Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

著者は、アナベラ・ピットルによる専門家の技術支援とヘイモ・ピルチャーによるパイロット方法開発に非常に感謝しています。

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

著者は、競合する金銭的利益を開示し、宣言するものは何もありません。H. G. は分子クラフト.HuGs e.U.のCEOCSOであり、カスタム合成を介してこの研究のためにアシルピルビン酸剤を提供しました。P.J.D.の研究室での作業は、オーストリア科学基金(FWF):プロジェクト番号P 31582-B26によって支援されました。この原稿の出版料は、プロジェクト番号P 31582-B26の下でオーストリア科学基金(FWF)によって部分的にカバーされています。A. N. と B. R. プロジェクト P28395-B26 の下でオーストリア科学基金 (FWF) によってサポートされています。

フマリラセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)1、2の超ファミリー酵素は、高度に保存された触媒性FAHドメイン3、4、5、6を共有する酵素群を記述する。,7,8,9,10.共通の触媒中心にもかかわらず、これらの酵素は多機能であり、そのほとんどは原核生物に含まれ、複雑な炭素源から取り出した化合物を分解するために使用される3。この家族の3人のメンバーだけが今のところ真核生物で同定された:FAH2を与える名前、ならびにFAHドメイン含有タンパク質1(FAHD1)11、12、13、14 、15およびFAHドメイン含有タンパク質2(FAHD2)。FAHD1の枯渇は、損なわれたミトコンドリア呼吸13、16と関連しており、中間電位にリンクされている可逆型の細胞老化表現型14と関連している電子輸送システムの欠点。ヒトFAHD1およびそのモデルシステムにおけるそのオルソロゲ(マウス、線虫、癌細胞株、植物など)、ならびに選択された点変異変異体は、潜在的な関心の薬物標的となっている。本研究では、高純度の組換えタンパク質と、結晶構造や選択的抗体によって導かれる触媒機構に関する情報が不可欠です。
本原稿では、大腸菌におけるFAHDタンパク質発現の方法、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、捕食および分析ゲル濾過、結晶化、X線回折、およびフォトメトリックアッセイ。ここで説明する方法とプロトコルの目的は、細菌学、植物生物学、動物や人間の研究などの多様な分野で働く科学者に、FAHスーパーファミリーのメンバーを特徴付けるガイダンスを提供することです。特徴のないスーパーファミリー会員は、特定の分野で関連性を持つ必要があります。ここで説明するプロトコルは、他の原核生物または真核生物FAHスーパーファミリーメンバーを特徴付けることを目的とするプロジェクトに貴重なサポートを提供する可能性があります。
ここで説明する方法の背後にある根拠は、不十分に記述されたタンパク質(特に、未知の生理的関連性の代謝酵素)の特性において、精製組換えタンパク質から始めるアプローチが可能であるという事実である。インビトロ活性酵素製剤、高品質抗体、選択酵素に対する強力かつ特異的な薬理学的阻害剤などの貴重で高品質な研究ツールの開発。記載された方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)およびX線結晶学を必要とする。代替方法(例えば、化学誘導なしでタンパク質を発現させる、または熱処理後の遠心分離によるタンパク質精製を表示し、その後脱塩およびサイズ排除クロマトグラフィーを行う)は、他の場所で17を見出してもよい。FAHスーパーファミリー酵素2、7、9、17、18の発現と精製には幅広い方法が利用可能ですが、本研究は発現と特にFAHDタンパク質の精製。
この原稿の議論部では、FAHD1タンパク質(ヒドロラーゼ、デカルボキシラーゼ)15について同定された触媒機構について、触媒反応の化学的特徴を実証するために、より詳細に説明する。前作7、15、18(PDB:6FOG、PDB:6FOH)に基づいて得られたデータは、ケトエノールイソメラーゼとしての酵素の第3の活性を意味する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

フマリラセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)ドメイン含有タンパク質(FAHD)は、真核生物におけるFAHスーパーファミリーのメンバーを同定する。このスーパーファミリーの酵素は、一般的に、主にヒドロラーゼおよびデカルボキシラーゼ機構を含む多機能性を示す。本稿では、FAHDタンパク質の発現および精製のための一連の連続的な方法を提示し、主にFAHDタンパク質1(FAHD1)のオロローグ(ヒト、マウス、線虫、植物など)を含む。カバーされた方法は、大腸菌、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、準備および分析ゲル濾過、結晶化、X線回折、およびフォトメトリックアッセイにおけるタンパク質発現である。高純度の濃縮タンパク質(>98%)結晶化または抗体産生に使用することができる。類似または低品質のタンパク質は、酵素アッセイに用いられるか、または検出システム(ウェスタンブロット、ELISA)で抗原として使用されてもよい。本研究の議論では、FAHD1の同定された酵素機構について、そのヒドロラーゼおよびデカルボキシラーゼ二機能性をより詳細に説明する。

調製されたクローニングベクターから始まり、BL21(DE3)pLysS大腸菌を購入し、プラスミドをヒートショックまたは任意の適切な代替方法を介して細菌に挿入する(図1)。増幅の短い期間の後、形質転換された細菌は、一晩成長するために、LB寒天プレート上でめっきされます。この時点でのプレートは、さまざまな潜在的なエラー ソースに応じて異なって見える場合があります。プレートは、空(すなわち、コロニーなし)、細菌によって完全に過剰に成長し、またはそれぞれ間に何かであってもよい。最適および非最適な変換後のLB寒天プレートの2つの例を図7Aに示す。あまりにも多くの細菌コロニーは、あまりにも多くの細菌がめっきされた(可能性が高い)か、使用中の抗生物質が期限切れになる可能性があることを示しています(可能性は低い)。あまりにも少ない細菌のコロニーは、十分なプラスミドが変換に使用されなかったか(次回より多くを使用)、または細菌を選択するためにあまりにも多くの抗生物質が使用されたことを示している可能性があります。いずれにせよ、コロニーが存在する場合、2つの選択的抗生物質を使用すると、形質転換されていない細菌が成長する可能性がかなり低いことを意味するので、それらはうまくいくはずです。しかし、コロニーは全く、細菌が変換能力を失ったことを示しています(長期間にわたって間違った貯蔵または貯蔵、繰り返し凍結や解凍などのために)、ヒートショックは成功しませんでした(プラスミド取り込みや細菌は存在しません)。あまりにも多くの熱による死)、クローニングベクターが破損しているか、または誤って選択的抗生物質の間違ったセットが使用された(プラスミドベクター上の耐性遺伝子を検証する)。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> 図 7:細菌形質転換とIMACの代表的な結果。 (A)形質転換BL21(DE3)大腸菌を用いて代表的なLB寒天板を、以下のプロトコルステップ1.1により得た。左:よく分布したコロニーを持つプレート(正の例)。右: 単一のコロニーだけを持つプレート(負の例)。白い円は良い植民地をマークします。赤い円は、互いに近づきすぎて成長しているコロニーを示し、孤立したコロニーが利用可能である限り選択しないでください。(B)一連の誘導制御の12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析(「-」はIPTG誘導の前を示す。「+」は、IPTG誘導後、ペレット収穫前)を示し、総タンパク質の同量に調整する。これは手順 1.2 で説明します。(C) 彼のタグ付きFAHD1タンパク質のNi-NTA精製の例示的な12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析。これは、プロトコルのセクション 3 で説明します。親和性クロマトグラフィーは、高純度(>70%、黒い矢印)のタンパク質を得るが、いくつかの小さな汚染も観察される(赤い矢印)。これらの汚染は、カラムに結合する非FAHDタンパク質と、FAHDタンパク質に結合するタンパク質から構成されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
