Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

लेखकों Annabella Pittl द्वारा विशेषज्ञ तकनीकी सहायता और Haymo Pircher द्वारा पायलट विधि विकास के लिए बहुत आभारी हैं.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने और कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा करने के लिए कुछ भी नहीं है. एच जी MoleculeCrafting.HuGs e.U. में CEOCSO है और कस्टम संश्लेषण के माध्यम से इस अध्ययन के लिए acylpyruvates प्रदान की है। पी जे डी की प्रयोगशाला में काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF): परियोजना संख्या P 31582-B26 द्वारा समर्थित किया गया था. इस पांडुलिपि के लिए प्रकाशन शुल्क आंशिक रूप से परियोजना संख्या पी 31582-B26 के तहत ऑस्ट्रिया ईविज्ञान फंड (FWF) द्वारा कवर किया गया है. ए एन और बी आर परियोजना P28395-B26 के तहत ऑस्ट्रिया विज्ञान कोष (FWF) द्वारा समर्थित हैं.

फुमरीलेटोऐसीट हाइड्रोलेस (एफएएच)1,एंजाइमों के2 सुपरफैमिली एंजाइमों के एक समूह का वर्णन करते हैं जो अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक एफएएच डोमेन3,4,5,6 का हिस्सा है , 7 , 8 , 9 , 10.अपने सामान्य उत्प्रेरक केंद्र के बावजूद, ये एंजाइम बहु-कार्यात्मक होते हैं, और अधिकांश प्रोकैरियोट में पाए जाते हैं, जहां उनका उपयोग जटिल कार्बन स्रोतों से प्राप्त यौगिकों को तोड़ने के लिए किया जाताहै 3. इस परिवार के केवल तीन सदस्यों की पहचान अब तक यूकैरियोट में की गई है: एफएएच2देने का नाम, साथ ही साथ एफएएच डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एफएएफडी1)11,12,13,14 ,15 और FAH डोमेन युक्त प्रोटीन 2 (FAHD2). FAHD1 की कमी बिगड़ा mitochondrial श्वसन13के साथ जुड़ा हुआ है 13,16 और सेलुलर जीर्णता phenotypeके एक प्रतिवर्ती प्रकार के साथ जुड़ा हुआ है कि मध्यवर्ती क्षमता से जुड़ा हुआ है इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली में कमियों. मानव FAHD1 और मॉडल सिस्टम में इसके orthologues (माउस, सूत्रकृमि, कैंसर सेल लाइनों, पौधों, आदि), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चयनित बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट, संभावित हित के drugable लक्ष्य बन गए हैं. इस शोध के लिए, शुद्धता के उच्च स्तर पर रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, साथ ही क्रिस्टल संरचनाओं और चयनात्मक एंटीबॉडी द्वारा निर्देशित उत्प्रेरक तंत्र पर जानकारी महत्वपूर्ण हैं।
इस पांडुलिपि ई. कोलाईमें FAHD प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए तरीकों का वर्णन, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, अमोनियम सल्फेट वर्षा, पूर्वोक्ति और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन, और फोटोमितीय परख. यहाँ वर्णित विधियों और प्रोटोकॉल का उद्देश्य बैक्टीरिया, संयंत्र जीव विज्ञान, साथ ही पशु और मानव अध्ययन के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में काम कर रहे वैज्ञानिकों के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है, FAH superfamily के सदस्यों की विशेषता, सहित असामान्य superfamily सदस्यों वे एक विशेष क्षेत्र में प्रासंगिक हो जाना चाहिए. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य prokaryotic या यूकैरियोटिक एफए superfamily सदस्यों की विशेषता के लिए लक्ष्य परियोजनाओं के लिए मूल्यवान समर्थन प्रदान कर सकते हैं.
यहाँ वर्णित तरीकों के पीछे तर्क तथ्य यह है कि खराब वर्णित प्रोटीन की विशेषता के लिए (विशेष रूप से, अज्ञात शारीरिक प्रासंगिकता के चयापचय एंजाइमों), शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ शुरू करने के लिए दृष्टिकोण की अनुमति देता है इस तरह के इन विट्रो सक्रिय एंजाइम की तैयारी, उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी, और चयनित एंजाइमों के लिए शक्तिशाली और विशिष्ट औषधीय अवरोधकों के रूप में अमूल्य, उच्च गुणवत्ता वाले अनुसंधान उपकरणों का विकास। वर्णित विधियों में तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक तरीकों (उदाहरण के लिए, रासायनिक प्रेरण के बिना प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, या गर्मी उपचार desalting और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद के बाद centrifugation द्वारा प्रोटीन शुद्धि प्रदर्शित करने के लिए), कहीं और पाया जा सकता है17. जबकि तरीकों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की अभिव्यक्ति और FAH superfamily एंजाइमों की शुद्धि के लिए उपलब्ध है2,7,9,17,18, इस काम अभिव्यक्ति पर केंद्रित है और विशेष रूप से एएफडी प्रोटीन की शुद्धि।
इस पांडुलिपि के चर्चा अनुभाग में, एएचओडी1 प्रोटीन (हाइड्रोलेस, डेकार्बोक्सिलस)15 के लिए पहचाने गए उत्प्रेरक तंत्र को और अधिक विस्तार से वर्णित किया गया है, ताकि उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं के रासायनिक चरित्र को प्रदर्शित किया जा सके। पिछले कामकेआधार पर प्राप्त डेटा 7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) के रूप में एंजाइम की एक तीसरी गतिविधि का संकेत है keto-enol isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

