Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Forfatterne er svært takknemlig for ekspert teknisk assistanse av Annabella Pittl og pilot metoden utvikling av Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre og erklære ingen konkurrerende finansielle interesser. H. G. er CEOCSO på MoleculeCrafting. klemmer EU og gitt acylpyruvates for denne studien via Custom syntese. Arbeid i P. J. D. s Lab ble støttet av den østerrikske Science Fund (FWF): prosjektnummer P 31582-B26. Publikasjons Gebyrene for dette manuskriptet har delvis blitt dekket av det østerrikske vitenskaps fondet (FWF) underprosjekt nummer P 31582-B26. A. N. og B. R. støttes av det østerrikske vitenskaps fondet (FWF) under prosjektet P28395-B26.

Kritiske trinn
FAHD proteiner er svært følsomme for salt konsentrasjoner. Ved lave NaCl konsentrasjoner, kan proteinene utløse ved tine, men de kan vanligvis være fullt rekonstituert ved høyere salt konsentrasjoner. Det vil si at hvis et FAHD protein precipitates av en eller annen grunn, kan det utvinnes eller ombrettes med høyere salt konsentrasjoner (> 300 μM). Noen mer hydrofobe proteiner, men kan ikke gjenopprettes (for eksempel humant FAHD2), men vaskemidler som gutter (maks 1%) eller glyserol (10%) kan brukes til å holde dem i stabil løsning. I alle fall anbefales sjokk frysing med flytende nitrogen og lagring ved-80 ° c, da det er en skånsom og langsom prosess med tine.
Noen uventede problemer kan oppstå under ni-NTA rensing i trinn 3.1.10. Av notatet, en høyere OD i den andre samlet prøven enn i den første prøven indikerer et for høyt volum av agarose harpiks (ta et notat og bruke mindre harpiks i neste eksperiment). Også, den agarose harpiks selv fører til en OD signal på 280 NM (dvs. avbrudd av agarose harpiks seng vil gi kunstige signaler). I tilfelle tvil, er det anbefalt å bruke andre metoder som en Bradford eller BSA-analysen for å bestemme protein konsentrasjoner.
I enzymatisk analyser, er det tre kritiske aspekter som skal vurderes. Først vurdere proteinkonsentrasjon er avgjørende for å få de riktige spesifikke aktiviteter. Nivået av renhet av proteinet er å påvirke resultatet og må anslås. I tilfelle av Tagged protein, massen av tag-delen må beregnes, og den spesifikke aktiviteten må være tilsvarende korrigert. For enkle analyser beskrevet i punkt 7 i protokollen, er ni-NTA renhet tilstrekkelig til å skille mellom aktive og inaktive underlag, kofaktorer, etc. I tilfelle av mer komplekse Michaelis-Menten Kinetics, må alle reaktant og substrat konsentrasjoner fastsettes riktig. Spesielt når du bruker oxaloacetate (som automatisk decarboxylates over tid) enzymatisk del av reaksjonen må rettes for Auto-dekarboksylering (under forutsetning av at begge reaksjonene oppstår samtidig). Initial endringer i den optiske tettheten signal adressert til keto-ENOL tautomeri av underlaget må vurderes. For det tredje må konsentrasjonen og volumene justeres. En reaksjon med definerte konsentrasjoner av enzym og substrat kan gi ulike resultater avhengig av analysen volum. Hvis det er for mye enzym per brønn, kan vedheft av væsken faktisk bias resultatet.
For å vurdere Michaelis-Menten Kinetics anbefales det å utføre innledende eksperimenter i 100 μL, 200 μL og 300 μL-batcher for å finne den optimale kombinasjonen. Lignende aspekter gjelder forholdet mellom enzym-substrat konsentrasjoner for kinetisk analyser. For mye enzym per substrat eller for mye substrat per enzym sette systemet utenfor den lineære steady-state Michaelis rekkevidde. Første eksperimenter er nødvendig for å optimalisere disse forholdene. Eksemplarisk justering for humant FAHD1 (vill-type) protein er gitt i punkt 8, noe som resulterer i kinetisk diagrammer (som presentert i figur 5B, for eksempel).
For krystallisering en dråpe protein løsning er Pipet tert i sentrum av en dekkglass og blandet med en dråpe av krystallisering cocktail, som vanligvis består av en buffer (f. eks, Tris-HCl, HEPES) og en overilet (f. eks, polyetylen glykol, ammonium sulfat). En dråpe av hemmer løsning for co-krystallisering (for eksempel oksalat i denne protokollen) kan eventuelt brukes. Dekkglass blir deretter plassert opp-ned over en brønn av reservoar som inneholder krystallisering cocktail, tetting av brønnen luften tett ved hjelp av tetningsmasse olje (figur 6b). Ideelt sett skjer det ingen nedbør i løpet av begynnelsen av eksperimentet, noe som betyr at proteinet forblir i løsningen. Siden overilet konsentrasjon i reservoaret er høyere enn i drop, begynner drop å miste vann ved fordampning i atmosfæren av brønnen til likevekt med reservoaret er nådd. Spredningen av vann inn i reservoaret fører til en langsom volumreduksjon av dråpe som igjen fører til en økning av både, protein og overilet konsentrasjon i drop. Hvis protein løsningen når ønsket tilstand av super-metning og dermed meta-stabilitet, spontan kjernedannelse etterfulgt av krystallvekst kan forekomme. Å nå overmettet tilstand er en nødvendig, men ikke tilstrekkelig forutsetning for krystallisering. Krystallisering av proteiner trenger begge, gunstige termodynamisk og kinetisk forhold, og avhenger sterkt av de uforutsigbare egenskapene til proteinet som skal krystallisert22.
