Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Авторы очень благодарны за экспертную техническую помощь Аннабеллы Питтл и разработку пилотного метода Хаймо Пирчера.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать и не заявлять о конкурирующих финансовых интересах. H. G. является CEOCSO на MoleculeCrafting.HuGs E.U. и при условии acylpyruvates для этого исследования с помощью пользовательского синтеза. Работа в лаборатории P. J. D. была поддержана Австрийским научным фондом (FWF): номер проекта P 31582-B26. Плата за публикацию этой рукописи частично покрывалась Австрийским научным фондом (FWF) под номером проекта P 31582-B26. A. N. и B. R. поддерживаются Австрийским научным фондом (FWF) в рамках проекта P28395-B26.

Гидролазаце ао фумариацетата (FAH)1,2 суперсемейства ферментов описывает группу ферментов, которые разделяют высоко консервированный каталитический домен FAH3,4,5,6 , 7 (г. , 8 , 9 До 9 , 10. Несмотря на их общий каталитический центр, эти ферменты являются многофункциональными, и большинство из них находятся в прокариот, где они используются для расщепчения соединений, извлеченных из сложных источников углерода3. Только три члена этой семьи были определены в эукариоты до сих пор: имя дает FAH2, а также FAH домена, содержащего белок 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 и FAH домен-содержащий белок 2 (FAHD2). Истощение FAHD1 было связано с нарушением митохондриального дыхания13,16 и связано с обратимым типом клеточного фенотипа сенотипа14, который связан с промежуточным потенциалом недостатки в электронной транспортной системе. Человек FAHD1 и его ортологии в модельных системах (мышь, нематод, линии раковых клеток, растения и т.д.), а также отдельные варианты точечных мутаций стали зависимыми мишенями потенциального интереса. Для этого исследования жизненно важны рекомбинантный белок при высоких уровнях чистоты, а также информация о каталитических механизмах, управляемых кристаллическими структурами и селективными антителами.
Данная рукопись описывает методы экспрессии белка ФАХД в E. coli,хроматографию сродства, хроматографию ионного обмена, осадки в сульфат аммония, препаративную и аналитическую фильтрацию геля, кристаллизацию, рентгеновскую дифракцию и фотометрические анализы. Цель описанных здесь методов и протоколов состоит в том, чтобы дать рекомендации ученым, работающим в различных областях, таких как бактериология, биология растений, а также исследования на животных и людях, чтобы охарактеризовать членов сверхсемейства FAH, в том числе нехарактерные члены суперсемьи, если они становятся актуальными в конкретной области. Описанные здесь протоколы могут обеспечить ценную поддержку для проектов, направленных на характеристику других прокариотических или эукариотических членов суперсемейства FAH.
Обоснованием описанных здесь методов является тот факт, что для характеристики плохо описанных белков (в частности, метаболических ферментов неизвестной физиологической значимости) подход к началу с очищенных рекомбинантных белков позволяет разработка бесценных, высококачественных исследовательских инструментов, таких как активные ферментные препараты in vitro, высококачественные антитела, а также мощные и специфические фармакологические ингибиторы для отдельных ферментов. Описанные методы требуют быстрой белковой жидкой хроматографии (FPLC) и рентгеновской кристаллографии. Альтернативные методы (например, для выражения белка без химической индукции, или для отображения очистки белка путем центрифугации после тепловой обработки с последующей опреснения и хроматографии исключения размера), можно найти в другом месте17. В то время как более широкий спектр методов доступен длявыражения и очищения ферментов суперсемейства FAH 2,7,9,17,18, эта работа фокусируется на экспрессии и очистки белков FAHD, в частности.