फ्यूमैरिलेस्टोऐसीटेट हाइड्रोलेस (एफएएच) डोमेन युक्त प्रोटीन (एफएएचडी) यूकैरियोट में एफएएच सुपरफैमिली के सदस्यों की पहचान की जाती है। इस superfamily के एंजाइमों आम तौर पर बहु कार्यक्षमता प्रदर्शित, मुख्य रूप से hydrolase और decarboxylase तंत्र को शामिल. यह लेख एफएएचडी प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए लगातार तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है, मुख्य रूप से एफएएचडी प्रोटीन 1 (एफएएचडी1) प्रजातियों के बीच ऑर्थोलॉग (मानव, माउस, सूत्रकृमि, पौधे, आदि)। कवर तरीकों ई कोलाई,आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, तैयारी और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन, और photometric परख में प्रोटीन अभिव्यक्ति कर रहे हैं। शुद्धता के उच्च स्तर का केंद्रित प्रोटीन (gt; 98%) क्रिस्टलीकरण या एंटीबॉडी उत्पादन के लिए नियोजित किया जा सकता है. समान या निम्न गुणवत्ता के प्रोटीन एंजाइम assays में नियोजित किया जा सकता है या पता लगाने प्रणाली में प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल किया (पश्चिमी ब्लॉट, एलिसा). इस कार्य की चर्चा में, FAHD1 की पहचान एंजाइमी तंत्र और अधिक विस्तार में अपने hydrolase और decarboxylase द्वि-कार्यक्षमता का वर्णन करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं.