Modifikasjoner og feilsøking
Uttrykk for protein i E. coli kan være ineffektiv. Varierende IPTH-konsentrasjoner, uttrykks temperatur og forsterknings tid, for eksempel romtemperatur i flere timer eller i kaldt rom over natten, må kanskje testes for hvert nye protein for å finne optimale forhold. Nedbør av protein i inkludering organer er noen ganger observert for mer hydrofobe FAHD proteiner. I slike tilfeller, protein uttrykk i andre modellsystemer som insekt celler anbefales, som inkludering organer er mindre sannsynlighet for å danne26.
Som FAHD proteiner er følsomme for salt og kofaktor konsentrasjoner, samt pH, rensing strategier for ulike homologe, orthologues, og punkt mutasjon varianter kan variere i individuelle innstillinger. Den rensing metoder beskrevet er utviklet for vill-type menneske og mus FAHD1 protein. Konsentrasjoner av kjemikalier, slik som NaCl og imidazole, samt pH, må tilpasses for individuelle proteiner med et annet isoelectric punkt (pI). Også av notatet, ikke alle hans-Tagged protein kan binde godt til en ni-nTa harpiks. Hvis proteinbinding til ni-NTA kolonnen er ineffektiv, tilpassede konsentrasjoner av NaCl og imidazole, samt varierende pH-forhold i ni-NTA kjører buffer kan bidra til å forbedre kvaliteten på utfallet. Hvis ikke, hoppe over ni-NTA trinn og fortsetter til trinn av ioniske utveksling kromatografi kan også føre til en vellykket rensing strategi. Hvis et protein binder seg til ni-NTA kolonnen, men kan ikke eluert fra kolonnen, tillegg av noen mM EDTA kan bidra til å forstyrre ni2 + kompleks.
Når det gjelder prosessen med krystallisering, må det forstås at selv-organisering av store og komplekse protein molekyler i en vanlig periodisk gitter er en iboende usannsynlig prosess som avhenger tungt på vanskelig å kontrollere kinetisk parametre. Selv små endringer i oppsettet brukes for krystallisering kan dramatisk endre resultatet og ingen krystaller vil danne. Protein renhet er generelt av største betydning. Som en tommelfingerregel, en tungt overbelastet SDS-side gel bør ikke vise andre band. I tillegg kan rekkefølgen som trinnene utføres i, påvirke utfallet. Som et eksempel, for å sikre reproduserbarhet, er det ofte nødvendig å holde pipettering sekvensen det samme, så først legge til protein, og til slutt legge overilet til krystallisering dråpe (eller vice versa). Uansett hvilken metode som brukes, bør det holdes det samme når du prøver å reprodusere eller skalere opp eksperimenter. Hvis ingen krystaller observeres etter denne protokollen, kan den kjemiske overilet sammensetning, pH, dråpestørrelse og protein-til-utfelling ratio varieres i små trinn. Tålmodighet og konsekvente observasjoner av dråpene er av dyd.
