עשוי להצביע על כך או לא מספיק פלסטלינה שימש לשינוי (להשתמש יותר בפעם הבאה) או כי אנטיביוטיקה יותר מדי שימשו כדי לבחור את החיידקים. בכל מקרה, אם המושבות קיימות, הם צריכים להיות בסדר, כמו באמצעות שתי אנטיביוטיקה סלקטיבית מרמז סיכוי משמעותי למדי של חיידקים לא השתנה לצמוח. עם זאת, אין מושבות בכלל, לעומת זאת, כי או החיידק איבד את יכולת השינוי שלהם (בגלל אחסון שגוי או אחסון על פני תקופות ארוכות יותר, הקפאה חוזרת והפשרה, וכו '), הלם החום לא הצליח (לא ספיגה פלאמצע או חיידקי מוות על ידי חום רב מדי), וקטור שיבוט פגום, או בטעות קבוצה שגויה של אנטיביוטיקה סלקטיבית היה בשימוש (לאמת את הגן ההתנגדות על וקטור פלמיד).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> איור 7 : תוצאות מייצגות לשינוי חיידקים IMAC. (א) נציג LB אגר צלחות עם BL21 שינוי (DE3) E. coli, המתקבל על ידי ביצוע הפרוטוקול בשלב 1.1. משמאל: צלחת עם מושבות מבוזרות היטב (דוגמה חיובית). מימין: צלחת עם מושבה אחת בלבד (דוגמה שלילית). עיגולים לבנים מסמנים. מושבות טובות המעגל האדום מסמן מושבות שצומחות קרוב מדי אחד לשני ולא צריך להיבחר כל עוד מושבות מבודדות זמינים. (ב) 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח דפים של סדרה של שולטת אינדוקציה ("-" מציין לפני iptg אינדוקציה; "+" מציין לאחר אינדוקציה IPTG, לפני הקציר הגלולה, מותאם כמויות שוות של חלבון מוחלט. הדבר מתואר בשלב 1.2. (ג) מופת 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמוד של הטיהור של NI-נ. ת. א. שלו-מתויג FAHD1 חלבון. הדבר מתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול. כרומטוגרפיה הזיקה מפיקה חלבון של טוהר גבוה (> 70%, חץ שחור), עם זאת, כמה זהום קטנים נצפו גם (חיצים אדומים). זהום אלה מורכבים מחלבונים שאינם מפאהד הקושרים לעמודה, ומחלבונים הקושרים לחלבון פהד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מושבות מאומתות נבחרות ונבחרו. לאחר הגברה במדיום המזין, ביטוי החלבון מופעל על ידי יישום IPTG הכימי. הגלולה החיידקית המכילה את החלבון המבוטא באמצעות מיליגרם כמויות נקצרו, והביטוי מאומת באמצעות SDS-PAGE (לדוגמה, ראה איור 7B). בעיות מסוימות עלולות להתרחש במהלך תהליך פשוט זה. ראשית, כמה חלבונים טופס הכללת גופים, כי הם כנראה איכשהו להפריע לחילוף החומרים הטבעי של החיידקים המארחים. זה נצפה עבור מוטציות מסוימות של האדם FAHD1 ו FAHD2. במקרים כאלה, מערכות ביטוי אחרות כמו תאי חרק עשויות להיות מתאימות יותר ויש להתחשב בהן. לאחר איסוף גלולה מתאי חרקים, לדוגמה, טיהור החלבונים מבצע את אותם צעדים כפי שמתואר בפרוטוקול זה. שנית, מערכת DE3pET מתגלה לפעמים להיות "דולף" (כלומר, החלבון כבר מבוטא במידה מסוימת לפני iptg אינדוקציה). הסיבה הפוטנציאלית לכך היא לא מובנת היטב, אבל זה עשוי לעזור לבטא את החלבון לאט לילה בחממה חדר קר. . שלישית, שום חלבון לא מבוטא זהו כנראה התרחיש הגרוע ביותר, כפי שהוא כנראה מצביע על וקטור פגום באמצע, ובכך מומלץ לרצף את הפלביניים.