एक तैयार क्लोनिंग वेक्टर के साथ शुरू और खरीदा BL21 (DE3) pLysS ई. कोलाई,प्लाज्मिड गर्मी के झटके या किसी भी उपयुक्त वैकल्पिक विधि के माध्यम से बैक्टीरिया में डाला जाता है (चित्र 1) . प्रवर्धन की एक छोटी अवधि के बाद, तब्दील बैक्टीरिया एलबी agar प्लेटों पर चढ़ाया जाता है, ताकि रात भर विकसित करने के लिए. इस बिंदु पर प्लेट्स अलग लग सकता है, संभावित त्रुटि स्रोतों की एक किस्म के आधार पर. प्लेट्स खाली हो सकता है (यानी, कोई कालोनियों), पूरी तरह से बैक्टीरिया से अधिक हो गई, या बीच में कुछ, क्रमशः. इष्टतम और गैर-अनुकूल रूपांतरण के बाद LB agar प्लेटों के दो उदाहरण चित्र 7कमें दर्शाए गए हैं। बहुत सारे जीवाणु कालोनियों या तो संकेत मिलता है कि बहुत सारे बैक्टीरिया चढ़ाया गया (शायद) या कि उपयोग में एंटीबायोटिक दवाओं की समय सीमा समाप्त हो सकता है (असंभव रूप से). बहुत कम जीवाणु कालोनियों का संकेत हो सकता है कि या तो पर्याप्त नहीं प्लाज्मिड परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया गया था (अधिक अगली बार उपयोग) या कि बहुत ज्यादा एंटीबायोटिक दवाओं बैक्टीरिया का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. किसी भी मामले में, अगर कालोनियों मौजूद हैं, वे ठीक होना चाहिए, के रूप में दो चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर untransformed बैक्टीरिया के विकास के लिए एक जगह तुच्छ मौका का तात्पर्य है. सब पर कोई कालोनियों, तथापि, इंगित करता है कि या तो बैक्टीरिया उनके परिवर्तन क्षमता खो दिया है (क्योंकि लंबे समय से गलत भंडारण या भंडारण, दोहराव फ्रीज और thaw, आदि), गर्मी के झटके सफल नहीं था (कोई प्लाज्मिड तेज या जीवाणु बहुत अधिक गर्मी से मौत), क्लोनिंग वेक्टर भ्रष्ट है, या गलती से चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं का एक गलत सेट इस्तेमाल किया गया था (प्लाज्मिड वेक्टर पर प्रतिरोध जीन की पुष्टि करें).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> चित्र 7 : बैक्टीरिया परिवर्तन और IMAC के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (A) रूपांतरित BL21(DE3) ई. कोलाईके साथ प्रतिनिधि LB agar प्लेटें, निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण 1.1 द्वारा प्राप्त की. बाएं: अच्छी तरह से वितरित कालोनियों (सकारात्मक उदाहरण) के साथ एक थाली. सही: केवल एक एकल कॉलोनी (नकारात्मक उदाहरण) के साथ एक थाली. सफेद हलकों अच्छी कालोनियों के निशान. लाल वृत्त उन कालोनियों को चिह्नित करता है जो एक दूसरे के बहुत करीब बढ़ रहे हैं और जब तक अलग-थलग कालोनियां उपलब्ध हैं तब तक नहीं उठाया जाना चाहिए। (बी) प्रेरण नियंत्रण की एक श्रृंखला के एक 12.5% acrylamide एसडीएस-पेज विश्लेषण ("-" IPTG प्रेरण से पहले इंगित करता है; "+" गोली फसल से पहले, IPTG प्रेरण के बाद इंगित करता है, कुल प्रोटीन के बराबर मात्रा में समायोजित. यह चरण 1.2 में वर्णित है। (सी) उनकेटैग किए गए एफएएचडी 1 प्रोटीन के नी-एनटीए शोधन का एक अनुकरणीय 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण। यह प्रोटोकॉल के अनुभाग 3 में वर्णित है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी उच्च शुद्धता के प्रोटीन पैदावार (gt; 70%, काले तीर), तथापि, कई छोटे संदूषण भी मनाया जाता है (लाल तीर). इन संदूषण गैर-एफएपीएचडी प्रोटीन से मिलकर बनता है जो कॉलम से बांधता है, और प्रोटीन से जो एफएपीएचडी प्रोटीन से बांधता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
वैध कालोनियों का चयन किया और उठाया जाता है। पौष्टिक माध्यम में प्रवर्धन के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति रासायनिक IPTG के आवेदन से शुरू होता है. मिलीग्राम मात्रा में व्यक्त प्रोटीन युक्त जीवाणु गोली काटा जाता है, और अभिव्यक्ति एसडीएस-पेज के माध्यम से सत्यापित की जाती है (उदाहरण के लिए चित्र 7खदेखें)। यह अन्यथा सरल प्रक्रिया के दौरान कुछ समस्याएँ हो सकती हैं। सबसे पहले, कुछ प्रोटीन शामिल शरीर फार्म, क्योंकि वे जाहिरा तौर पर किसी भी तरह मेजबान बैक्टीरिया के प्राकृतिक चयापचय के साथ हस्तक्षेप. यह मानव FAHD1 और FAHD2 के कुछ बिंदु उत्परिवर्तनों के लिए मनाया गया था. ऐसे मामलों में, कीट कोशिकाओं की तरह अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली