Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Os autores são muito gratos pela assistência técnica especializada de Annabella Pittl e pelo desenvolvimento do método piloto por Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar e declarar nenhum interesse financeiro concorrente. H. G. é CEOCSO em MoleculeCrafting. HuGs e.U. e forneceu acylpyruvates para este estudo através da síntese feita encomenda. O trabalho no laboratório do P. J. D. foi apoiado pelo Austrian Science Fund (FWF): número de projeto P 31582-B26. As taxas de publicação para este manuscrito foram parcialmente cobertas pelo fundo austríaco de ciência (FWF) o número de projeto P 31582-B26. A. N. e B. R. são apoiados pelo Austrian Science Fund (FWF) o projeto P28395-B26.

A hidrolase de fumarilacetoacetato (Fah)1,2 superfamília de enzimas descreve um grupo de enzimas que compartilham o domínio catalítico altamente conservado do Fah3,4,5,6 , 7 anos de , 8 . º , 9 anos de , 10. apesar de seu centro catalítico comum, estas enzimas são multifuncionais, e a maioria são encontrados em procariontes, onde eles são usados para quebrar compostos recuperados de fontes de carbono complexas3. Somente três membros desta família foram identificados nos eucariotas até agora: o nome que dá Fah2, assim como a proteína de domínio-contendo do Fah 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 e Fah proteína contendo domínio 2 (FAHD2). A depleção de FAHD1 tem sido associada à respiração mitocondrial prejudicada13,16 e associada a um tipo reversível de fenótipo de senescência celular14 que está ligado ao potencial intermediário deficiências no sistema de transporte de elétrons. Human FAHD1 e seus ortologues em sistemas modelo (mouse, nematódeo, linhas de células cancerosas, plantas, etc.), bem como variantes de mutação de ponto selecionadas, tornaram-se alvos druggable de interesse potencial. Para esta pesquisa, a proteína recombinante em altos níveis de pureza, bem como informações sobre os mecanismos catalíticos guiados por estruturas cristalinas e anticorpos seletivos são vitais.
Este manuscrito descreve métodos para expressão protéica de FAHD em E. coli, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, precipitação de sulfato de amônio, filtração de gel preparativo e analítico, cristalização, difração de raios X e ensaios fotométricos. O objetivo dos métodos e protocolos descritos aqui é fornecer orientação para cientistas que trabalham em diversos campos, como bacteriologia, biologia vegetal, bem como estudos em animais e humanos, para caracterizar os membros da superfamília FAH, incluindo Membros da superfamília não caracterizados devem tornar-se relevantes em um determinado campo. Os protocolos aqui descritos podem fornecer suporte valioso para projetos que visem caracterizar outros membros da superfamília procariótica ou eucariótica.
A fundamentação subjacente aos métodos descritos aqui é o fato de que para a caracterização de proteínas mal descritas (em particular, enzimas metabólicas de relevância fisiológica desconhecida), a abordagem para iniciar com proteínas recombinantes purificadas permite que o desenvolvimento de ferramentas de pesquisa inestimáveis e de alta qualidade, como preparações enzimáticas ativas in vitro, anticorpos de alta qualidade e inibidores farmacológicos potentes e específicos para enzimas selecionadas. Os métodos descritos exigem a cromatografia líquida rápida da proteína (FPLC) e o crystallography do raio X. Os métodos alternativos (por exemplo, para expressar a proteína sem indução química, ou para indicar a purificação da proteína pela centrifugação após o tratamento térmico seguido pelo dessalinização e pela cromatografia da exclusão do tamanho), podem ser encontrados em outra parte17. Quando um espectro mais largo dos métodos está disponível para a expressão e a purificação de enzimas da superfamília de Fah2,7,9,17,18, este trabalho centra-se sobre a expressão e purificação das proteínas FAHD em particular.