В разделе обсуждения данной рукописи более подробно описаны каталитические механизмы, идентифицированные для белка FAHD1 (гидролаза, декарбоксилаза)15, с тем чтобы продемонстрировать химический характер катализованных реакций. Данные, полученные на основе предыдущей работы7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) подразумевает третью активность фермента, как кето-энол изомеразы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Фумарицетоацетат гидролаза (FAH) доменных белков (FAHD) идентифицируются членами суперсемейства FAH в эукариотах. Ферменты этой суперсемейки обычно отображают многофункциональность, включающую в основном гидролазы и декарбоксилазы. В этой статье представлен ряд последовательных методов выражения и очистки белков ФАХД, в основном белков ФАХД 1 (FAHD1) ортологов среди видов (человек, мышь, нематод, растения и т.д.). Покрытыми методами являются экспрессия белка в E. coli,хроматография сродства, ионный обмен хроматографии, препаративная и аналитическая фильтрация геля, кристаллизация, рентгеновская дифракция и фотометрические анализы. Концентрированный белок с высоким уровнем чистоты (Nogt;98%) может быть использован для кристаллизации или производства антител. Белки аналогичного или более низкого качества могут быть использованы в ферментных анализах или использованы в качестве антигенов в системах обнаружения (Western-Blot, ELISA). При обсуждении этой работы, выявленные ферментативные механизмы FAHD1 изложены для описания его гидролазы и декарбоксилазы би-функциональности более подробно.

Начиная с подготовленного вектора клонирования и приобретенного BL21 (DE3) pLysS E. coli,плазмида вставляется в бактерии через тепло-шок или любой подходящий альтернативный метод (рисунок1). После короткого периода усиления, преобразованные бактерии покрываются на пластинах агара LB, для того, чтобы расти в одночасье. Плиты на данный момент могут выглядеть по-разному, в зависимости от различных потенциальных источников ошибки. Плиты могут быть пустыми (т.е. без колоний), полностью заросшими бактериями, или что-то между ними, соответственно. Два примера пластин LB агара после оптимальной и неоптимальной трансформации изображены на рисунке 7A. Слишком много бактериальных колоний указывают либо на то, что слишком много бактерий были покрыты (вероятно), либо что антибиотики в использовании могут быть истек (вряд ли). Слишком мало бактериальных колоний может указывать на то, что либо не хватает плазмида был использован для преобразования (использовать больше в следующий раз), или что слишком много антибиотиков были использованы для выбора бактерий. В любом случае, если колонии присутствуют, они должны быть в порядке, так как использование двух селективных антибиотиков подразумевает довольно незначительный шанс непреобразованных бактерий расти. Нет колоний на всех, однако, указывает на то, что либо бактерии потеряли свою компетенцию преобразования (из-за неправильного хранения или хранения в течение более длительных периодов, повторяющиеся замораживания и оттепели и т.д.), тепло-шок не был успешным (не плазмид поглощения или бактериальных смерть слишком много тепла), вектор клонирования поврежден, или по ошибке неправильный набор селективных антибиотиков был использован (проверить ген сопротивления на плазмидный вектор).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Рисунок 7 : Репрезентативные результаты для преобразования бактерий и IMAC. (A) Представитель LB агар пластины с преобразованной BL21 (DE3) E. coli, полученные следующим протоколом шаг 1.1. Слева: табличка с хорошо распределенными колониями (положительный пример). Справа: пластина только с одной колонией (отрицательный пример). Белые круги отмечают хорошие колонии. Красный круг отмечает колонии, которые растут слишком близко друг к другу и не должны быть выбраны до тех пор, как изолированные колонии доступны. b) анализ 12,5% акриламида SDS-PAGE серии индукционных мер контроля ("-" указывает на введение IPTG; "К" указывает после индукции IPTG, перед сбором гранул), скорректированной на равное количество общего белка. Это описано в шаге 1.2. (C) Образцовый 12,5% акриламида SDS-PAGE анализ Ni-NTA очистки егопомечены FAHD1 белка. Это описано в разделе 3 протокола. Сродство хроматографии дает белок высокой чистоты (Зgt;70%, черная стрелка), однако, несколько небольших загрязнений также наблюдается (красные стрелки). Эти загрязнения состоят из белков, не связанных с ФАХД, которые связываются с колонкой, и из белков, которые связываются с белком FAHD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Отобраны и отобраны проверенные колонии. После усиления в питательной среде экспрессия белка вызывается применением химического IPTG. Бактериальные гранулы, содержащие выраженный белок в миллиграммовых количествах, собирают, а экспрессия проверяется через SDS-PAGE (см., например, рисунок 7B). Некоторые проблемы могут возникнуть во время этого в противном случае простой процесс. Во-первых, некоторые белки образуют включение органов, потому что они, видимо, каким-то образом вмешиваться в естественный метаболизм бактерий-хозяев. Это наблюдалось для некоторых точек мутаций человека FAHD1 и FAHD2. В таких случаях, другие системы выражения, такие как клетки насекомых, могут быть более подходящими и должны быть рассмотрены. После сбора гранул из клеток насекомых, например, очистка белков следует тем же шагам, что описано в этом протоколе. Во-вторых, система DE3-pET иногда оказывается "неудающейся" (т.е. белок уже в некоторой степени выражен до индукции IPTG). Потенциальная причина этого не очень хорошо понята, но это может помочь выразить белок медленно на ночь в холодном инкубаторе комнаты. В-третьих, не выражается ни один белок. Это, вероятно, наихудший сценарий, так как он, вероятно, указывает на поврежденный вектором плазмида и, таким образом, целесообразно секвенировать плазмид.