अधिक उपयुक्त हो सकता है और विचार किया जाना चाहिए. कीट कोशिकाओं से एक गोली कटाई के बाद, उदाहरण के लिए, प्रोटीन की शुद्धि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ही कदम इस प्रकार है. दूसरा, DE3-pET प्रणाली कभी कभी "लकी" (यानी, प्रोटीन पहले से ही कुछ हद तक IPTG प्रेरण से पहले व्यक्त किया है) पाया जाता है. इस के लिए संभावित कारण अच्छी तरह से समझ में नहीं है, लेकिन यह एक ठंडे कमरे इनक्यूबेटर में धीरे-धीरे रात भर प्रोटीन व्यक्त करने में मदद कर सकता है। तीसरा, कोई प्रोटीन व्यक्त किया जाता है. यह शायद सबसे खराब स्थिति है, क्योंकि यह संभावना एक भ्रष्ट प्लाज्मिड वेक्टर को इंगित करती है और इस प्रकार प्लाज्मिड अनुक्रम करने की सलाह दी जाती है।
यदि प्रोटीन को टैग करने के लिए उसकाटैग का उपयोग किया जाता है, तो नि-एनटीए एगारोस के साथ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी एक आसान और सस्ते कब्जा करने की विधि है जो अधिकांश संदूषणों को नष्ट करती है (चित्र 7C) । इसी तरह की विधियाँ अन्य टैग सिस्टम (उदाहरण के लिए, STREP-II)के लिए मौजूद हैं। यदि कोई टैग का उपयोग नहीं किया गया था, अमोनियम सल्फेट वर्षा और लगातार हाइड्रोफोबिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी का एक संयोजन भी अन्य प्रोटीन के बहुमत से प्रोटीन को अलग कर सकते हैं (चित्र 8क)। तथापि, दो विधियों की तुलना करना (चित्र 7C बनाम चित्र 8क),नि-एनटीए विधियों की श्रेष्ठता एसडीएस-पेज विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित की जा सकती है। इसलिए उनकेटैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> चित्र 8 : FPLC प्रयोगों के लिए प्रतिनिधि परिणाम (एचआईसी, आयन विनिमय, एसईसी). (क) अमोनियम सल्फेट (एएस) अनटैग्ड एफ़एडी1 प्रोटीन की वर्षा के बाद एचआईसी-फेनिल क्रोमैटोग्राफी का एक विशिष्ट क्रोमैटोग्राम और 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण, जैसा कि प्रोटोकॉल के खंड 4 में वर्णित है। हरी रेखा AS नहीं है कि बफर बी की ग्रेडिएंट को दर्शाता है। प्रक्रिया के दौरान एएस धीरे-धीरे प्रणाली से बाहर धोया जाता है। चित्रा 7C करने के लिए इस पैनल की तुलना HIC-फेनिल विधि की तुलना में नी-NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी की शक्ति को प्रदर्शित करता है, और प्रोटीन शोधन के लिए एक अपनेटैग प्रणाली का उपयोग करने का लाभ. (बी) एक अनुकरणीय क्रोमैटोग्राम और 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए उनकीटैग ्ड की एफएएचडी की विश्लेषण Ni-NTA शुद्धिकरण के बाद। एक नमक ढाल का उपयोग करना, लागू नमूना अलग-अलग प्रोटीन में अलग है। (सी) एक अनुकरणीय क्रोमैटोग्राम और 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण जी75 आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के अपने-टैग किए गए एफएएचडी के बाद काेशनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
लगातार, प्रोटीन आगे cation/anion विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा बचे संदूषण से अलग है (उदाहरण के लिए, चित्र 8Bदेखें), आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी के बाद (उदाहरण के लिए, चित्र 8Cदेखें)। इस क्रम में एक प्रारंभिक शोधन रणनीति स्थापित करने की सलाह दी जाती है; हालांकि, इन स्तंभों के संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, बाद में और भिन्नता में, जब तक प्रोटीन पर्याप्त रूप से शुद्ध है.
सरल गतिविधि assays, के लिए परीक्षण करने के लिए "हाँ या नहीं" सक्रिय substrates और / या cofactors पर निर्णय, Ni-NTA शुद्धि के बाद अपनेटैग प्रोटीन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, या आयनिक विनिमय स्तंभ के बाद untagged प्रोटीन. विशिष्ट गतिविधियों और गतिज स्थिरांक उच्चतम शुद्धता के प्रोटीन के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए. क्रिस्टलीकरण आयनिक विनिमय स्तंभ के बाद प्रोटीन के साथ प्रयास किया जा सकता है, लेकिन क्रिस्टल की गुणवत्ता लगभग हमेशा प्रोटीन शुद्धता के साथ संबंधित है. पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी शोधन प्रोटोकॉल के किसी भी चरण में प्रोटीन के खिलाफ उठाया जा सकता है; हालांकि, यहाँ गुणवत्ता भी प्रोटीन शुद्धता के साथ संबंधित है.