אם תג שלושימש לתייג את החלבון, כרומטוגרפיה של זיקה עם NI-נ. ת. ע. היא שיטת לכידה קלה וזולה לחסל את רוב הזהום (איור 7c). שיטות דומות קיימות עבור מערכות תגים אחרות (למשל, דלקת II). אם לא נעשה שימוש בתגית, שילוב של משקעים אמוניום גופרתי וכרומטוגרפיה עוקבת של הידרופובי יכולים גם להפריד את החלבון מרוב החלבונים האחרים (איור 8A). עם זאת, השוואת שתי השיטות (איור 7C לעומת איור 8a), ניתן להדגים את עליונותה של שיטות ה-NI-נ-ע על ידי ניתוח sds-PAGE. לפיכך מומלץ להשתמש בחלבון שהואמתויג.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> איור 8 : תוצאות הנציג עבור ניסויים FPLC (HIC, החליפין יון, SEC). (א) כרומוטוגרמה טיפוסית ו 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמוד של כרומטוגרפיה hic-פניל לאחר אמוניום סולפט (AS) משקעים של חלבון FAHD1 לא מתויג, כפי שמתואר בסעיף 4 של הפרוטוקול. הקו הירוק משקף את מעבר הצבע של מאגר B שאינו מכיל את הפונקציה AS. במהלך התהליך, כפי שנשטף בהדרגה מן המערכת. השוואת פאנל זה לדמות 7C מציג את כוחה של הזיקה NI-נ. ת. ע בהשוואה לשיטת hic-פניל, והיתרון של שימוש במערכת התגים שלולטיהור חלבונים. (ב) כרומאטוגרם מופתי ו-12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמודים של כרומטוגרפיה של המרת כרומטוגרפי של פהד שלו-מתויג לאחר טיהור NI-נ. ת. א. באמצעות מעבר מלח, המדגם שהוחל מופרד לחלבונים בודדים. (ג) כרומאטוגרם מופתי ו 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמוד של הדרה G75 גודל כרומטוגרפיה של שלו-מתויג פהד לאחר כרומטוגרפיה החליפין כרומטוגרפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ברציפות, החלבון מופרד עוד יותר משאריות זהום באמצעות כרומטוגרפיה של הקטיון/אניב (לדוגמה, ראה איור 8B), ואחריו כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל (לדוגמה, ראה איור 8b). מומלץ להקים אסטרטגיית טיהור ראשונית בסדר זה; עם זאת, יש להשתמש בעמודות אלה בשילוב, לאחר מכן ובווריאציה, עד שהחלבון יהיה טהור דיו.
בעלי הפעילות הפשוטה, כדי לבדוק "כן או לא" החלטות על מצעים פעילים ו/או קופטים, ניתן לבצע עם החלבונים שלו-מתויג לאחר טיהור NI-נ. ע., או חלבונים לא מתויגים לאחר עמודת החליפין יוני. פעילויות ספציפיות וקבועים קינטי חייבים להיקבע עם חלבון של טוהר הגבוהה ביותר. התגבשות ניתן לנסות עם חלבונים לאחר עמודת החליפין יונית, אבל איכות הקריסטלים כמעט תמיד מתואם לטוהר החלבון. ניתן לגדל נוגדנים פוליבטיים כנגד חלבונים בכל שלב של פרוטוקול הטיהור; עם זאת, כאן האיכות גם מתואם את טוהר החלבון.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

ביטוי וטיהור של הידרוקלז בתחום ההידרולז-מחשבים המכילים חלבונים מתוארים עם דוגמאות (ביטוי ב -E. coli, fplc). חלבונים מטוהרים משמשים התגבשות והפקת נוגדנים מועסקים עבור assays האנזים. התצוגה הנפתחת הנבחרת מוצגת כדי להציג את הפונקציונליות הרב של FAHD1 כמו הידרולואצטט decarboxylase ו acylpy, ההידרולז.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

