Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Gli autori sono molto grati per l'assistenza tecnica esperta di Annabella Pittl e per lo sviluppo del metodo pilota di Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non dichiarano interessi finanziari concorrenti. H. G. è CEOCSO presso MoleculeCrafting.HuGs e.U. e ha fornito acylpyruvates per questo studio tramite sintesi personalizzata. Il lavoro nel laboratorio di P. J. D. è stato sostenuto dal Fondo scientifico austriaco (FWF): numero di progetto P 31582-B26. Le spese di pubblicazione per questo manoscritto sono state in parte coperte dal Fondo scientifico austriaco (FWF) con il numero di progetto P 31582-B26. A. N. e B. R. sono sostenuti dal Fondo scientifico austriaco (FWF) nell'ambito del progetto P28395-B26.

La cogiuria fumarylacetoacetate (FAH)1,2 superfamiglia di enzimi descrive un gruppo di enzimi che condividono il dominio FAH catalitico altamente conservato3,4,5,6 , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 (in vie , 10. Nonostante il loro comune centro catalitico, questi enzimi sono multifunzionali, e la maggior parte si trovano nei procarioti, dove vengono utilizzati per abbattere i composti recuperati da complesse fonti di carbonio3. Solo tre membri di questa famiglia sono stati identificati negli eucarioti finora: il nome che dà FAH2, così come la proteina che contiene il dominio FAH 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 e proteina che contiene il dominio FAH 2 (FAHD2). L'esaurimento di FAHD1 è stato associato a una respirazione mitocondriale alterata13,16 e associata a un tipo reversibile di fenotipo14 della senescenza cellulare che è collegato al potenziale intermedio carenze nel sistema di trasporto degli elettroni. FaHD1 umano e i suoi ortologhi nei sistemi modello (topo, nematode, linee cellulari tumorali, piante, ecc.), così come varianti di mutazione punto selezionati, sono diventati bersagli drogabili di potenziale interesse. Per questa ricerca, le proteine ricombinanti ad alti livelli di purezza, nonché le informazioni sui meccanismi catalitici guidati da strutture cristalline e anticorpi selettivi sono vitali.
Questo manoscritto descrive i metodi per l'espressione della proteina FAHD in E. coli, la cromatografia di affinità, la cromatografia allo scambio di ioni, la precipitazione del solfato di ammonio, la filtrazione del gel preparativo e analitico, la cristallizzazione, la diffrazione a raggi X e saggi fotometrici. Lo scopo dei metodi e dei protocolli qui descritti è quello di fornire indicazioni per gli scienziati che lavorano in diversi campi come la batteriologia, la biologia vegetale, nonché gli studi sugli animali e sull'uomo, per caratterizzare i membri della superfamiglia FAH, tra cui membri di superfamiglia non caratterizzati se diventano rilevanti in un particolare campo. I protocolli qui descritti possono fornire un valido supporto per i progetti che mirano a caratterizzare altri membri della superfamiglia faH procariotica o eucatermica o eucatermica.
La logica alla base dei metodi qui descritti è il fatto che per la caratterizzazione di proteine mal descritte (in particolare, enzimi metabolici di rilevanza fisiologica sconosciuta), l'approccio per iniziare con proteine ricombinanti purificate consente sviluppo di strumenti di ricerca inestimabili e di alta qualità, come preparati in vitro attivi, anticorpi di alta qualità e inibitori farmacologici potenti e specifici per enzimi selezionati. I metodi descritti richiedono la cromatografia liquida a proteine veloce (FPLC) e la cristallografia a raggi X. I metodi alternativi (ad esempio, per esprimere proteine senza induzione chimica, o per mostrare la purificazione delle proteine per centrifugazione dopo il trattamento termico seguita da dealare e la cromatografia di esclusione delle dimensioni), possono essere trovati altrove17. Mentre è disponibile una gamma più ampia di metodi per l'espressione e la purificazione degli enzimi della superfamiglia FAH2,7,9,17,18, questo lavoro si concentra sull'espressione e purificazione delle proteine FAHD in particolare.