Bemerkninger til katalysatorer av FAHD1
De presenterte metodene er utviklet spesielt for å oppnå FAHD1 proteiner av høy kvalitet. Denne aktiverte veksten av FAHD1 krystaller samt prosjektering av krystaller som inneholder FAHD1 complexed til en hemmer (oksalat, PDB: 6FOG). The X-ray strukturer gir en 3D-arkitektur av enzymet ' s katalysator. Disse resultatene etablere en omfattende beskrivelse av rester potensielt viktig for katalysatoren av dette spennende enzymet. FAHD1 ble først beskrevet for å kunne holde acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senere ble det funnet at FAHD1 opererer også som en decarboksilaza av oxaloacetate12. Selv om underlaget acylpyruvate og oxaloacetate er forskjellige kjemiske andeler, den kjemiske transformasjoner dele mechanistically den strategiske kløften av en felles singel C3-C4 Bond, energisk tilrettelagt hvis C3 -C4 Bond orbitale bo ortogonale til π-orbitale i C2-karbonyl15. En slik konformasjon tillater resonans stabilisering av C3-carbanion midlertidig dannet under kløften prosessen. Den FAHD1 underlag (oxaloacetate og acylpyruvates) er fleksible molekyler og kan eksistere i tautomeric (keto-ENOL) samt C2-hydrert skjemaer (figur 9a). Equilibria mellom de ulike artene bestemmes hovedsakelig av arten av buffer sammensetning som brukes, pH og tilstedeværelsen av metall ioner. I det følgende diskuterer vi hypothetic mekanistisk scenarier inspirert av analyse av X-ray krystallstrukturer som avslørte katalysatoren sentrum av FAHD1.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2.jpg"> Figur 9 : Detaljer om den foreslåtte katalysatoren for menneskelig FAHD1. (A) Oxaloacetate finnes i krystallinsk tilstand så vel som i nøytral løsning hovedsakelig i Z-ENOL skjema24. Men under Fysiologiske pH-forhold på 2-keto skjemaet er den dominerende representasjon25. (B) kjemisk skisse av hFAHD1 hulrom15 med mg-Bound oxaloacetate (venstre) og acylpyruvate (høyre, med R1 som økologisk hvile, den røde pilen betegner et nukleofil angrep av tilstøtende stabilisert vann molekyl) (se diskusjon). (C) sammenligning av favoriserte konformasjonen for C3-C4 kløft i decarboksilaza (b til C) og Hydrolase (b ' til c) mekanisme FAHD1: begge prosessene resultere i mg-complexed pyruvat-enolate (se diskusjon). Mellom produkter b og b forventes å bli stabilisert av Q109, som skissert i panel B (se diskusjon). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Den Decarboksilaza aktivitet av FAHD1
Oxaloacetate finnes i krystallinsk tilstand så vel som i nøytral løsning hovedsakelig i Z-ENOL skjema24. Men det ble vist at under Fysiologiske pH-forhold (buffer forholdene ved pH 7,4) den 2-keto form er den dominerende representasjon av oxaloacetate25 (figur 9a), og at enolization er ikke en forutsetning for dekarboksylering27 . Av notatet, mg2 + ioner har ingen innflytelse på forholdet mellom de oxaloacetate artene ved en pH på 7,4 eller under28. Transponering av oxaloacetate keto form i katalysatoren sentrum av FAHD1 (guidet av den bundne oksalat i complexed enzymet (PDB: 6FOG15)) avdekket rester Q109 som en conformational regulator av bundet oxaloacetate15. Som beskrevet i en annen artikkel15, er hydrogen binding til Carbamoyl gruppe Q109 stabiliserer en oxaloacetate-konformasjon som følge av rotasjon rundt C2-C3 Bond (figur 9B, venstre panel). Som en konsekvens av denne rotasjonen, C3-c4 Bond (skal kløyvde) vedtar en nær ortogonale disposisjon i forhold til π-orbitale av C2-karbonyl (figur 9C). Karbondioksid kan frigis. Det primære produktet av denne prosessen vil være resonans stabilisert mg-enolate av pyruvat. Det er kjent fra undersøkelser av oxaloacetate-mg komplekser at enolate danner den mest stabile kompleks28,29. Forutsatt en sammenlignbar stabilitet for en mg-pyruvat enolate-kompleks kofaktor av FAHD1 kan bli blokkert, men lysin rester K123 kan protonere pyruvat-enolate i en likevekt for å forby tap av kofaktor15.
Den gitte tolkningen antyder pyruvat ENOL som en distinkt mellomliggende i katalysatoren-funksjonen til FAHD1. På dette trinnet i hypotetisk gjennomsnitt modellen, gir eksperimentelle data ikke noen ytterligere indikasjon på hvorfor det lukkede lokket skal åpne for å løsne produktet. Det kan utledes imidlertid at den foreslåtte mekanismen ser ut som et enzym hemming av produktet: krystallstrukturen avslører en bevart vann molekyl holdt i retningsbestemt orientering mot FAHD1 katalysatorer sentrum av rester H30 og E33 presentert i en kort Helix15, som er indusert ved ligand binding og lokk lukking. Hvis den primære ENOL ville bo i en likevekt med enolate, kan resonans stabilisert enolate være slukket å pyruvat av vann molekylet. Den resulterende hydroksyl ville være i stand til å fortrenge pyruvat fra mg-kofaktor hvorpå lokket ville åpne. Til slutt vil katalysatoren bli restaurert i mitokondrie miljø. I denne hypothetic scenario, ville hulrom vann molekylet operere som en syre, henholdsvis.
Hydrolase aktivitet av FAHD1
Hydrolase aktivitet av et enzym implisitt krever den mellomliggende dannelsen av en hydroksyl nukleofilen. Denne mekanismen er vanligvis funnet i kombinasjon med syre-base katalysator aktivitet. Overgangs staten reaksjonen må være forberedt via conformational kontroll av kritiske aminosyre side kjeder i hulrommet. I analogi til drøfting av decarboksilaza funksjon, enzym-bundet acylpyruvate i 2-keto form vil bli satt under conformational kontroll av hydrogen-binding av 4-karbonyl oksygen til Q109 (figur 9B, høyre panel). Krystallstrukturen av oksalat-bundet FAHD1 (PDB: 6FOG) avslører en bevart vann molekyl holdt i retningsbestemt orientering mot FAHD1 katalysator sentrum av rester H30 og E33 presentert i en kort Helix15. Den E33-H30 Dyad er kompetent til å deprotonate retningsbestemt posisjonert vann og den resulterende hydroksyl er i ideell disposisjon for å angripe 4-karbonyl av acylpyruvate presentert under conformational kontroll av Q10915.
