Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Los autores están muy agradecidos por la asistencia técnica experta de Annabella Pittl y el desarrollo del método piloto por Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar y declarar que no hay intereses financieros en competencia. H. G. es CEOCSO en MoleculeCrafting.HuGs e.U. y proporcionó acylpyruvates para este estudio a través de la síntesis personalizada. El trabajo en el laboratorio de P. J. D. contó con el apoyo del Fondo Austriaco de Ciencia (FWF): número de proyecto P 31582-B26. Las tasas de publicación de este manuscrito han sido cubiertas en parte por el Fondo De Ciencia de Austria (FWF) bajo el número de proyecto P 31582-B26. A. N. y B. R. cuentan con el apoyo del Fondo De Ciencia de Austria (FWF) en el marco del proyecto P28395-B26.

La superfamilia de enzimas fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)1,2 describe un grupo de enzimas que comparten el dominio catalítico altamente conservadodeFAH 3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10. A pesar de su centro catalítico común, estas enzimas son multifuncionales, y la mayoría se encuentran en los procariotas, donde se utilizan para descomponer compuestos recuperados de fuentes complejas de carbono3. Sólo tres miembros de esta familia fueron identificados en eucariotas hasta el momento: el nombre que da FAH2, así como la proteína que contiene el dominio FAH 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 y FAH proteína que contiene dominio 2 (FAHD2). El agotamiento de FAHD1 se ha asociado con insuficiencia de la respiración mitocondrial13,16 y con un tipo reversible de fenotipo14 de senescencia celular que está vinculado al potencial intermedio deficiencias en el sistema de transporte de electrones. FaHD1 humano y sus ortologos en sistemas modelo (ratón, nematodos, líneas celulares cancerosas, plantas, etc.), así como variantes de mutación puntual seleccionadas, se han convertido en objetivos farmacodrinables de interés potencial. Para esta investigación, la proteína recombinante a altos niveles de pureza, así como la información sobre los mecanismos catalíticos guiados por estructuras cristalinas y anticuerpos selectivos son vitales.
Este manuscrito describe los métodos para la expresión de proteína sorción de LA FAHD en E.coli, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, precipitación de sulfato de amonio, filtración de gel preparativo y analítico, cristalización, difracción de rayos X y ensayos fotométricos. El propósito de los métodos y protocolos descritos aquí es proporcionar orientación para que los científicos que trabajan en diversos campos como la bacteriología, la biología vegetal, así como los estudios en animales y humanos, para caracterizar a los miembros de la superfamilia de la FAH, miembros de la superfamilia no caracterizados en caso de que sean relevantes en un campo en particular. Los protocolos descritos aquí pueden proporcionar un valioso apoyo para proyectos destinados a caracterizar a otros miembros de la superfamilia procariota o eucariota FAH.
La razón de ser detrás de los métodos descritos aquí es el hecho de que para la caracterización de proteínas mal descritas (en particular, enzimas metabólicas de relevancia fisiológica desconocida), el enfoque para comenzar con proteínas recombinantes purificadas permite desarrollo de herramientas de investigación invaluables y de alta calidad, como preparaciones enzimáticas activas in vitro, anticuerpos de alta calidad e inhibidores farmacológicos potentes y específicos para determinadas enzimas. Los métodos descritos requieren cromatografía líquida de proteínarápida rápida (FPLC) y cristalografía de rayos X. Los métodos alternativos (por ejemplo, para expresar proteínas sin inducción química, o para mostrar la purificación de proteínas por centrifugación después del tratamiento térmico seguido de la desalación y la cromatografía de exclusión de tamaño), se pueden encontrar en otros lugares17. Mientras que un espectro más amplio de métodos está disponible para la expresión y purificación de enzimas superfamilias FAH2,7,9,17,18, este trabajo se centra en la expresión y purificación de proteínas FAHD en particular.
En la sección de discusión de este manuscrito, los mecanismos catalíticos identificados para la proteína FAHD1 (hidrolasa, decarboxilasa)15 se describen con más detalle, con el fin de demostrar el carácter químico de las reacciones catalizadas. Los datos obtenidos sobre la base de trabajos anteriores7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) implican una tercera actividad de la enzima como ceto-enol isomerasa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Las proteínas que contienen el dominio de Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) (FAHD) son miembros identificados de la superfamilia FAH en eucariotas. Las enzimas de esta superfamilia generalmente muestran multifuncionalidad, involucrando principalmente mecanismos de hidrolasa y decarboxilasa. Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de proteínas FAHD, principalmente ortologos de proteína FAHD 1 (FAHD1) entre especies (humanos, ratón, nematodos, plantas, etc.). Los métodos cubiertos son la expresión de proteínas en E.coli, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración de gel preparativo y analítico, cristalización, difracción de rayos X y ensayos fotométricos. Proteína concentrada de altos niveles de pureza (>98%) pueden emplearse para la cristalización o la producción de anticuerpos. Las proteínas de calidad similar o inferior pueden emplearse en ensayos enzimáticos o utilizarse como antígenos en sistemas de detección (Western-Blot, ELISA). En la discusión de este trabajo, los mecanismos enzimáticos identificados de FAHD1 se describen para describir su bifuncionalidad hidrolasa y decarboxilasa con más detalle.