Na seção de discussão deste manuscrito, os mecanismos catalíticos identificados para a proteína FAHD1 (hidrolase, decarboxilase)15 são descritos em mais detalhes, a fim de demonstrar o caráter químico das reações catalisadas. Os dados obtidos com base no trabalho anterior7,15,18 (PDB: 6fog, PDB: 6foh) implicam uma terceira atividade da enzima como keto-enol isomerase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

As proteínas contendo domínio de fumarylacetoacetate hidrolase (Fah) (Fahd) são membros identificados da superfamília Fah em eucariontes. As enzimas desta superfamília geralmente exibem multifuncionalidade, envolvendo principalmente mecanismos de hidrolase e decarboxilase. Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de proteínas FAHD, principalmente FAHD proteína 1 (FAHD1) ortologues entre as espécies (humano, rato, nematodes, plantas, etc.). Os métodos cobertos são expressão protéica em e. coli, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, filtração preparativa e analítica de gel, cristalização, difração de raios X e ensaios fotométricos. Proteína concentrada de altos níveis de pureza (> 98%) podem ser empregadas para a cristalização ou produção de anticorpos. Proteínas de qualidade semelhante ou inferior podem ser empregadas em ensaios enzimáticos ou usadas como antígenos em sistemas de detecção (Western-blot, ELISA). Na discussão deste trabalho, os mecanismos enzimáticos identificados de FAHD1 são esboçados para descrever mais detalhadamente sua bi-funcionalidade do hidrolase e do descarboxilase.

Começando com um vetor de clonagem preparado e comprado BL21 (DE3) plyss e. coli, o plasmídeo é inserido nas bactérias através de choque térmico ou qualquer método alternativo apropriado (Figura 1). Após um curto período de amplificação, as bactérias transformadas são chapeadas em placas de agar LB, a fim de crescer durante a noite. As placas neste ponto podem parecer diferentes, dependendo de uma variedade de fontes de erro potenciais. As placas podem estar vazias (ou seja, sem colônias), completamente cultivadas por bactérias, ou algo entre, respectivamente. Dois exemplos de placas de agar LB após a transformação ideal e não ideal são representados na Figura 7a. Demasiadas colônias bacterianas indicam ou que muitas bactérias foram chapeadas (provavelmente) ou que os antibióticos em uso podem ser expirados (improvável). Poucas colônias bacterianas podem indicar que não foi utilizado plasmídeo suficiente para a transformação (use mais próxima vez) ou que muitos antibióticos foram usados para selecionar as bactérias. Em qualquer caso, se as colônias estão presentes, eles devem estar bem, como o uso de dois antibióticos seletivos implica uma chance bastante insignificante de bactérias não transformadas para crescer. Nenhuma colônia, no entanto, indica que ou as bactérias perderam sua competência de transformação (por causa do armazenamento errado ou armazenamento em períodos mais longos, congelamento repetitivo e degelo, etc.), o calor-choque não foi bem sucedido (sem absorção de plasmídeo ou bactérias morte por muito calor), o vetor de clonagem está corrompido, ou por engano um conjunto errado de antibióticos seletivos foi usado (verificar o gene de resistência no vetor plasmídeo).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figura 7 : Resultados representativos para a transformação de bactérias e iMac. (A) placas de agar lb representativas com BL21 (de3) E. colitransformadas, obtidas seguindo a etapa de protocolo 1,1. Esquerda: uma placa com colônias bem distribuídas (exemplo positivo). Direita: uma placa com apenas uma única colônia (exemplo negativo). Círculos brancos marcam boas colônias. O círculo vermelho marca as colônias que estão crescendo demasiado perto de se e não deve ser escolhida contanto que as colônias isoladas estiverem disponíveis. (B) uma análise de SDS-PAGE de acrilamida a 12,5% de uma série de controles de indução ("-" indica antes da indução de IPTG; "+" indica após a indução de IPTG, antes da colheita da pelota), ajustado às quantidades iguais de proteína total. Isso é descrito na etapa 1,2. (C) um exemplar 12,5% acrilamida SDS-PAGE análise de NI-NTA purificação de his-Tagged FAHD1 proteína. Isso é descrito na seção 3 do protocolo. A cromatografia de afinidade produz proteínas de alta pureza (> 70%, seta preta), no entanto, várias pequenas contaminações também são observadas (setas vermelhas). Estas contaminações consistem em proteínas não-FAHD que se ligam à coluna, e de proteínas que se ligam à proteína FAHD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Colônias validadas são selecionadas e escolhidas. Após a amplificação em meio nutritivo, a expressão protéica é desencadeada pela aplicação do produto químico IPTG. A pelota bacteriana contendo a proteína expressa em quantidades de miligrama é colhida, e a expressão é verificada via SDS-PAGE (ver, por exemplo, a Figura 7B). Alguns problemas podem ocorrer durante este processo de outra forma simples. Em primeiro lugar, algumas proteínas formam corpos de inclusão, porque aparentemente de alguma forma interferem com o metabolismo natural das bactérias hospedeiras. Isto foi observado para algumas mutações do ponto de FAHD1 e de FAHD2 humanos. Nesses casos, outros sistemas de expressão como as células de insetos podem ser mais apropriados e devem ser considerados. Após a colheita de uma pelota de células de insetos, por exemplo, a purificação das proteínas segue os mesmos passos descritos neste protocolo. Em segundo lugar, o sistema DE3-pET é encontrado às vezes para ser "Leaky" (isto é, a proteína é expressada já em alguma extensão antes da indução de IPTG). O motivo potencial para isso não é bem compreendido, mas pode ajudar a expressar a proteína lentamente durante a noite em uma incubadora de sala fria. Em terceiro lugar, nenhuma proteína é expressa. Este é provavelmente o cenário do pior caso, como ele provavelmente indica um vetor de plasmídeo corrompido e, portanto, aconselhável para sequenciar o plasmídeo.