Av notatet, en lignende mekanisme har blitt foreslått for FAH18. Angrep av hydroksyl nukleofilen forventes å resultere i en oxyanion Art, som er stabilisert på orbital kontrollerte C3-C4 Bond kløft (figur 9C). I denne modellen, C3-c4 Bond rotasjon (figur 9C) skjer etter nukleofil angrepet av dannet hydroksyl indikert i figur 9B (dvs. forbereder acylpyruvate for obligasjons kløften). De primære produktene vil være eddiksyre og mg-pyruvat enolate. I dette hypothetic scenariet kan eddiksyre slukke ENOL til pyruvat og deretter bistå forskyvning av produktet. Over en pH på 7,5 og i nærvær av mg ioner, acylpyruvates finnes i en likevekt mellom keto-og ENOL-former, sistnevnte i liten preferanse30. Mest sannsynlig begge formene er i stand til å binde til kofaktor av FAHD1 under påfølgende lokk lukking. Behandling av enolic acylpyruvate underlag av enzymet er hemmet på grunn av den flate strukturen av ENOL-formen. C3-c4 kløft vil resultere i en vinyliske carbanion uten resonans stabilisering.
Derfor foreslår vi en katalysator ketonization skritt for å forberede for angrep av hydroksyl nukleofilen på acyl karbonyl. Denne prosessen av ketonization, men ville kreve kontroll over Proton transpositions av FAHD1 rester, som ville attributt en iboende isomerase aktivitet til FAHD1. Det er rapportert at Surhet av mg-bundet ENOL hydrogen avslører en 10000-fold økning i forhold til un-complexed form28. En deprotonering av mg bundet ENOL-form vil være gjennomførbart ved un-protonerte K123. Deprotonering av K123 kan bli assistert av carboxylat av D102. Et hydrogen bånd nettverk dannet av rester D102-K47-K123 kunne operere som den nødvendige Proton relé i katalysatoren sentrum av FAHD115. En slik dannet mellomliggende enolate kan da bli slukket av en E33-H30-H20 triaden under ketonization av underlaget15. Den 2-keto form ville komme under conformational kontroll av Q109, og samtidig dannet hydroksyl ville angripe acyl karbonyl. Sammendraget diskusjonen innebærer en kontroll av FAHD1 om et vann molekyl for å bytte mellom syre og base gjennom samspillet mellom hulrom-forming rester.
Future søknader eller retninger av metoden
Fremtidige anvendelser av metodene som er beskrevet her er mange. En overflod av prokaryote medlemmer av FAH overfamilie fremdeles venter funksjonell karakterisering. Selv tilgjengelig informasjon om katalysatorer av kjente FAH overfamilie medlemmer er knappe, og i de fleste tilfeller, basert på teoretiske forutsetninger snarere enn eksperimentelle data. Anvendelse av metodene som er beskrevet her for prokaryote FAH overfamilie medlemmer avhenger av spesifikke forskningsinteresser i bakteriologi. På den annen side, den siste demonstrasjonen som eukaryote FAH overfamilie medlemmer spille viktige roller i ulike cellulære rom (f. eks stoffer g. mitokondrier) fremhever behovet for å bedre karakterisere disse proteinene (tre av dem har vært identifisert så langt), spesielt fordi dagens data tyder på at noen uncharacterized proteiner kan utføre ulike funksjoner i sammenheng med mitokondrie biologi, aldring forskning, og kreftforskning. Det er foreslått at full molekylær og fysiologisk karakterisering av disse eukaryote FAH overfamilie medlemmer kan gi viktig innsikt i viktige felt av moderne forskning i biomedisinsk sektor. Mer forskning på mekanismer for FAHD1 (og beslektede enzymer) er nødvendig for å bedre forstå mekanismer underliggende bi-funksjonaliteten til FAHD1, som fortsatt ikke er fullt avklart. Ytterligere studier med FAHD1 mutanter, NMR-undersøkelser, og strukturelle studier på inhibitor komplekser kan bidra til å løse de sanne mekanistisk scenarier som FAHD1 synes å være kompetent. Videre, dataassistert design av ENOL etterligner stand til å binde til mg-kofaktor vil til slutt føre til potente hemmere av FAHD1.

Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah)1,2 overfamilie av enzymer beskriver en gruppe enzymer som deler den svært bevarte katalysator Fah domene3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10. til tross for deres felles katalysator sentrum, disse enzymene er multi-funksjonell, og de fleste er funnet i prokaryoter, hvor de brukes til å bryte ned forbindelser Hentet fra komplekse karbon kilder3. Bare tre medlemmer av denne familien ble identifisert i Landplantenes så langt: navnet gir Fah2, så vel som Fah domene-inneholdende protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 og Fah domene-inneholdende PROTEIN 2 (FAHD2). Forringelse av FAHD1 har blitt assosiert med nedsatt mitokondrie åndedrett13,16 og assosiert med en reversibel type mobil senescence fenotype14 som er knyttet til mellomliggende potensial mangler i elektron transportsystemet. Human FAHD1 og dens orthologues i modellsystemer (mus, nematode, kreftcelle linjer, planter, etc.), samt utvalgte punkt mutasjon varianter, har blitt druggable mål av potensiell interesse. For denne forskningen er rekombinant protein på høye nivåer av renhet, samt informasjon om katalysatorer styrt av krystallstrukturer og selektive antistoffer avgjørende.
Dette manuskriptet beskriver metoder for FAHD protein uttrykk i E. coli, affinitet kromatografi, ion Exchange kromatografi, ammonium sulfat nedbør, preparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, X-ray Diffraksjon, og fotometriske analyser. Formålet med metoder og protokoller er beskrevet her er å gi veiledning for forskere som arbeider i ulike felt som bakteriologi, plante biologi, samt dyre-og menneskelige studier, å karakterisere medlemmer av FAH overfamilie, inkludert uncharacterized overfamilie medlemmer skulle de bli relevante i et bestemt felt. Protokollene beskrevet her kan gi verdifull støtte til prosjekter som tar sikte på å karakterisere andre prokaryote eller eukaryote FAH overfamilie medlemmer.
Begrunnelsen bak metodene som er beskrevet her er det faktum at for karakterisering av dårlig beskrevet proteiner (spesielt, metabolske enzymer av ukjent fysiologisk relevans), tilnærmingen til å starte med renset rekombinant proteiner gjør utvikling av uvurderlig, høy kvalitet forskningsverktøy som in vitro aktive enzym preparater, høy kvalitet antistoffer, og potente og spesifikke farmakologiske hemmere for utvalgte enzymer. De beskrevne metodene krever raske protein flytende kromatografi (FPLC) og røntgen crystallography. Alternative metoder (f. eks, for å uttrykke protein uten kjemisk induksjon, eller for å vise protein rensing av sentrifugering etter varmebehandling etterfulgt av avsaltingsspisser overlegne sammenlignet og størrelses eksklusjon kromatografi), kan finnes andre steder17. Mens et bredere spekter av metoder er tilgjengelig for uttrykk og rensing av Fah overfamilie enzymer2,7,9,17,18, fokuserer dette arbeidet på uttrykket og spesielt rensing av FAHD proteiner.
I diskusjons delen av dette manuskriptet er katalysatoren som identifiseres for FAHD1-proteinet (Hydrolase, decarboksilaza)15 , nærmere beskrevet, for å demonstrere den kjemiske karakteren til de katalysert reaksjonene. Dataene innhentet basert på tidligere arbeid7,15,18 (pdb: 6FOG, pdb: 6FOH) innebærer en tredje aktivitet av enzymet som keto-ENOL isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Fumarylacetoacetate Hydrolase (FAH) domene inneholder proteiner (FAHD) er identifisert medlemmer av FAH overfamilie i Landplantenes. Enzymer i denne overfamilie generelt vise multi-funksjonalitet, involverer hovedsakelig Hydrolase og decarboksilaza mekanismer. Denne artikkelen presenterer en rekke påfølgende metoder for uttrykk og rensing av FAHD proteiner, hovedsakelig FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues blant arter (menneskelig, mus, nematoder, planter, etc.). Dekkede metoder er protein uttrykk i E. coli, affinitet kromatografi, ion Exchange kromatografi, preparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, X-ray Diffraksjon, og fotometriske analyser. Konsentrert protein av høy grad av renhet (> 98%) kan være ansatt for krystallisering eller antistoff produksjon. Proteiner av tilsvarende eller lavere kvalitet kan anvendes i enzym analyser eller brukes som antigener i deteksjons systemer (Western-Blot, ELISA). I diskusjonen om dette arbeidet, er de identifiserte enzymatisk mekanismer for FAHD1 skissert for å beskrive sin Hydrolase og decarboksilaza bi-funksjonalitet i mer detalj.