検証済みのコロニーが選択され、選択されます。栄養培地で増幅した後、タンパク質発現は化学IPTGの適用によって引き起こされる。発現タンパク質をミリグラム量で含む細菌ペレットを収穫し、発現をSDS-PAGEを介して検証する(例えば図7B参照)。この単純なプロセス中に、いくつかの問題が発生する可能性があります。まず、いくつかのタンパク質は、明らかに宿主細菌の自然代謝を妨げるので、包含体を形成する。これは、ヒトFAHD1およびFAHD2のいくつかの点突然変異について観察された。このような場合、昆虫細胞のような他の発現系がより適切であり、考慮されるべきである。昆虫細胞からペレットを採取した後、例えば、タンパク質の精製は、このプロトコルに記載されているのと同じ手順に従う。第二に、DE3-pETシステムは「漏れ」であることが時々見出される(すなわち、タンパク質はIPTG誘導の前にある程度発現している)。この潜在的な理由はよく理解されていませんが、冷たい部屋のインキュベーターで一晩ゆっくりとタンパク質を発現するのに役立つ可能性があります。第3に、タンパク質は発現しない。これはおそらく最悪のシナリオであり、プラスミドベクターが破損している可能性が高いため、プラスミドを配列することをお勧めします。
His-tagを使用してタンパク質にタグを付けた場合、Ni-NTAアガロースとの親和性クロマトグラフィーは、汚染の大部分を排除する簡単で安価な捕捉方法です(図7C)。 他のタグシステム(STREP-IIなど)にも同様の方法が存在します。タグを使用しなかった場合、硫酸アンモニウム沈殿と連続した疎水性交換クロマトグラフィーの組み合わせは、タンパク質を他のタンパク質の大部分から分離することも得られる(図8A)。しかし、2つの方法(図7C対図8A)を比較すると、Ni-NTA法の優位性はSDS-PAGE解析によって実証することができる。したがって、彼のタグ付きタンパク質を使用することをお勧めします。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> 図 8: FPLC実験(HIC、イオン交換、SEC)の代表的な結果。 (A)典型的なクロマトグラムおよび12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析は、スルビ酸アンモニウム(AS)後のHIC-フェニルクロマトグラフィーの非タグ付きFAHD1タンパク質の沈殿物を、プロトコルのセクション4に記載する。緑色の線は、AS を含まないバッファ B のグラデーションを反映します。プロセス中にASは徐々にシステムから洗い流される。このパネルを図7Cと比較すると、HIC-フェニル法と比較したNi-NTAアフィニティクロマトグラフィーのパワーと、タンパク質精製にHis-tagシステムを用いた利点を表示します。 (B)Ni-NTA精製後の彼のタグ付きFAHDのカチオン交換クロマトグラフィーの例示的なクロマトグラムおよび12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析。塩勾配を用いて、適用されたサンプルは個々のタンパク質に分離される。(C)例示的なクロマトグラムおよび12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析のG75サイズ排除クロマトグラフィーの彼-タグ付きFAHDのカチオン交換クロマトグラフィーに続く。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
連続して、タンパク質は、カチオン/アニオン交換クロマトグラフィーによって残りの汚染からさらに分離され(例えば、図8Bを参照)、その後にサイズ排除クロマトグラフィーが続きます(例えば、図8Cを参照)。この順序で初期精製戦略を設定することをお勧めします。しかし、これらのカラムは、タンパク質が十分に純粋になるまで、その後、その後、バリエーションで組み合わせて使用する必要があります。
単純活性アッセイは、活性基質および/または共因子に関する「はいまたはなし」の決定をテストするために、Ni-NTA精製後のHisタグ付きタンパク質、またはイオン交換カラム後のタグ付けされていないタンパク質で行われてもよい。特定の活性および運動定数は、最高の純度のタンパク質で決定されなければならない。結晶化は、イオン交換カラムの後にタンパク質で試みられるかもしれませんが、結晶の品質は、ほとんどの場合、タンパク質の純度と相関します。ポリクローナル抗体は、精製プロトコルの任意の段階でタンパク質に対して上昇してもよい。しかし、ここでの品質はタンパク質純度とも相関する。