הפרוטוקול שלנו מתאר שיטות לביטוי וטיהור יעילים של תחום FAH המכיל חלבונים אך גם חלבונים באופן כללי. חלבון FHD-1 ממלא תפקיד רגולטורי במחזור TCA ובחילוף החומרים האנמרץ של המיטוכונדריה. הצלחנו לקשר את ירידה ב-FHD-1 לחוש התאים ומידע על פעילות אנזימים ומבנה חלבונים נדרשים בדרך כלל על מנת להבין מנגנונים מולקולריים מאחורי פנוטיפים שנצפו.היתרון העיקרי של הבעת חלבונים באמצעות מערכות וקטוריות בלתי ניתנות לחיסון IPTG הוא שכל השיטות זולות יחסית וקלות להקמה בכל מעבדה. על ידי שימוש בחלבונים מסוג פולי-היסטידין בשילוב עם שרף אגרוז ניקל NTA, הבחירה העצומה של כרומטוגרפיה זיקה עשוי להיות מועסק בעלות נמוכה. לרוב המטרות, חלבון המתקבל באיכות זו עשוי כבר להספיק.FPLC על הידיים האחרות, היא שיטה מבוססת היטב כללית עם מספר יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות. ראשית, להכניס חמישה עד 10 ננוגרם של פלסמיד לתוך 100 microliters של מוכשר BL21-DE3 pLysS E.coli חיידקים על קרח. הקש מעט על הצינור כדי לערבב את התוכן.שמור את החיידקים על קרח במשך 30 דקות, בעדינות הקשה על הצינור כל כמה דקות. מחממים שייקר תרמו ל 42 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור המכיל את החיידקים ב מכשיר וחום במשך 90 שניות.לאחר מכן, מניחים את הצינור על קרח מיד. לאחר חמש עד 10 דקות על קרח, מוסיפים 600 מיקרוליטרים של מדיום NZCYM וממקמים את הצינור לתוך אינקובטור חיידקים. לנער את הצינור במהירות בינונית בכיוון הרעידות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, צלחת 200 microliters של התרבות החיידקית על צלחת אגר LB 10 ס"מ המכיל את אנטיביוטיקה הבחירה של בחירה. תרבות החיידקים על צלחת אגר LB באינקובטור החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר היווצרות מושבה מוצלחת, לבחור מושבה אחת בודדת ולפזר אותו בחמישה מיליליטר של NZCYM עם אנטיביוטיקה שנבחרה.תרבות באינקובטור החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר צמיחה חיידקית מוצלחת, להגביר את החיידקים ב 250 מיליליטר, 500 מיליליטר או אחד ליטר אצוות של מדיום בהתאם לביקוש של כמות החלבון. לאחר מכן, תרבו את החיידקים, באינקובטור החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד שלוש שעות.לאחר הדגירה, צייר מדגם לניתוח פוטומטרי. אם הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הגיע 0.4, להחיל 200 micromolar עד מילימטר אחד של isopropyl-בטא-D-thiogalactopyranosid. לאחר שלוש עד חמש שעות נוספות באינקובטור החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס ביטוי חלבון הוא מותש.לקצור את גלולת חיידקי באמצעות צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהקפיא את גלולה במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון קצר. עבור כל 250 מיליליטר של השעיה חיידקית מקורית, להחיל חמישה מיליליטר של המאגר שנבחר על גלולה חיידקית.הוסף 10 מיקרוליטרים של בטא-mercaptoethanol לכל חמישה מיליליטר של מאגר מיושם. השתמש צינור פסטר 10 מיליליטר כדי לכפות מכנית את גלולה לתוך ההשעיה על ידי גירוד צינורות. להעביר את כל ההשעיה לצינור 50 מיליליטר.ואז sonicate ההשעיה. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 30 דקות במהירות גבוהה בארבע מעלות צלזיוס. סנן את העל-טבעי ברצף עם יחידות סינון על קרח.הכן עמוד פלסטיק או זכוכית ריק על-ידי חיבורו לתגוח יציב וכביסה עם חיץ ריצה של ניקל NTA. עבור כל 10 מיליליטר של השעיית חלבון להחיל 500 microliters של ניקל NTA agarose תרחיף על הטור. מלא את העמודה לחלוטין עם ניקל NTA פועל חיץ להבטיח לא לשבש את שרף agarose ולאפשר את המאגר לרוץ דרך כוח הכבידה.לאחר מכן, להחיל את ההשעיה חלבון על העמודה ולאפשר את המדגם לרוץ דרך על ידי כוח הכבידה. לאחר שהדגימה עברה, מלא את העמודה במאגר פועל NTA ניקל. מניחים קובט שקוף UV מתחת לעמודה ולאסוף מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון ניקל NTA.