Если его-тег был использован для пометки белка, сродство хроматографии с Ni-NTA агарозявляется является простым и дешевым методом захвата устранения большинства загрязнений (Рисунок 7C). Аналогичные методы существуют и для других систем тегов (например, STREP-II). Если не был использован тег, сочетание осадков сульфата аммония и последовательных гидрофобных хроматографии обмена может также отделить белок от большинства других белков(Рисунок 8A). Однако, сравнивая два метода(рисунок 7C против рисунка 8A),превосходство методов Ni-NTA может быть продемонстрировано анализом SDS-PAGE. Поэтому рекомендуется использовать егопомеченный белок.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Рисунок 8 : Репрезентативные результаты для экспериментов FPLC (HIC, ионный обмен, SEC). (A) Типичная хроматограмма и 12,5% акриламид SDS-PAGE анализ HIC-фенил хроматографии после сульфата аммония (AS) осадков немаркированного белка FAHD1, как описано в разделе 4 протокола. Зеленая линия отражает градиент буфера B, который не содержит AS. Во время процесса AS постепенно вымывается из системы. Сравнение этой панели на рисунке 7C отображает силу хроматографии сродства Ni-NTA по сравнению с методом HIC-фенил, а также преимущество использования системы Его-тегдля для очистки белка. (B) Образцовая хроматограмма и 12,5% акриламида SDS-PAGE анализ катионной обменной хроматографии егопомечены FAHD после очистки Ni-NTA. Используя градиент соли, прикладной образец делится на отдельные белки. (C) Образцовая хроматограмма и 12,5% акриламида SDS-PAGE анализ G75 размер исключения хроматографии егопомечены FAHD после катионной хроматографии обмена. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Последовательно, белок далее отделен от остатков загрязнений катион / анион обмена хроматографии (например, см. Рисунок 8B), а затем размер исключения хроматографии (например, см. Рисунок 8C). Рекомендуется разработает первоначальную стратегию очистки в этом порядке; однако, эти столбцы должны быть использованы в комбинации, затем и в изменении, до тех пор пока протеин достаточно чисто.