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質のフマリアルセトー酢酸水素の発現および精製は、例(大腸菌、FPLCにおける発現)と記載されている。精製タンパク質は、結晶化および抗体産生に使用され、酵素アッセイに使用されます。選択されたフォトメトリックアッセイは、オキサロアセテートデカルボキシラーゼおよびアシルピルベートヒドロラーゼとしてFAHD1の多機能性を表示するために提示される。

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

我々のプロトコルは、タンパク質を含むFAHドメインの効率的な発現および精製のための方法を記述するが、一般的にタンパク質も含む。FHDタンパク質-1は、TCAサイクルおよびミトコンドリアのエネルギー代謝における調節的役割を果たす。FHD-1のダウンレギュレーションを細胞老化に関連付けることができ、観察されたフェノタイプの背後にある分子メカニズムを理解するために、酵素活性とタンパク質構造に関する情報が一般的に必要とされています。IPTG誘導ベクターシステムを介してタンパク質を発現する主な利点は、すべての方法が比較的安価で、どの実験室でも確立しやすいということです。ニッケルNTAアガロース樹脂と組み合わせてポリヒスチジン型タンパク質を用いることで、アフィニティークロマトグラフィーの膨大な選択性を低コストで採用できます。ほとんどの目的で、この品質で得られたタンパク質は既に十分かもしれません。他方の手のFPLCは、他の方法と比較していくつかの利点を有する十分に確立された一般的な方法である。まず、プラスミドの5〜10ナノグラムを氷上の有能なBL21-DE3 pLysS大腸菌の100マイクロリットルに挿入します。内容物を混ぜるためにチューブを少しタップします。細菌を氷の上に30分間置き、数分おきにチューブを軽くたたきます。サーモシェーカーを摂氏42度に加熱します。細菌を含むチューブを装置に入れ、90秒間加熱します。その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。氷上で5〜10分後、NZCYM培地の600マイクロリットルを追加し、細菌インキュベーターにチューブを入れます。37°Cで37°Cの方向に向けた中速で1時間振ります。インキュベーション後、選択した抗生物質を含む10センチメートルLB寒天プレート上の細菌培養のプレート200マイクロリットル。一晩37°Cで細菌インキュベーター中のLB寒天プレート上の細菌を培養する。コロニー形成に成功した後、1つのコロニーを選び、選択した抗生物質で5ミリリットルのNZCYMに分散させる。一晩摂氏37度で細菌インキュベーターの培養。細菌の増殖に成功した後、タンパク質量の需要に応じて、250ミリリットル、500ミリリットルまたは1リットルの培地で細菌を増幅する。次いで、細菌を培養し、37°Cで2〜3時間培養する。インキュベーションに続いて、フォトメトリック解析用のサンプルを描画します。600ナノメートルでの光学密度が0.4に達した場合、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドの1ミリモルまで200マイクロモルを適用する。37°Cのタンパク質発現で細菌インキュベーターでさらに3〜5時間後に排出されます。5,000回Gで5,000回の遠心分離を介して細菌ペレットを5分間収穫する。その後、上清を捨て、ペレットをマイナス20度で凍結して短い保管を行います。元の細菌懸濁液の各250ミリリットルに対して、選択した緩衝液の5ミリリットルを細菌ペレットに塗布する。塗布バッファーの 5 ミリリットルあたり β-メルカプトエタノールの 10 マイクロリットルを追加します。.10ミリリットルのパスツールピペットを使用して、傷やピペット加工でペレットをサスペンションに機械的に強制します。すべての懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。その後、サスペンションを超音波処理します。次に、4°Cで高速で30分間遠心分離機。氷上のフィルターユニットで連続して上清をフィルターします。安定したリテーナーに取り付け、ニッケルNTAランニングバッファで洗浄することで、空のプラスチックまたはガラスカラムを準備します。タンパク質懸濁液の各10ミリリットルのために、カラムにニッケルNTAアガローススラリーの500マイクロリットルを適用する。