Nella sezione di discussione di questo manoscritto, i meccanismi catalitici identificati per la proteina FAHD1 (hydrolase, decarboxylase)15 sono descritti in modo più dettagliato, al fine di dimostrare il carattere chimico delle reazioni catalizzate. I dati ottenuti sulla base del lavoro precedente7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) implicano una terza attività dell'enzima come cheto-enol isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Le proteine che contengono idrolasi (FAH) di Fumarylacetoacetate (FAH) sono membri identificati della superfamiglia FAH negli eucarioti. Gli enzimi di questa superfamiglia mostrano generalmente la multi-funzionalità, che coinvolge principalmente meccanismi idrolasi e decarboxylase. Questo articolo presenta una serie di metodi consecutivi per l'espressione e la purificazione delle proteine FAHD, principalmente proteina FAHD 1 (FAHD1) ortologhi tra le specie (umane, topi, nematodi, piante, ecc.). I metodi coperti sono espressione proteica in E. coli, cromatografia di affinità, cromatografia dello scambio iostico, filtrazione del gel preparativo e analitico, cristallizzazione, diffrazione a raggi X e saggi fotometrici. Proteine concentrate con alti livelli di purezza (>98%) possono essere impiegati per la cristallizzazione o la produzione di anticorpi. Proteine di qualità simile o inferiore possono essere impiegate nei saggi enzimatici o utilizzate come antigeni nei sistemi di rilevamento (Western-Blot, ELISA). Nella discussione di questo lavoro, i meccanismi enzimatici identificati di FAHD1 sono delineati per descrivere la sua bifunzionalità idrolasi e decarboxylase in modo più dettagliato.

A partire da un vettore di clonazione preparato e acquistato BL21(DE3) pLysS E. coli, il plasmide viene inserito nei batteri tramite scossa di calore o qualsiasi metodo alternativo appropriato (Figura 1). Dopo un breve periodo di amplificazione, i batteri trasformati vengono placcati su piastre di agar LB, al fine di crescere durante la notte. Piastre a questo punto possono apparire diverse, a seconda di una varietà di potenziali fonti di errore. Le piastre possono essere vuote (cioè senza colonie), completamente invase da batteri, o qualcosa in mezzo, rispettivamente. Due esempi di piastre di agar LB dopo la trasformazione ottimale e non ottimale sono illustrati nella Figura 7A. Troppe colonie batteriche indicano o che troppi batteri sono stati placcati (probabilmente) o che gli antibiotici in uso possono essere scaduti (improbabile). Troppo poche colonie batteriche possono indicare che non abbastanza plasmide è stato utilizzato per la trasformazione (utilizzare più la prossima volta) o che troppi antibiotici sono stati utilizzati per selezionare i batteri. In ogni caso, se le colonie sono presenti, dovrebbero andare bene, poiché l'uso di due antibiotici selettivi implica una possibilità piuttosto insignificante di crescita dei batteri non trasformati. Nessuna colonia, tuttavia, indica che i batteri hanno perso la loro competenza di trasformazione (a causa di conservazione o stoccaggio sbagliato per periodi più lunghi, congelamento e disgelo ripetitivi, ecc.), lo shock termico non ha avuto successo (nessun assorbimento di plasmide o batteri morte per troppo calore), il vettore di clonazione è danneggiato, o per errore è stato utilizzato un insieme sbagliato di antibiotici selettivi (verificare il gene di resistenza sul vettore plasmide).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figura 7 : Risultati rappresentativi per la trasformazione dei batteri e IMAC. (A) Piastre di agar LB rappresentative con trasformazione BL21(DE3) E. coli, ottenute seguendo il passo 1.1 del protocollo. Sinistra: Piastra con colonie ben distribuite (esempio positivo). Destra: una piastra con una sola colonia (esempio negativo). I cerchi bianchi segnano buone colonie. Il cerchio rosso segna colonie che crescono troppo vicine l'una all'altra e non devono essere raccolte finché sono disponibili colonie isolate. (B) Un'analisi SDS-PAGE acrilammide del 12,5% di una serie di controlli di induzione ("-" indica prima dell'induzione di IPTG; Il " s" indica dopo l'induzione IPTG, prima del raccolto di pellet), regolato a pari quantità di proteine totali. Ciò è descritto nel passaggio 1.2. (C) Un'analisi esemplare del 12,5% di acrilammide SDS-PAGE della purificazione Ni-NTA della proteina FAHD1 con etichettatura del12,5%. Questo è descritto nella sezione 3 del protocollo. La cromatografia di affinità produce proteine ad alta purezza (>70%, freccia nera), tuttavia, si osservano anche diverse piccole contaminazioni (frecce rosse). Queste contaminazioni consistono di proteine non-FAHD che si legano alla colonna, e da proteine che si legano alla proteina FAHD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le colonie convalidate vengono selezionate e selezionate. Dopo l'amplificazione nel mezzo nutritivo, l'espressione proteica viene innescata dall'applicazione della sostanza chimica IPTG. Il pellet batterico contenente la proteina espressa in quantità di milligrammo viene raccolto e l'espressione viene verificata tramite SDS-PAGE (vedere ad esempio la figura 7B). Alcuni problemi possono verificarsi durante questo processo altrimenti semplice. In primo luogo, alcune proteine formano corpi di inclusione, perché a quanto pare in qualche modo interferiscono con il metabolismo naturale dei batteri ospiti. Questo è stato osservato per alcune mutazioni punto di FAHD1 umano e FAHD2. In questi casi, altri sistemi di espressione come le cellule degli insetti possono essere più appropriati e dovrebbero essere considerati. Dopo aver raccolto un pellet dalle cellule degli insetti, ad esempio, la purificazione delle proteine segue gli stessi passaggi descritti in questo protocollo. In secondo luogo, il sistema DE3-pET è talvolta trovato per essere "perdente" (cioè, la proteina è già espressa in una certa misura prima dell'induzione IPTG). La ragione potenziale di questo non è ben compresa, ma può aiutare ad esprimere la proteina lentamente durante la notte in un'incubatrice di celle frigorifere. In terzo luogo, non viene espressa alcuna proteina. Questo è probabilmente lo scenario peggiore, in quanto probabilmente indica un vettore di plasmide danneggiato e quindi consigliabile sequenziare il plasmide.