Простые анализы активности, для того, чтобы проверить на "да или нет" решения по активным субстратов и / или кофакторов, могут быть выполнены с Егопомечены белков после очистки Ni-NTA, или untagged белков после ионной колонки обмена. Конкретные виды деятельности и кинетические константы должны определяться с помощью белка высочайшей чистоты. Кристаллизация может быть предпринята с белками после ионной колонки обмена, но качество кристаллов почти всегда коррелирует с чистотой белка. Поликлональные антитела могут быть подняты против белков на любом этапе протокола очистки; однако, здесь качество также коррелирует с чистотой протеина.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Выражение и очищение фумарилацетата гидролазы доменных белков описывается на примерах (выражение в E. coli,FPLC). Очищенные белки используются для кристаллизации и производства антител и используются для ферментных анализов. Избранные фотометрические анализы представлены для отображения многофункциональности FAHD1 как оксалоацетат декарбоксилаза и ацилпируватгидроза.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Наш протокол описывает методы эффективного выражения и очистки домена FAH, содержащего белки, а также белки в целом. Белок FHD-1 играет нормативную роль в цикле TCA и энергетическом метаболизме митохондрий. Мы смогли связать FHD-1 downregulation с клеточной сенесценцией и информация о активности ферментов и структуре белка, как правило, необходимы для того, чтобы понять молекулярные механизмы, стоящие за наблюдаемыми фенотипами.Основным преимуществом экспрессии белков с помощью неизгладимых векторных систем IPTG является то, что все методы относительно дешевы и просты в установлении в любой лаборатории. С помощью белков полихитидина типа в сочетании с никель NTA агарозы смолы, огромная избирательность сродства хроматографии могут быть использованы по низкой цене. Для большинства целей, белка, полученного в этом качестве, уже может быть достаточно.FPLC, с другой стороны, является хорошо установленным и общим методом с несколькими преимуществами по сравнению с другими методами. Во-первых, вставьте от 5 до 10 нанограммов плазмиды в 100 микролитров компетентных бактерий BL21-DE3 pLysS E.coli на льду. Слегка коснитесь трубки, чтобы смешать содержимое.Держите бактерии на льду в течение 30 минут, осторожно нажав трубку каждые несколько минут. Нагрейте термо шейкер до 42 градусов по Цельсию. Поместите трубку, содержащую бактерии, в аппарат и нагрейте в течение 90 секунд.Затем немедленно поместите трубку на лед. Через 5-10 минут на льду добавьте 600 микролитров среды НЗКИМ и поместите трубку в инкубатор бактерий. Встряхните трубку на средней скорости, ориентированной вдоль направления встряхивания при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.После инкубации пластина 200 микролитров бактериальной культуры на 10-сантиметровой пластине LB agar, содержащей отбор антибиотиков выбора. Культура бактерий на пластине LB агар в инкубаторе бактерий при 37 градусов по Цельсию в одночасье. После успешного образования колонии, выбрать одну колонию и разогнать его в пять миллилитров N'CYM с выбранными антибиотиками.Культура в инкубаторе бактерий при 37 градусах по Цельсию за одну ночь. После успешного роста бактерий, усилить бактерии в 250 миллилитров, 500 миллилитров или один литр партий среды в зависимости от спроса на количество белка. Затем, культура бактерий, в инкубаторе бактерий при 37 градусов по Цельсию в течение двух-трех часов.После инкубации нарисуйте образец для фотометрического анализа. Если оптическая плотность на 600 нанометров достигла 0,4, нанесите 200 микромолей до одного миллимоля изопропил-бета-Д-тиогалактопиранозиданика. После трех-пяти часов в инкубаторе бактерий при 37 градусах цельсия экспрессия белка исчерпана.Урожай бактериальной гранулы через центрифугу в 5000 раз G в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант и заморозьте гранулы при температуре минус 20 градусов по Цельсию для кратковременного хранения. На каждые 250 миллилитров оригинальной бактериальной суспензии нанесите на бактериальные гранулы пять миллилитров выбранного буфера.Добавьте 10 микролитров бета-меркаптоэтанола на пять миллилитров прикладного буфера. Используйте 10 миллилитров трубы Пастера, чтобы механически заставить гранулы в подвеску, царапая и трубы. Перенесите всю подвеску в 50-миллилитровую трубку.Затем sonicate подвески. Далее центрифуга в течение 30 минут на высокой скорости при четырех градусах по Цельсию. Фильтр супернатант последовательно с фильтром единиц на льду.