カラムにニッケルNTAランニングバッファを完全に充填し、アガロース樹脂を破壊せず、バッファを重力で通します。次に、カラムにタンパク質懸濁液を塗布し、サンプルを重力で通り抜けさせます。サンプルが通過したら、ニッケルNTAランニングバッファでカラムを充填します。カラムの下にUV透明キュベットを置き、ニッケルNTA溶出バッファーの1ミリリットルを収集します。280ナノメートルのサンプルとブランクのサンプルの光学密度を確認してください。最適な方法では、サンプルは2.5を超える光学密度を表示します。FAHDタンパク質とニッケルNTA溶出バッファーは凍結と解凍時に沈殿するため、透析バッファーの100ミリリットルあたり1マイクロリットルのDTTを使用して、氷上で一晩異なるバッファーに対してタンパク質を透析します。FPLCシステムを設定し、20%エタノールの5つのカラムボリュームとそれに続く5カラムの水量でカラムを洗浄します。カラムを平衡化した後、透析サンプルをカラムに適用し、流れを通して集めます。グラデーションの溶出を設定します。勾配が終了した後、1 つの列の体積の範囲でそれ以上のピークが検出されないまで、高塩バッファーで実行します。マイクロプレートリーダーを起動し、摂氏25度で30分間平衡化します。酵素アッセイバッファーで試験される基質の 20 ミリモル溶液の 1 ミリリットルを準備します。.テキストプロトコルのピペッティングスキームに従って、酵素のブランクとサンプルウェルを、酵素液の5マイクロリットルで90マイクロリットルの酵素アッセイバッファーを井戸にピペット処理して調製します。次に、95マイクロリットルの酵素アッセイバッファーをウェルにピペット処理して、基板ブランクとサンプルウェルを調製します。測定の直前に、6つのブランクウェルに5マイクロリットルの酵素アッセイバッファーを塗布します。サンプルウェルに20ミリモル基板溶液の5マイクロリットルを塗布します。50マイクロリットルの設定でマルチチャンネルピペットを使用して、ウェルを穏やかに混ぜます。次に、プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、255ナノメートルで各ウェルを測定します。最後に、スプレッドシートで分析を実行します。最適な変換と最適でない変換後の LB 寒天プレートの 2 つの例を以下に示します。あまりにも多くの細菌コロニーは、2つの多くの細菌がメッキされたか、抗生物質が期限切れである可能性があることを示しています。あまりにも少ない細菌コロニーは、形質転換のために十分なプラスミドが使用されなかったか、細菌を選択するためにあまりにも多くの抗生物質が使用されたことを示している可能性があります。ミリグラム量で発現したタンパク質を含む細菌ペレットを収穫し、SDS-pageを介して発現を検証する。この単純なプロセスの間に、封入体を形成するタンパク質や発現していないタンパク質を含むいくつかの問題が発生する可能性があります。Hisタグを使用してタンパク質にタグを付ける場合、ニッケルNTAアガロースによるアフィニティークロマトグラフィーは、汚染の大部分を排除する簡単で安価な捕獲方法です。タグが使用されていない場合、硫酸アンモニウム沈殿と連続した疎水性交換クロマトグラフィーの組み合わせも、他のタンパク質の大部分からタンパク質を分離してもよい。このタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーにより残りの汚染からさらに分離され、その後サイズ排除クロマトグラフィーが続き、十分に純粋なタンパク質を得る。特に記載された方法のいずれも困難ではない。しかし、すべての方法はトレーニングを必要とします。最初の試みは失敗するかもしれませんが、いくつかの追加の適応の後に実験は成功します。ここに示す全ての方法はタンパク質精製の一般的な方法である。FAHDタンパク質に特化しているが、プロトコルは、精製したい任意のタンパク質に適合することができる。組換えヒトFAHD-1は、記載された方法と高解像度のX線構造によって得られ、両方として作用する機能性、脱炭酸酵素およびヒドロラーゼによってFAHD-1の我々の理解に大きく貢献した。この作業で使用される細菌は安全株であり、危険ではありません。一般的な安全ガイドは、すべての化学物質に適用され、FPLCカラムは注意して取り扱う必要があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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