Se un suotag è stato utilizzato per etichettare la proteina, la cromatografia di affinità con agarose Ni-NTA è un metodo di cattura facile ed economico eliminando la maggior parte delle contaminazioni (Figura 7C). Metodi simili esistono per altri sistemi di tag (ad esempio, STREP-II). Se non è stato utilizzato alcun tag, una combinazione di precipitazione solfato di ammonio e cromatografia di scambio idrofobico consecutivo può anche separare la proteina dalla maggior parte delle altre proteine (Figura 8A). Tuttavia, confrontando i due metodi (Figura 7C rispetto figura 8A), la superiorità dei metodi Ni-NTA può essere dimostrata dall'analisi SDS-PAGE. Si consiglia quindi di utilizzare la suaproteina marcata.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figura 8 : risultati rappresentativi per gli esperimenti FPLC (HIC, scambio iole, SEC). (A) Un tipico cromatogramma e 12,5% di acrilammide SDS-PAGE analisi della cromatografia HIC-fenyl dopo la precipitazione del solfato di ammonio (AS) della proteina FAHD1 senza tag, come descritto nella sezione 4 del protocollo. La linea verde riflette la sfumatura del buffer B che non contiene AS. Durante il processo AS viene gradualmente lavato fuori dal sistema. Confrontando questo pannello con la figura 7C si visualizza la potenza della cromatografia di affinità Ni-NTA rispetto al metodo HIC-fenil e il vantaggio di utilizzare un sistema His-tag per la purificazione delle proteine. (B) Un cromatogramma esemplare e 12,5% di acillamina SDS-PAGE analisi della cromatografia di scambio cationico della suaFAHD con tag dopo la purificazione Ni-NTA. Utilizzando un gradiente di sale, il campione applicato viene separato in singole proteine. (C) Un cromatogramma esemplare e un'analisi SDS-PAGE acrilamide del 12,5% della cromatografia di esclusione delle dimensioni G75 della suaFAHD con tag FAHD in seguito alla cromatografia di scambio cationico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Consecutivamente, la proteina è ulteriormente separata dalle contaminazioni resimittuate dalla cromatografia di scambio di cation/anione (ad esempio, figura 8B), seguita dalla cromatografia di esclusione delle dimensioni (ad esempio, vedere la figura 8C). Si consiglia di istituire una strategia di purificazione iniziale in questo ordine; tuttavia, queste colonne devono essere utilizzate in combinazione, successivamente e in variazione, fino a quando la proteina non è sufficientemente pura.
Semplici analisi di attività, al fine di testare le decisioni "sì o no" su substrati attivi e/o cofattori, possono essere eseguiti con le sueproteine con tag dopo la purificazione Ni-NTA, o proteine senza tag dopo la colonna di scambio ionico. Le attività specifiche e le costanti cinetiche devono essere determinate con proteine di massima purezza. La cristallizzazione può essere tentata con le proteine dopo la colonna di scambio ionico, ma la qualità dei cristalli è quasi sempre correlata alla purezza delle proteine. Gli anticorpi policlonali possono essere sollevati contro le proteine in qualsiasi fase del protocollo di purificazione; tuttavia, qui la qualità è anche correlata con la purezza delle proteine.