Starter med en forberedt kloning vektor og kjøpt BL21 (DE3) PLysS E. coli, er plasmider satt inn i bakterier via varme-sjokk eller en passende alternativ metode (figur 1). Etter en kort periode med forsterkning, de transformert bakteriene er belagt på LB agar plater, for å vokse over natten. Platene på dette punktet kan se annerledes ut, avhengig av en rekke potensielle feilkilder. Platene kan være tomme (dvs. ingen kolonier), fullstendig overgrodd av bakterier, eller noe i mellom, henholdsvis. To eksempler på LB agar plater etter optimal og ikke-optimal transformasjon er avbildet i figur 7a. For mange bakterie kolonier indikerer enten at for mange bakterier var belagt (sannsynlig) eller at antibiotika i bruk kan være utløpt (usannsynlig). For få bakterie kolonier kan tyde på at enten ikke nok plasmider ble brukt for transformasjon (bruk mer neste gang) eller at for mye antibiotika ble brukt til å velge bakterier. I alle fall, hvis koloniene er til stede, bør de være i orden, som bruker to selektive antibiotika innebærer en heller ubetydelig sjanse for transformert bakterier å vokse. Ingen kolonier i det hele tatt, derimot, indikerer at enten bakteriene mistet sin transformasjon kompetanse (på grunn av feil lagring eller lagring over lengre perioder, repeterende fryse og tine, etc.), varme-sjokk var ikke vellykket (ingen plasmider opptak eller bakteriell død av for mye varme), er kloning vektoren ødelagt, eller ved en feiltakelse satt av selektiv antibiotika ble brukt (verifisere motstanden genet på plasmider vektor).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figur 7 : Representative resultater for bakterie transformasjon og iMac. (A) representant lb agar plater med transformert BL21 (DE3) E. coli, fremstilt ved å følge protokollen trinn 1,1. Venstre: en tallerken med godt fordelte kolonier (positivt eksempel). Høyre: en tallerken med bare en enkelt koloni (negativt eksempel). Hvite sirkler markerer gode kolonier. Den røde sirkelen markerer kolonier som vokser for nær hverandre og bør ikke plukkes så lenge isolerte kolonier er tilgjengelige. (B) en 12,5% akrylamid SDS-side analyse av en rekke induksjon kontroller ("-" indikerer før ipth induksjon; "+" indikerer etter IPTH induksjon, før pellet innhøsting), justert til like mengder av totalt protein. Dette er beskrevet i trinn 1,2. (C) en eksemplarisk 12,5% akrylamid SDS-side analyse av ni-nTa rensing av hans-Tagged FAHD1 protein. Dette er beskrevet i punkt 3 i protokollen. Affinitet kromatografi gir protein av høy renhet (> 70%, svart pil), men flere små forurensninger er også observert (røde piler). Disse forurensninger består av ikke-FAHD proteiner som binder til kolonnen, og fra proteiner som binder til FAHD protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Validerte kolonier velges og plukkes. Etter forsterkning i nærende medium utløses protein uttrykk ved anvendelse av den kjemiske IPTH. Den bakterielle pellet som inneholder uttrykt protein i mg mengder høstes, og uttrykket er verifisert via SDS-side (se for eksempel figur 7b). Noen problemer kan oppstå under denne ellers enkle prosessen. Først noen proteiner form inkludering organer, fordi de tydeligvis liksom forstyrre den naturlige metabolismen av verten bakterier. Dette ble observert for noen punkt mutasjoner av menneskelig FAHD1 og FAHD2. I slike tilfeller kan andre uttrykks systemer som insekt celler være mer hensiktsmessig og bør vurderes. Etter høsting av en pellet fra insekts celler, for eksempel, følger rensing av proteinene de samme trinnene som beskrevet i denne protokollen. For det andre er DE3-pET -systemet noen ganger funnet å være "lekk" (dvs. protein er allerede uttrykt til en viss grad før ipth induksjon). Den potensielle årsaken til dette er ikke godt forstått, men det kan bidra til å uttrykke proteinet langsomt over natten i et kaldt rom inkubator. For det tredje uttrykkes ikke protein. Dette er trolig den verst-case scenario, som det sannsynlig indikerer en ødelagt plasmider vektor og dermed tilrådelig å sekvens av plasmider.
Hvis en hans-tag ble brukt til å merke proteinet, affinitet kromatografi med ni-nTa agarose er en enkel og billig fangst metode eliminerer flertallet av forurensninger (figur 7C). Lignende metoder finnes for andre tag systemer (f. eks STREP-II). Hvis ingen tag ble brukt, en kombinasjon av ammonium sulfat nedbør og påfølgende hydrofobe utveksling kromatografi kan også skille proteinet fra de fleste andre proteiner (figur 8a). Men å sammenligne de to metodene (figur 7C vs figur 8a), OVERLEGENHET av ni-nTa metoder kan bli DEMONSTRERT ved SDS-side analyse. Ved hjelp av hans-Tagged protein er derfor anbefales.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figur 8 : Representative resultater for FPLC eksperimenter (hic, ion Exchange, SEC). (A) en typisk kromatogram og 12,5% akrylamid SDS-side analyse av hic-fenyl kromatografi etter ammonium SULFAT (AS) utfelling av umerkede FAHD1 protein, som beskrevet i punkt 4 i protokollen. Den grønne linjen gjenspeiler graderingen av buffer B som ikke inneholder AS. Under prosessen AS blir gradvis vasket ut fra systemet. Sammenligning av dette panelet til figur 7C viser kraften i ni-nTa affinitet kromatografi i forhold til hic-fenyl metoden, og fordelen av å bruke en hans-tag system for protein rensing. (B) en eksemplarisk kromatogram og 12,5% akrylamid SDS-side analyse av kationiske utvekslings kromatografi av hans-Tagged FAHD etter ni-nTa rensing. Ved hjelp av en salt gradient er anvendt prøven delt inn i individuelle proteiner. (C) en eksemplarisk kromatogram og 12,5% akrylamid SDS-side analyse av G75 størrelse utelukkelse kromatografi av hans-Tagged FAHD følgende kationiske utveksle kromatografi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Etter hvert blir proteinet ytterligere adskilt fra leftover-forurensninger ved anion utvekslings kromatografi (for eksempel se figur 8B), etterfulgt av kromatografi for størrelses ekskludering (se for eksempel figur 8c). Det anbefales å sette opp en innledende rensing strategi i denne rekkefølgen; Imidlertid bør disse kolonnene brukes i kombinasjon, senere og i variasjon, til proteinet er tilstrekkelig ren.