Se um seu-tag foi usado para etiquetar a proteína, a cromatografia de afinidade com o agarose de NI-NTA é um método fácil e barato da captação que elimina a maioria das contaminações (Figura 7C). Existem métodos semelhantes para outros sistemas de Tags (por exemplo, Strep-II). Se nenhuma tag foi usada, uma combinação de precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca hidrofóbica consecutiva também pode separar a proteína da maioria das outras proteínas (figura 8a). No entanto, comparando os dois métodos (Figura 7C versus figura 8a), a superioridade dos métodos NI-NTA pode ser DEMONSTRADA pela análise de SDS-PAGE. A utilização da proteína his-Tagged é, portanto, aconselhada.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figura 8 : Resultados representativos para experimentos de FPLC (HIC, troca iónica, SEC). (A) um cromatograma típico e uma análise de 12,5% de ACRYLAMIDA SDS-PAGE da cromatografia de HIC-Phenyl após a precipitação do sulfato de amónio (como) da proteína FAHD1 Untagged, como descrito na seção 4 do protocolo. A linha verde reflete o gradiente do buffer B que não contém AS. Durante o processo como é gradualmente lavado para fora do sistema. Comparando este painel com a Figura 7C exibe o poder da cromatografia de afinidade NI-NTA em comparação com o método HIC-Phenyl, e a vantagem de usar um sistema his-tag para purificação de proteínas. (B) um cromatograma exemplar e 12,5% de ACRILAMIDA SDS-PAGE análise de cromatografia de troca catiônica de sua-TAGGED Fahd após apurificação de NI-NTA. Usando um gradiente de sal, a amostra aplicada é separada em proteínas individuais. (C) um cromatograma exemplar e uma análise de 12,5% de acrilamida SDS-PAGE de cromatografia de exclusão de tamanho G75 da sua-Tagged Fahd após cromatografia de troca catiônica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Consecutivamente, a proteína é ainda mais separada das contaminações remanescentes por cromatografia de troca catiónica/Anion (por exemplo, ver Figura 8B), seguida por cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, ver Figura 8C). É aconselhável estabelecer uma estratégia de purificação inicial nesta ordem; no entanto, essas colunas devem ser usadas em combinação, subseqüentemente e em variação, até que a proteína seja suficientemente pura.
Ensaios de atividade simples, para testar as decisões "Sim ou não" sobre substratos ativos e/ou cofatores, podem ser realizados com proteínas marcadas após a purificação de NI-NTA ou proteínas não marcadas após a coluna de troca iónica. Atividades específicas e constantes cinéticas devem ser determinadas com proteínas de maior pureza. A cristalização pode ser tentada com proteínas após a coluna de troca iónica, mas a qualidade dos cristais quase sempre se correlaciona com a pureza da proteína. Anticorpos policlonais podem ser levantados contra proteínas em qualquer fase do protocolo de purificação; no entanto, aqui a qualidade também se correlaciona com a pureza da proteína.