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

L'espressione e la purificazione delle proteine contenenti idrolasi fumarylacetoacetate sono descritte con esempi (espressione in E. coli, FPLC). Le proteine purificate sono utilizzate per la cristallizzazione e la produzione di anticorpi e impiegate per i saggi enzimatici. Vengono presentati alcuni saggi fotometrici per mostrare la multifunzionalità di FAHD1 come oxaloacetate decarboxylase e idrolasi acylpyruvate.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Il nostro protocollo descrive metodi per un'espressione efficiente e la purificazione del dominio FAH contenente proteine ma anche proteine in generale. La proteina FHD-1 svolge un ruolo regolatore nel ciclo TCA e nel metabolismo energetico dei mitocondri. Siamo stati in grado di associare la downregulation FHD-1 alla senescenza cellulare e le informazioni sull'attività enzimatica e sulla struttura proteica sono generalmente necessarie per comprendere i meccanismi molecolari alla base dei fenotipi osservati.Il vantaggio principale dell'espressione delle proteine attraverso i sistemi vettoriali inducibili IPTG è che tutti i metodi sono relativamente economici e facili da stabilire in qualsiasi laboratorio. Utilizzando proteine di tipo polii istidina in combinazione con resine di nichel NTA agarosio, l'immensa selettività della cromatografia di affinità può essere utilizzata a basso costo. Per la maggior parte degli scopi, le proteine ottenute a questa qualità possono già essere sufficienti.FPLC d'altra parte, è un metodo consolidato e generale con diversi vantaggi rispetto ad altri metodi. In primo luogo, inserire da cinque a 10 nanogrammi di plasmide in 100 microlitri di batteri BL21-DE3 pLysS E.coli competenti sul ghiaccio. Toccare leggermente il tubo per mescolare il contenuto.Tenere i batteri sul ghiaccio per 30 minuti, toccando delicatamente il tubo ogni pochi minuti. Riscaldare uno shaker termo a 42 gradi celsius. Posizionare il tubo contenente i batteri nell'apparecchio e riscaldare per 90 secondi.Quindi, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Dopo cinque o 10 minuti sul ghiaccio, aggiungere 600 microlitri di mezzo NZCYM e posizionare il tubo in un'incubatrice di batteri. Agitare il tubo a media velocità orientato lungo la direzione di scuotimento a 37 gradi celsius per un'ora.Dopo l'incubazione, piastra 200 microlitri della coltura batterica su una piastra di agar LB di 10 centimetri contenente gli antibiotici di selezione di scelta. Coltura i batteri sulla piastra di agar LB nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius durante la notte. Dopo aver avuto successo nella formazione della colonia, scegli una singola colonia e disperdela in cinque millilitri di NZCYM con gli antibiotici selezionati.Coltura nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius durante la notte. Dopo una crescita batterica di successo, amplificare i batteri in 250 millilitri, 500 millilitri o un litro di lotti di mezzo a seconda della domanda di quantità proteica. Quindi, coltura i batteri, nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius per due o tre ore.Dopo l'incubazione, disegnare un campione per l'analisi fotometrica. Se la densità ottica a 600 nanometri ha raggiunto 0,4, applicare 200 micromolari fino a un millimolare di isopropil-beta-D-tiogalactopyranosid. Dopo altre tre o cinque ore nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius l'espressione proteica è esaurita.Raccogliere il pellet batterico tramite centrifugazione a 5.000 volte G per cinque minuti. Quindi, scartare il supernatante e congelare il pellet a meno 20 gradi Celsius per una breve conservazione. Per ogni 250 millilitri di sospensione batterica originale, applicare cinque millilitri del tampone selezionato al pellet batterico.Aggiungere 10 microlitri di beta-mercaptoetanolo per cinque millilitri di tampone applicato. Utilizzare una pipetta Pasteur da 10 millilitri per forzare meccanicamente il pellet in sospensione graffiando e tubazionando. Trasferire tutta la sospensione in un tubo da 50 millilitri.Quindi sonicare la sospensione. Quindi, centrifuga per 30 minuti ad alta velocità a quattro gradi celsius. Filtrare il supernatante consecutivamente con unità filtranti sul ghiaccio.Preparare una colonna di plastica o vetro vuota collegarla a un fermo stabile e lavarla con tampone di corsa in nichel NTA. Per ogni 10 millilitri di sospensione proteica applicare 500 microlitri di liquami di nichel NTA agarosio sulla colonna. Riempire completamente la colonna con tampone di funzionamento in nichel NTA