Enkel aktivitet analyser, for å teste for "Ja eller nei" beslutninger på aktive underlag og/eller kofaktorer, kan utføres med hans-Tagged proteiner etter ni-nTa rensing, eller umerkede proteiner etter den joniske utveksling kolonnen. Spesifikke aktiviteter og kinetisk konstanter må fastsettes med protein av høyeste renhet. Krystallisering kan forsøkes med proteiner etter den joniske utvekslings søylen, men kvaliteten på krystallene samsvarer nesten alltid med protein renhet. Polyklonale antistoffer kan heves mot proteiner på ethvert Stadium i rense protokollen; men her kvaliteten også samsvarer med protein renhet.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Uttrykk og rensing av fumarylacetoacetate Hydrolase som inneholder proteiner er beskrevet med eksempler (uttrykk i E. coli, FPLC). Renset proteiner brukes for krystallisering og antistoff produksjon og ansatt for enzym analyser. Utvalgte fotometriske analyser presenteres for å vise multi-funksjonaliteten til FAHD1 som oxaloacetate decarboksilaza og acylpyruvate Hydrolase.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Vår protokoll beskriver metoder for effektiv uttrykk og rensing av FAH-domene som inneholder proteiner, men også proteiner generelt. FHD protein-1 spiller en regulatorisk rolle i TCA-syklusen og energimetabolismen av mitokondrier. Vi var i stand til å knytte FHD-1 nedregulering til cellulær senescence og informasjon om enzymaktivitet og proteinstruktur er generelt nødvendig for å forstå molekylære mekanismer bak observerte fenotyper.Den største fordelen med å uttrykke proteiner via IPTG induknelige vektorsystemer er at alle metoder er relativt billige og enkle å etablere i ethvert laboratorium. Ved å bruke poly-histidin type proteiner i kombinasjon med nikkel NTA agarose harpikser, den enorme selektivitet affinitet kromatografi kan brukes til lave kostnader. For de fleste formål kan protein oppnådd ved denne kvaliteten allerede være tilstrekkelig.FPLC derimot, er en veletablert og generell metode med flere fordeler sammenlignet med andre metoder. Først setter du inn fem til 10 nanogram plasmid i 100 mikroliter med kompetente BL21-DE3 pLysS E.coli-bakterier på is. Trykk litt på røret for å blande innholdet.Hold bakteriene på is i 30 minutter, og bank forsiktig på røret med noen få minutter. Varm en termoshaker til 42 grader celsius. Plasser røret som inneholder bakteriene i apparatet og varme i 90 sekunder.Deretter plasserer du røret på isen umiddelbart. Etter fem til ti minutter på is, tilsett 600 mikroliter NZCYM medium og legg røret i en bakterieinkubator. Rist røret i middels hastighet orientert langs ristingsretningen ved 37 grader celsius i en time.Etter inkubasjon, plate 200 mikroliter av bakteriell kultur på en 10 centimeter LB agar plate som inneholder valg antibiotika av valget. Kultur bakteriene på LB agar plate i bakterieinkubatoren på 37 grader celsius over natten. Etter vellykket kolonidannelse, velg en enkelt koloni og spre den i fem milliliter NZCYM med de valgte antibiotika.Kultur i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius over natten. Etter vellykket bakteriell vekst, forsterke bakteriene i 250 milliliter, 500 milliliter eller en liter grupper av medium avhengig av etterspørselen av proteinmengde. Deretter kultur bakteriene, i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius i to til tre timer.Etter inkubasjon tegner du en prøve for fotometrisk analyse. Hvis den optiske tettheten på 600 nanometer har nådd 0,4, gjelder 200 mikromos opptil en millimolar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Etter tre til fem timer i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius proteinuttrykk er utmattet.Høst bakteriepellet via sentrifugering ved 5000 ganger G i fem minutter. Deretter kast overnatanten og frys pelleten ved minus 20 grader celsius for kort lagring. For hver 250 milliliter original bakteriell suspensjon, påfør fem milliliter av den valgte bufferen til bakteriell pellet.Legg til 10 mikroliter beta-mercaptoetanol per fem milliliter anvendt buffer. Bruk en 10 milliliter Pasteur pipet å mekanisk tvinge pellet til suspensjon ved riper og pipettering. Overfør hele suspensjonen til et 50 milliliter rør.Deretter sonikere suspensjonen. Deretter sentrifuge i 30 minutter ved høy hastighet på fire grader celsius. Filtrer supernatanten etter hverandre med filterenheter på is.Forbered en tom plast- eller glasskolonne ved å feste den til en stabil holder og vask med nikkel NTA løpebuffer. For hver 10 milliliter protein suspensjon gjelder 500 