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण, और फ्जाइम परख के Fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन

fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि उदाहरण के साथ वर्णित है (ई. कोलाईमें अभिव्यक्ति , FPLC). शुद्ध प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और एंटीबॉडी उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है और एंजाइम assays के लिए कार्यरत हैं. चयनित photometric परख oxaloaceate decarboxylase और acylpyruvate hydrolase के रूप में FAHD1 की बहु कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

हमारा प्रोटोकॉल प्रोटीन युक्त एफएएच डोमेन की कुशल अभिव्यक्ति और शुद्धि के तरीकों का वर्णन करता है, लेकिन सामान्य रूप से प्रोटीन भी। एफएचडी प्रोटीन-1 टीसीए चक्र और माइटोकॉन्ड्रिया के ऊर्जा चयापचय में एक नियामक भूमिका निभाता है। हम सेलुलर सेनेसेंस के लिए एफएचडी-1 डाउनरेगुलेशन को संबद्ध करने में सक्षम थे और एंजाइम गतिविधि और प्रोटीन संरचना के बारे में जानकारी आम तौर पर देखी गई फेनोटाइप के पीछे आणविक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक होती है।आईपीटीजी अकक्षीय वेक्टर सिस्टम के माध्यम से प्रोटीन व्यक्त करने का मुख्य लाभ यह है कि सभी तरीके अपेक्षाकृत सस्ते और किसी भी प्रयोगशाला में स्थापित करने में आसान हैं। निकल एनटीए एगरेज रेजिन के संयोजन में पॉली-हिस्टिडीन प्रकार प्रोटीन का उपयोग करके, आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी की अपार चयनशीलता कम लागत पर नियोजित की जा सकती है। अधिकांश उद्देश्यों के लिए, इस गुणवत्ता पर प्राप्त प्रोटीन पहले से ही पर्याप्त हो सकता है।दूसरे हाथों पर एफपीएलसी, अन्य तरीकों की तुलना में कई फायदों के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित और सामान्य विधि है। सबसे पहले, बर्फ पर सक्षम BL21-DE3 pLysS ई. कोलाई बैक्टीरिया के १०० माइक्रोलीटर में प्लाज्मिड के पांच से 10 नैनोग्राम डालें । सामग्री को मिलाने के लिए ट्यूब को थोड़ा टैप करें।बैक्टीरिया को बर्फ पर 30 मिनट तक रखें, हर कुछ मिनट में धीरे-धीरे ट्यूब को टैप करें। एक थर्मो शेकर को 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। उपकरण में बैक्टीरिया युक्त ट्यूब रखें और 90 सेकंड के लिए गर्मी।इसके बाद ट्यूब को तुरंत बर्फ पर रखें। बर्फ पर पांच से 10 मिनट के बाद, NZCYM माध्यम के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूब को बैक्टीरिया इनक्यूबेटर में रखें। एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए दिशा के साथ मध्यम गति से उन्मुख ट्यूब हिलाएं।इनक्यूबेशन बाद, एक 10 सेंटीमीटर पौंड आगर थाली पसंद के चयन एंटीबायोटिक दवाओं युक्त पर जीवाणु संस्कृति के २०० माइक्रोलीटर थाली । संस्कृति बैक्टीरिया इनक्यूबेटर में पौंड आगार प्लेट पर बैक्टीरिया रात 37 डिग्री सेल्सियस पर। सफल कॉलोनी गठन के बाद, एक ही कॉलोनी चुनें और इसे चयनित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ NZCYM के पांच मिलीलीटर में तितर-बितर करें।बैक्टीरिया इनक्यूबेटर में संस्कृति रात 37 डिग्री सेल्सियस पर। सफल बैक्टीरियल विकास के बाद, प्रोटीन की मात्रा की मांग के आधार पर 250 मिलीलीटर, 500 मिलीलीटर या माध्यम के एक लीटर बैचों में बैक्टीरिया को बढ़ाता है। फिर, बैक्टीरिया को दो से तीन घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया इनक्यूबेटर में संस्कृति दें।इनक्यूबेशन बाद, फोटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक नमूना आकर्षित करें। यदि 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व 0.4 तक पहुंच गया है, तो आइसोप्रोपिल-बीटा-डी-थिओगलाकोटिरानोसिड के एक मिलीमोलर तक 200 माइक्रोमोलर लागू करें। बैक्टीरिया इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस प्रोटीन एक्सप्रेशन पर तीन से पांच घंटे और खत्म हो जाता है।