assicurandosi di non interrompere la resina di agarosio e consentire al tampone di passare per gravità.Quindi, applicare la sospensione proteica sulla colonna e consentire al campione di passare per gravità. Dopo che il campione è passato, riempire la colonna con il buffer di funzionamento di nichel NTA. Posizionare una cuvetta trasparente UV sotto la colonna e raccogliere un millilitro di tampone di eluizione di nichel NTA.Controllare la densità ottica del campione a 280 nanometri rispetto a un campione vuoto. In modo ottimale, il campione visualizza una densità ottica maggiore di 2,5. Poiché le proteine FAHD e il tampone di eluizione di nichel NTA precipiteranno al momento del congelamento e dello scongelamento, dializzare la proteina contro un diverso tampone durante la notte sul ghiaccio utilizzando un microlitro di DTT per 100 millilitri di tampone di dialisi.Impostare un sistema FPLC e lavare la colonna con cinque volumi di colonna del 20% di etanolo seguiti da cinque volumi di colonna d'acqua. Dopo aver equilibrato la colonna, applicare il campione dializzato alla colonna e raccogliere il flusso attraverso. Impostare un'eluizione sfumato.Al termine della sfumatura, eseguire con un buffer di sale elevato fino a quando non vengono rilevati altri picchi nell'intervallo di un volume di colonna. Avviare un lettore di microschedi ed equilibrare per 30 minuti a 25 gradi celsius. Preparare un millilitro di una soluzione da 20 millimolare di un substrato da testare nel tampone di dosaggio enzimatico.Secondo lo schema di pipettazione nel protocollo di testo, preparare il vuoto enzimatico e campionare i pozzi pipettando 90 microlitri di tampone enzimatico nei pozzi con cinque microlitri di soluzione enzimatica. Quindi preparare il substrato vuoto e campionare i pozzi pipettando 95 microlitri di tampone di dosaggio enzimatico nei pozzi. Poco prima di misurare, applicare cinque microlitri di tampone enzimatico sui sei pozzi vuoti.Applicare cinque microlitri della soluzione di substrato da 20 millimolare sui pozzi del campione. Utilizzare un pipetto multicanale con impostazione a 50 microliter per mescolare delicatamente i pozzi. Quindi, inserire la piastra nel lettore di microschete e misurare ogni bene a 255 nanometri.Infine, eseguire l'analisi in un foglio di calcolo. Qui sono raffigurati due esempi di piastre di agar LB dopo una trasformazione ottimale e non ottimale. Troppe colonie batteriche indicano che due molti batteri sono stati placcati o che gli antibiotici potrebbero essere scaduti.Troppo poche colonie batteriche possono indicare che o non è stato usato abbastanza plasmide per la trasformazione o che sono stati usati troppi antibiotici per selezionare i batteri. Il pellet batterico contenente la proteina espressa in quantità di milligrammo viene raccolto e l'espressione viene verificata tramite pagina SDS. Alcuni problemi possono verificarsi durante questo processo altrimenti semplice, comprese le proteine che formano corpi di inclusione o la proteina non espressa.Se un His-tag viene utilizzato per etichettare la proteina, la cromatografia di affinità con l'agarosio NTA al nichel è un metodo di cattura facile ed economico che elimina la maggior parte delle contaminazioni. Se non viene utilizzata alcuna etichetta, una combinazione di precipitazione del solfato di ammonio e una cromatografia a scambio idrofobico consecutivo può anche separare la proteina dalla maggior parte delle altre proteine. La proteina è ulteriormente separata dalle contaminazioni degli avanzi per cromatografia a scambio ionico seguita da cromatografia ad esclusione di dimensioni per ottenere una proteina sufficientemente pura.Nessuno dei metodi descritti è difficile in particolare. Ma tutti i metodi richiedono formazione. I primi tentativi possono fallire, ma gli esperimenti avranno successo dopo alcuni adattamenti aggiuntivi.Tutti i metodi qui presentati sono metodi generali di purificazione delle proteine. Sebbene specializzato per le proteine FAHD, il protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina che si desidera purificare. Il FAHD-1 umano ricombinante è stato ottenuto con i metodi descritti e le strutture a raggi X ad alta risoluzione hanno contribuito massicciamente alla nostra comprensione del FAHD-1 per funzionalità che agiscono sia come decarbossilasi che idrolasi.I batteri utilizzati in questo lavoro sono ceppi di sicurezza e non pericolosi. Le guide generali di sicurezza si applicano a tutte le sostanze chimiche e le colonne FPLC devono essere maneggiate con cura.

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