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Expressão e purificação de proteínas contendo domínio de fumarilacetoacetato hidrolase é descrita com exemplos (expressão em E. coli, FPLC). As proteínas purificadas são utilizadas para a cristalização e produção de anticorpos e empregadas para ensaios enzimáticos. Os ensaios fotométricos selecionados são apresentados para exibir a multifuncionalidade de FAHD1 como oxaloacetato descarboxilase e acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Nosso protocolo descreve métodos de expressão eficiente e purificação do domínio FAH contendo proteínas, mas também proteínas em geral. A proteína FHD-1 desempenha um papel regulatório no ciclo TCA e no metabolismo energético das mitocôndrias. Conseguimos associar a desregulamentação do FHD-1 à senescência celular e informações sobre atividade enzimática e estrutura proteica são geralmente necessárias para entender mecanismos moleculares por trás dos fenótipos observados.A principal vantagem de expressar proteínas através de sistemas vetoriais indutíveis IPTG é que todos os métodos são relativamente baratos e fáceis de estabelecer em qualquer laboratório. Usando proteínas do tipo poli-histidina em combinação com resinas de níquel NTA, a imensa seletividade da cromatografia de afinidade pode ser empregada a baixo custo. Para a maioria dos propósitos, a proteína obtida nessa qualidade já pode ser suficiente.FPLC por outras mãos, é um método bem estabelecido e geral com várias vantagens em comparação com outros métodos. Primeiro, insira de 5 a 10 nanogramas de plasmídeos em 100 microliters de bactérias competentes BL21-DE3 pLysS E.coli no gelo. Toque ligeiramente no tubo para misturar o conteúdo.Mantenha as bactérias no gelo por 30 minutos, batendo suavemente no tubo a cada poucos minutos. Aqueça um agitador termo a 42 graus celsius. Coloque o tubo contendo as bactérias no aparelho e aqueça por 90 segundos.Em seguida, coloque o tubo no gelo imediatamente. Depois de cinco a 10 minutos no gelo, adicione 600 microliters de meio NZCYM e coloque o tubo em uma incubadora de bactérias. Agite o tubo em velocidade média orientada ao longo da direção de agitação a 37 graus celsius durante uma hora.Após a incubação, placa 200 microliters da cultura bacteriana em uma placa de ágar lb de 10 centímetros contendo os antibióticos de seleção de escolha. Cultue as bactérias na placa de ágar LB na incubadora de bactérias a 37 graus celsius durante a noite. Após a formação bem sucedida da colônia, escolha uma única colônia e disperse-a em cinco mililitros de NZCYM com os antibióticos selecionados.Cultura na incubadora de bactérias a 37 graus celsius durante a noite. Após o sucesso do crescimento bacteriano, amplie as bactérias em 250 mililitros, 500 mililitros ou um litro de médio, dependendo da demanda de quantidade de proteína. Em seguida, cultura as bactérias, na incubadora de bactérias a 37 graus celsius por duas a três horas.Após a incubação, desenhe uma amostra para análise fotométrica. Se a densidade óptica a 600 nanômetros atingiu 0,4, aplique 200 micromolar até um milímetro de isopropílico-beta-D-tiogalactopyranosid. Depois de mais três a cinco horas na incubadora de bactérias a 37 graus celsius a expressão proteica está esgotada.Colher a pelota bacteriana através de centrífugas a 5.000 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, descarte o supernasce e congele a pelota a menos 20 graus celsius para um breve armazenamento. Para cada 250 mililitros de suspensão bacteriana original, aplique cinco mililitros do tampão selecionado à pelota bacteriana.Adicione 10 microliters de beta-mercaptoetanol por cinco mililitros de buffer aplicado. Use uma tubulação Pasteur de 10 mililitros para forçar mecanicamente a pelota em suspensão, coçando e pipetando. Transfira toda a suspensão para um tubo de 50 mililitros.Em seguida, sonicar a suspensão. Em seguida, centrífuga por 30 minutos em alta velocidade a quatro graus celsius. Filtre o sobrenatante consecutivamente com unidades de filtro no gelo.Prepare uma coluna de plástico ou vidro vazia, anexando-a a um retentor estável e lavando com tampão de corrida NTA de níquel. Para cada 10 mililitros de suspensão proteica aplicam 500 microliters de níquel NTA agarose slurry à coluna. Encha a coluna completamente com o buffer de execução NTA de níquel