Подготовьте пустую пластиковую или стеклянную колонку, прикрепив ее к стабильному фиксатору и стирая буфером никеля NTA. На каждые 10 миллилитров белковой суспензии нанесите на колонну 500 микролитров навоза никеля NTA agarose. Заполните столбец полностью с никеля NTA работает буфер обеспечения не нарушать смолы агарозы и позволить буферу пробежать под действием силы тяжести.Затем нанесите белковую подвеску на колонку и позвольте образцу пробежаться под действием силы тяжести. После того, как образец прошел, заполните столбец буфером никеля NTA. Поместите уф-прозрачный кювет под колонку и соберите один миллилитр буфера никеля NTA elution.Проверьте оптическую плотность образца на 280 нанометров по сравнению с пустым образцом. Оптимально, образец отображает оптическую плотность больше, чем 2,5. Так как белки FAHD и буфер никеля NTA elution осаждаются при замораживании и оттаивании, диализ белка против другого буфера ночь на льду, используя один микролитр DTT на 100 миллилитров буфера диализа.Настройка системы FPLC и мыть колонку с пятью объемами столбца 20%этанола следуют пять объемов колонки воды. После равновесия столбца нанесите на столбец обезвемый образец и соберите поток. Настройка градиентной элюции.После завершения градиента запустите с высоким буфером соли до тех пор, пока не будет обнаружено больше пиков в диапазоне одного объема столбца. Запустите считыватель микро-пластин и equilibrate в течение 30 минут при 25 градусов по Цельсию. Подготовьте один миллилитр 20-миллиметрового раствора субстрата для тестирования в буфере анализа ферментов.Согласно схеме пипетки в текстовом протоколе, подготовить фермент пустой и образец скважин путем пипетки 90 микролитров фермента анализа буфера в скважины с пятью микролитров ферментного раствора. Затем подготовьте подложку и пробные скважины, засовав в скважины 95 микролитров буфера анализа ферментов. Прямо перед измерением нанесите пять микролитров буфера анализа ферментов на шесть пустых скважин.Нанесите на выборочные скважины пять микролитров 20-миллиметрового подстрата. Используйте многоканарный пипетки при установке 50 микролитров, чтобы аккуратно перемешать скважины. Затем вставьте пластину в считыватель микро-пластин и измерьте каждый хорошо на 255 нанометров.Наконец, выполните анализ в электронной таблице. Здесь показаны два примера пластин LB agar после оптимальной и неоптимальных преобразований. Слишком много бактериальных колоний указывают либо на то, что две многие бактерии были помыты или что антибиотики могут быть просрочены.Слишком мало бактериальных колоний может свидетельствовать о том, что либо недостаточно плазмид был использован для преобразования или что слишком много антибиотиков были использованы для выбора бактерий. Бактериальная гранула, содержащая выраженный белок в миллиграммовых количествах, собирается и экспрессия проверяется через SDS-страницу. Некоторые проблемы могут возникнуть во время этого в противном случае простой процесс, в том числе белки формирования включения органов или белка не выражается.Если его-тег используется для тега белка, сродство хроматографии с никеля NTA агароза является простым и дешевым методом захвата устранения большинства загрязнений. Если тег не используется, сочетание сульфатных осадков аммония и последовательной гидрофобной хроматографии обмена может также отделить белок от большинства других белков. Белок далее отделяется от остатков загрязнений хроматографией ионого обмена, за которой следует хроматография исключения размера для получения достаточно чистого белка.Ни один из описанных методов не является сложным, в частности. Но все методы требуют обучения. Первые попытки могут провалиться, но эксперименты увенчаются успехом после некоторых дополнительных адаптаций.Все представленные здесь методы являются общими методами очищения белка. Хотя протокол специализируется на белках FAHD, он может быть адаптирован к любому белку, который хотелось бы очистить. Рекомбинантный человек FAHD-1 был получен с помощью описанных методов и высокого разрешения рентгеновских структур способствовали массово наше понимание FAHD-1 по функциональности, действуя как, декарбоксилазы и гидролазы.Бактерии, используемые в этой работе являются штаммами безопасности и не опасны. Общие руководства по безопасности применяются ко всем химическим веществам, и колонны FPLC должны быть обработаны с осторожностью.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования<em&gt; Bacillus</em&gt; -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Выражение и очищение Nuclease-бесплатный кислород Scavenger Протокатечуат 3,4-Диоксигеназы

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Бактериальная экспрессия и очистка металлопротеиназы-3 матрицы человека с помощью аффинной хроматографии

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...