पांच मिनट के लिए 5, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से जीवाणु गोली फसल। फिर, सुपरनेट को त्यागें और संक्षिप्त भंडारण के लिए पैलेट को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। मूल जीवाणु निलंबन के प्रत्येक 250 मिलीलीटर के लिए, बैक्टीरियल पेलेट पर चयनित बफर के पांच मिलीलीटर लागू करें।एप्लाइड बफर के पांच मिलीलीटर प्रति बीटा-मर्केप्टोथेनॉल के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक 10 मिलीलीटर पाश्चर पिपेट का उपयोग करें ताकि यांत्रिक रूप से गोली को खरोंच और पाइपिंग द्वारा निलंबन में मजबूर किया जा सके। निलंबन के सभी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को स्थानांतरित करें।इसके बाद निलंबन की बात कही। इसके बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर उच्च गति से 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र । बर्फ पर फिल्टर इकाइयों के साथ लगातार सुपरनैंट को फ़िल्टर करें।एक स्थिर रिटेनर से जोड़कर और निकल एनटीए रनिंग बफर के साथ धोने के द्वारा एक खाली प्लास्टिक या ग्लास कॉलम तैयार करें। प्रोटीन निलंबन के प्रत्येक 10 मिलीलीटर के लिए कॉलम में निकल एनटीए एगर उठे घोल के 500 माइक्रोलीटर लागू होते हैं। कॉलम को पूरी तरह से निकल एनटीए रनिंग बफर के साथ भरें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एगर उठे राल को बाधित न करें और बफर को गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से चलाने की अनुमति दें।इसके बाद, कॉलम में प्रोटीन निलंबन लागू करें और नमूने को गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से चलाने की अनुमति दें। नमूना पारित होने के बाद, देल एनटीए रनिंग बफर के साथ कॉलम भरें। कॉलम के नीचे एक यूवी पारदर्शी क्यूवेट रखें और निकल एनटीए एल्यूशन बफर का एक मिलीलीटर एकत्र करें।एक खाली नमूना बनाम 280 नैनोमीटर पर नमूने के ऑप्टिकल घनत्व की जांच करें। इष्टतम, नमूना 2.5 से अधिक का ऑप्टिकल घनत्व प्रदर्शित करता है। चूंकि एफएएचडी प्रोटीन और निकेल एनटीए एल्यूशन बफर ठंड और विगलन पर उपजी होगी, इसलिए डायलिसिस बफर के प्रति 100 मिलीलीटर डीटीटी के एक माइक्रोलीटर का उपयोग करके बर्फ पर रात भर एक अलग बफर के खिलाफ प्रोटीन को डायलाइज करें।एक एफपीएलसी सिस्टम सेट करें और 20% इथेनॉल के पांच कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम को धोएं और उसके बाद पानी के पांच कॉलम वॉल्यूम। कॉलम को बराबर करने के बाद, कॉलम में डायलिज्ड नमूना लागू करें और प्रवाह के माध्यम से एकत्र करें। एक ढाल योग स्थापित करें।ढाल समाप्त होने के बाद, उच्च नमक बफर के साथ तब तक चलाएं जब तक कि एक कॉलम वॉल्यूम की सीमा पर कोई और चोटियों का पता न चले। एक माइक्रो प्लेट रीडर शुरू करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए संतुलन । एंजाइम परख बफर में परीक्षण किए जाने वाले सब्सट्रेट के 20 मिलीमोलर समाधान का एक मिलीलीटर तैयार करें।टेक्स्ट प्रोटोकॉल में पाइपिंग स्कीम के मुताबिक एंजाइम के पांच माइक्रोलीटर के साथ कुओं में एंजाइम परख बफर के ९० माइक्रोलीटर को पाइपिंग करके एंजाइम ब्लैंक और सैंपल वेल्स तैयार करें । फिर कुओं में एंजाइम परख बफर के 95 माइक्रोलीटर को पाइपिंग करके सब्सट्रेट ब्लैंक और सैंपल कुओं को तैयार करें। मापने से ठीक पहले, छह खाली कुओं में एंजाइम परख बफर के पांच माइक्रोलीटर लागू करें।सैंपल कुओं में 20 मिलीमोलर सब्सट्रेट सॉल्यूशन के पांच माइक्रोलीटर लगाएं। कुओं को धीरे-धीरे मिलाने के लिए 50 माइक्रोलीटर सेटिंग पर मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें। फिर, माइक्रो-प्लेट रीडर में प्लेट डालें और प्रत्येक अच्छी तरह से 255 नैनोमीटर पर मापें।अंत में, एक स्प्रेडशीट में विश्लेषण करें। इष्टतम और गैर-इष्टतम परिवर्तन के बाद दो उदाहरण पौंड आगर प्लेटें यहां चित्रित की गई हैं। बहुत सारे जीवाणु कालोनियों से संकेत मिलता है कि दो कई बैक्टीरिया चढ़ाया गया था या कि एंटीबायोटिक दवाओं की अवधि समाप्त हो सकती है ।