mikroliter nikkel NTA agarose slurry til kolonnen. Fyll kolonnen helt med nikkel NTA kjører buffer sikre ikke å forstyrre agarose harpiks og la bufferen å kjøre gjennom av tyngdekraften.Deretter påfør proteinsuspensjonen på kolonnen og la prøven kjøre gjennom av tyngdekraften. Når prøven har gått gjennom, fyller du kolonnen med nikkel NTA kjører buffer. Plasser en UV gjennomsiktig cuvette under kolonnen og samle en milliliter nikkel NTA elution buffer.Kontroller den optiske tettheten til prøven ved 280 nanometer kontra en tom prøve. Optimalt viser prøven en optisk tetthet på mer enn 2,5. Siden FAHD-proteiner og nikkel NTA elution buffer vil utløse ved frysing og tining, dialyser proteinet mot en annen buffer over natten på is ved hjelp av en mikroliter DTT per 100 milliliter dialysebuffer.Sett opp et FPLC-system og vask kolonnen med fem kolonnevolumer på 20 % etanol etterfulgt av fem kolonnevolumer vann. Etter å ha likevektskolonnen, bruk den dialyzed prøven på kolonnen og samle flyten gjennom. Definere en graderingsution.Når graderingen er ferdig, kjører du med høy saltbuffer til det ikke oppdages flere topper over området for ett kolonnevolum. Start opp en mikroplateleser og likevekt i 30 minutter ved 25 grader celsius. Forbered en milliliter av en 20 millimolar løsning av et substrat som skal testes i enzymanalysebuffer.I henhold til pipetteringsordningen i tekstprotokollen, klargjør enzymet tomt og prøver brønner ved å pipettere 90 mikroliter enzymanalysebuffer inn i brønnene med fem mikroliter av enzymløsning. Deretter klargjør substratet blankt og prøver brønner ved å pipettere 95 mikroliter av enzymanalysebuffer inn i brønnene. Rett før måling, påfør fem mikroliter med enzymanalysebuffer til de seks tomme brønnene.Påfør fem mikroliter av den 20 millimolar substratløsningen på prøvebrønnene. Bruk en flerkanals pipet ved 50 mikroliterinnstilling for å blande brønnene forsiktig. Deretter setter du platen inn i mikroplateleseren og måler hver brønn på 255 nanometer.Til slutt utfører du analysen i et regneark. To eksempler LB agar plater etter optimal og ikke-optimal transformasjon er avbildet her. For mange bakterielle kolonier indikerer enten at to mange bakterier ble belagt eller at antibiotika kan utløpes.For få bakterielle kolonier kan tyde på at enten ikke nok plasmid ble brukt til transformasjonen eller at for mye antibiotika ble brukt til å velge bakteriene. Bakteriepellet som inneholder det uttrykte proteinet i mg mengder høstes og uttrykket verifiseres via SDS-siden. Noen problemer kan oppstå under denne ellers enkle prosessen, inkludert proteiner som danner inklusjonsorganer eller proteinet som ikke uttrykkes.Hvis en His-tag brukes til å tagge proteinet, er affinitetkromatografi med nikkel NTA agarose en enkel og billig fangstmetode som eliminerer de fleste forurensninger. Hvis ingen tag brukes, kan en kombinasjon av ammoniumsulfatnedbør og en påfølgende hydrofob utveksling kromatografi også skille proteinet fra de fleste andre proteiner. Proteinet er videre skilt fra rester forurensninger ved iion utveksling kromatografi etterfulgt av størrelse utelukkelse kromatografi for å oppnå et tilstrekkelig rent protein.Ingen av de beskrevne metodene er spesielt vanskelige. Men alle metoder krever opplæring. Første forsøk kan mislykkes, men eksperimentene vil lykkes etter noen ekstra tilpasninger.Alle metoder som presenteres her er generelle metoder for proteinrensing. Selv om spesialisert for FAHD proteiner, protokollen kan tilpasses ethvert protein man ønsker å rense. Rekombinant human FAHD-1 er oppnådd ved de beskrevne metodene og høyoppløselige røntgenstrukturer bidro massivt til vår forståelse av FAHD-1 ved funksjonalitet som fungerer som både dekarboksylase og hydrolase.Bakterier som brukes i dette arbeidet er sikkerhetsstammer og ikke farlige. Generelle sikkerhetsveiledninger gjelder for alle kjemikalier og FPLC-kolonner bør håndteres med forsiktighet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våte og tørre lab teknikker for å lede Krystallisering av Store Coiled-spiral inneholder proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttrykk, Krystallisering og Biofysiske Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverte nukleotidpyrofosforylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttrykk, Solubilization og rensing av eukaryote Borate transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriell uttrykk og rensing av human matrise Metalloproteinase-3 ved hjelp av affinitet kromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...