garantindo não interromper a resina agarose e permitir que o buffer passe por gravidade.Em seguida, aplique a suspensão proteica na coluna e permita que a amostra passe por gravidade. Depois que a amostra passar, encha a coluna com o buffer de execução NTA de níquel. Coloque um cuvette transparente UV abaixo da coluna e colete um mililitro de tampão de eluição de níquel NTA.Verifique a densidade óptica da amostra em 280 nanômetros versus uma amostra em branco. O ideal é que a amostra exiba uma densidade óptica superior a 2,5. Uma vez que as proteínas FAHD e o tampão de elução de níquel NTA precipitarão após o congelamento e o descongelamento, digelam a proteína contra um buffer diferente durante a noite no gelo usando um microliter de DTT por 100 mililitros de tampão de diálise.Configure um sistema FPLC e lave a coluna com cinco volumes de coluna de 20% de etanol seguido de cinco volumes de coluna de água. Após equilibrar a coluna, aplique a amostra dialisada na coluna e colete o fluxo através. Configure uma elução de gradiente.Após o gradiente ter terminado, execute com tampão de sal alto até que não sejam detectados mais picos ao longo da faixa de um volume de coluna. Inicie um leitor de microplacão e equilibre por 30 minutos a 25 graus celsius. Prepare um mililitro de uma solução de 20 mililitros de um substrato a ser testado no tampão de ensaio de enzimas.De acordo com o esquema de pipetação no protocolo de texto, prepare a enzima em branco e prove poços, pipetando 90 microliters de tampão de ensaio enzimático nos poços com cinco microlitadores de solução enzimático. Em seguida, prepare o substrato em branco e amostra de poços, pipetando 95 microliters de tampão de ensaio de enzimas nos poços. Logo antes de medir, aplique cinco microliters de tampão de ensaio de enzimas nos seis poços em branco.Aplique cinco microlitadores da solução de substrato de 20 mililitros nos poços de amostra. Use uma tubulação multicanal a 50 configurações de microliter para misturar suavemente os poços. Em seguida, insira a placa no leitor de microplacão e meça cada poço a 255 nanômetros.Por fim, realize a análise em uma planilha. Dois exemplos de placas de ágar LB após a transformação ideal e não ideal são retratados aqui. Muitas colônias bacterianas indicam que duas bactérias foram banhadas ou que os antibióticos podem expirar.Poucas colônias bacterianas podem indicar que ou não foi usado plasmídeo suficiente para a transformação ou que muitos antibióticos foram usados para selecionar as bactérias. A pelota bacteriana contendo a proteína expressa em quantidades de miligramas é colhida e a expressão é verificada através da página SDS. Alguns problemas podem ocorrer durante esse processo simples, incluindo as proteínas que formam corpos de inclusão ou a proteína que não está sendo expressa.Se uma sua tag é usada para marcar a proteína, a cromatografia de afinidade com níquel NTA agarose é um método de captura fácil e barato eliminando a maioria das contaminações. Se nenhuma etiqueta for usada, uma combinação de precipitação de sulfato de amônio e uma cromatografia de troca hidrofóbica consecutiva também podem separar a proteína da maioria das outras proteínas. A proteína é ainda separada das contaminações remanescentes pela cromatografia de troca de íons, seguida pela cromatografia de exclusão de tamanho para obter uma proteína suficientemente pura.Nenhum dos métodos descritos é difícil em particular. Mas todos os métodos exigem treinamento. As primeiras tentativas podem falhar, mas os experimentos terão sucesso após algumas adaptações adicionais.Todos os métodos aqui apresentados são métodos gerais de purificação de proteínas. Embora especializado em proteínas FAHD, o protocolo pode ser adaptado a qualquer proteína que se queira purificar. O FAHD-1 humano recombinante foi obtido pelos métodos descritos e estruturas de raios-X de alta resolução contribuíram maciçamente para a nossa compreensão do FAHD-1 por funcionalidade atuando como ambos, decarboxilase e hidrolase.As bactérias utilizadas neste trabalho são cepas de segurança e não são perigosas. As guias gerais de segurança aplicam-se a todos os produtos químicos e as colunas FPLC devem ser tratadas com cuidado.

Research

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Biochemistry

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