בדוק את הצפיפות האופטית של המדגם ב 280 ננומטר לעומת מדגם ריק. באופן אופטימלי, המדגם מציג צפיפות אופטית של יותר מ- 2.5. מאז חלבוני FAHD וחוצץ אלוטיון NTA ניקל יהיה לזרז על הקפאה והפשרה, דיאליזה החלבון נגד חיץ אחר לילה על הקרח באמצעות מיקרוליטר אחד של DTT לכל 100 מיליליטר של חיץ דיאליזה.הגדר מערכת FPLC ולשטוף את העמודה עם חמישה כרכים עמודה של 20%אתנול ואחריו חמישה כרכים עמודה של מים. לאחר שיווי המשקל של העמודה, החל את הדגימה הדיאליזה על העמודה ואסוף את הזרימה. הגדר אלוט הדרגתי.לאחר סיום מעבר הצבע, הפעל עם מאגר מלח גבוה עד שלא יזהו פסגות נוספות בטווח של אמצעי אחסון של עמודה אחת. התחל קורא מיקרו-צלחת וצלילה במשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הכן מיליליטר אחד של פתרון 20 מילימולר של מצע להיבדק במאגר מבדיקה אנזים.על פי ערכת pipetting בפרוטוקול הטקסט, להכין את האנזים ריק לדגום בארות על ידי pipetting 90 microliters של מאגר הבדיקה אנזים לתוך הבאר עם חמישה microliters של פתרון אנזים. לאחר מכן הכינו את המצע ריק ודגמו בארות על ידי צינורות 95 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה אנזימים לתוך בארות. ממש לפני המדידה, יש למרוח חמישה מיקרוליטרים של מאגר בדיקות אנזימים על שש בארות ריקות.החל חמישה microliters של פתרון מצע 20 מילימולר על בארות מדגם. השתמשו בצינור רב-ערוצי בהגדרת 50 מיקרוליטר כדי לערבב בעדינות את בארות. לאחר מכן, הכנס את הלוחית לקורא המיקרו-לוח ולמדוד כל באר ב 255 ננומטר.לבסוף, בצע את הניתוח בגיליון אלקטרוני. שתי דוגמאות LB צלחות אגר לאחר טרנספורמציה אופטימלית ולא אופטימלית מתוארים כאן. יותר מדי מושבות חיידקים מצביעות על כך ששני חיידקים רבים היו מצופים או שפג תוקפם של האנטיביוטיקה.מעט מדי מושבות חיידקים עשויות להצביע על כך שלא נעשה מספיק פלסמיד לשינוי או שיותר מדי אנטיביוטיקה שימשה לבחירת החיידקים. גלולה חיידקי המכיל את החלבון לידי ביטוי בכמויות מיליגרם נקצר ביטוי מאומת באמצעות SDS-page. בעיות מסוימות עלולות להתרחש במהלך תהליך פשוט זה, כולל החלבונים ויוצרים גופי הכללה או החלבון לא בא לידי ביטוי.אם תג שלו משמש כדי לתייג את החלבון, כרומטוגרפיה זיקה עם ניקל NTA אגרוז היא שיטת לכידה קלה וזולה ביטול רוב הזיהומים. אם לא נעשה שימוש בתג, שילוב של משקעים אמוניום גופרתי וכרומטוגרפיה של חילופי הידרופוביים עוקבים עשוי גם להפריד את החלבון מרוב החלבונים האחרים. החלבון מופרד עוד יותר משאריות זיהומים על ידי כרומטוגרפיה חילופי יון ואחריו כרומטוגרפיה הדרת גודל כדי להשיג חלבון טהור מספיק.אף אחת מהשיטות המתוארות אינה קשה במיוחד. אבל כל השיטות דורשות הכשרה. ניסיונות ראשונים עלולים להיכשל אך הניסויים יצליחו לאחר כמה התאמות נוספות.כל השיטות המוצגות כאן הן שיטות כלליות לטיהור חלבונים. למרות שהתמחה בחלבוני FAHD, הפרוטוקול עשוי להיות מותאם לכל חלבון אחד רוצה לטהר. FAHD-1 אנושי רקומביננטי הושג על ידי השיטות המתוארות ומבנים רנטגן ברזולוציה גבוהה תרמו באופן מסיבי להבנתנו של FAHD-1 על ידי פונקציונליות מתנהג כמו שניהם, decarboxylase ו hydrolase.חיידקים המשמשים בעבודה זו הם זני בטיחות ולא מסוכנים. מדריכי בטיחות כלליים חלים על כל הכימיקלים ועמודות FPLC יש לטפל בזהירות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...