बहुत कम बैक्टीरियल कालोनियों से संकेत मिल सकता है कि या तो परिवर्तन के लिए पर्याप्त प्लाज्मिड का उपयोग नहीं किया गया था या बैक्टीरिया का चयन करने के लिए बहुत अधिक एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया गया था। मिलीग्राम मात्रा में व्यक्त प्रोटीन युक्त जीवाणु गोली को काटा जाता है और अभिव्यक्ति को एसडीएस-पेज के माध्यम से सत्यापित किया जाता है। इस अन्यथा सरल प्रक्रिया के दौरान कुछ समस्याएं हो सकती हैं, जिनमें शामिल किए गए शरीर बनाने वाले प्रोटीन या प्रोटीन व्यक्त नहीं किया जा रहा है।यदि एक अपने टैग प्रोटीन टैग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, निकल एनटीए agarose के साथ आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी एक आसान और सस्ते कब्जा संदूषण के बहुमत को नष्ट करने विधि है । यदि कोई टैग का उपयोग नहीं किया जाता है, तो अमोनियम सल्फेट वर्षा और लगातार हाइड्रोफोबिक एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी का संयोजन भी प्रोटीन को अधिकांश अन्य प्रोटीनों से अलग कर सकता है। प्रोटीन को आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी द्वारा बचे हुए संदूषणों से अलग किया जाता है जिसके बाद पर्याप्त रूप से शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी होती है।वर्णित तरीकों में से कोई भी विशेष रूप से मुश्किल है । लेकिन सभी तरीकों के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। पहले प्रयास विफल हो सकते हैं लेकिन प्रयोग कुछ अतिरिक्त अनुकूलन के बाद सफल होंगे।यहां प्रस्तुत सभी तरीके प्रोटीन शुद्धि के सामान्य तरीके हैं। हालांकि FAHD प्रोटीन के लिए विशेष, प्रोटोकॉल किसी भी प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एक शुद्ध करना चाहते हैं । वर्णित विधियों और उच्च संकल्प एक्स-रे संरचनाओं द्वारा पुनः संयोजन मानव एफएएचडी-1 प्राप्त किया गया है, दोनों, डिकार्बोक्सिलेज और हाइड्रोलेस के रूप में कार्य करने वाली कार्यक्षमता द्वारा एफएएचडी-1 की हमारी समझ में बड़े पैमाने पर योगदान दिया।इस काम में इस्तेमाल होने वाले बैक्टीरिया सुरक्षा उपभेद हैं न कि खतरनाक। सामान्य सुरक्षा गाइड सभी रसायनों पर लागू होते हैं और एफपीएलसी कॉलम को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, अभिव्यक्ति, शोधन, और मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के क्रिस्टलीकरण के लिए बाध्य<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

संयोजन गीले और सूखे प्रयोगशाला तकनीकों बड़े दबाई-तार युक्त प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण गाइड करने के लिए

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

एस 100 ए 12 की अभिव्यक्ति, शुद्धि और रोगाणुरोधी गतिविधि

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, क्रिस्टलीकरण, और बायोफिजिकल स्टडीज ऑफ़ ए<em&gt; बेसिलस</em&gt; -अधिकृत न्यूक्लियोटाइड पाइरोफॉस्फोरियम, बीसीएमजीजी

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

स्तनधारी Bestrophin आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और शुद्धि

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

अभिव्यक्ति, घुलनबिलीकरण, और यूकार्योटिक बोरेट ट्रांसपोर्टरों की शुद्धि

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

न्यूक्लीज-फ्री ऑक्सीजन स्कैवेंडर प्रोटोकैकेट 3,4-डिऑक्सिकाज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

पीसीआर म्यूटेनेसिस, क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, फास्ट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटोकॉल और वाइल्ड टाइप का क्रिस्टलीकरण और ट्रिप्टोफान सिंथेस के उत्परिवर्ती रूप

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और मानव मैट्रिक्स Metaloproteinase-3 के शुद्धिकरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...