Comenzando con un vector de clonación preparado y comprado BL21(DE3) pLysS E. coli, el plásmido se inserta en la bacteria a través de choque térmico o cualquier método alternativo apropiado (Figura 1). Después de un corto período de amplificación, las bacterias transformadas se chapan en placas de agar LB, con el fin de crecer durante la noche. Placas en este punto pueden parecer diferentes, dependiendo de una variedad de fuentes de error potenciales. Las placas pueden estar vacías (es decir, sin colonias), completamente cubiertas de bacterias, o algo intermedio, respectivamente. En la Figura 7Ase describen dos ejemplos de placas de agar LB después de una transformación óptima y no óptima. Demasiadas colonias bacterianas indican que demasiadas bacterias fueron chapadas (probablemente) o que los antibióticos en uso pueden estar caducados (poco probable). Muy pocas colonias bacterianas pueden indicar que no se utilizó suficiente plásmido para la transformación (utilizar más la próxima vez) o que se utilizaron demasiados antibióticos para seleccionar las bacterias. En cualquier caso, si las colonias están presentes, deben estar bien, ya que el uso de dos antibióticos selectivos implica una probabilidad bastante insignificante de bacterias no transformadas para crecer. Ninguna colonia en absoluto, sin embargo, indica que o las bacterias perdieron su competencia de transformación (debido a almacenamiento o almacenamiento incorrectos durante períodos más largos, congelación y descongelación repetitiva, etc.), el choque de calor no tuvo éxito (sin absorción de plásmido o bacteriano muerte por demasiado calor), el vector de clonación está dañado, o por error se utilizó un conjunto incorrecto de antibióticos selectivos (verificar el gen de resistencia en el vector plásmido).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figura 7 : Resultados representativos para la transformación de bacterias y el IMAC. (A) Placas de agar LB representativas con transformada BL21(DE3) E. coli, obtenidas siguiendo el paso 1.1 del protocolo. Izquierda: Un plato con colonias bien distribuidas (ejemplo positivo). Derecha: Una placa con una sola colonia (ejemplo negativo). Los círculos blancos marcan buenas colonias. El círculo rojo marca las colonias que están creciendo demasiado cerca unas de otras y no deben ser recolectadas mientras las colonias aisladas estén disponibles. (B) Un análisis SDS-PAGE de acrilamida del 12,5% de una serie de controles de inducción ("-" indica antes de la inducción IPTG; "+" indica después de la inducción IPTG, antes de la cosecha de pellets, ajustado a cantidades iguales de proteína total. Esto se describe en el paso 1.2. (C) Un análisis ejemplar de 12,5% de acrilamida SDS-PAGE de la purificación De-NTA de suproteína FAHD1 etiquetada. Esto se describe en la sección 3 del protocolo. La cromatografía de afinidad produce proteínas de alta pureza (>70%, flecha negra), sin embargo, también se observan varias pequeñas contaminaciones (flechas rojas). Estas contaminaciones consisten en proteínas no FAHD que se unen a la columna, y de proteínas que se unen a la proteína FAHD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se seleccionan y recogen colonias validadas. Después de la amplificación en medio nutritivo, la expresión de proteína se desencadena mediante la aplicación del IPTG químico. El pellet bacteriano que contiene la proteína expresada en cantidades de miligramos se cosecha, y la expresión se verifica a través de SDS-PAGE (ver por ejemplo la figura 7B). Algunos problemas pueden ocurrir durante este proceso de otro modo simple. En primer lugar, algunas proteínas forman cuerpos de inclusión, porque aparentemente de alguna manera interfieren con el metabolismo natural de las bacterias huésped. Esto se observó para algunas mutaciones puntuales de FAHD1 humano y FAHD2. En tales casos, otros sistemas de expresión como las células de insectos pueden ser más apropiados y deben ser considerados. Después de cosechar un pellet de células de insectos, por ejemplo, la purificación de las proteínas sigue los mismos pasos que se describen en este protocolo. En segundo lugar, a veces se encuentra que el sistema DE3-pET es "leaky" (es decir, la proteína ya se expresa hasta cierto punto antes de la inducción de IPTG). La razón potencial de esto no es bien entendida, pero puede ayudar a expresar la proteína lentamente durante la noche en una incubadora de sala fría. En tercer lugar, no se expresa ninguna proteína. Este es probablemente el peor escenario, ya que probablemente indica un vector plásmido dañado y por lo tanto aconsejable secuenciar el plásmido.
Si se utilizó una etiqueta Suyapara etiquetar la proteína, la cromatografía de afinidad con la agarosa de Ni-NTA es un método de captura fácil y barato que elimina la mayoría de las contaminaciones (Figura7C). Existen métodos similares para otros sistemas de etiquetas (por ejemplo, STREP-II). Si no se utilizó ninguna etiqueta, una combinación de precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio hidrófoba consecutiva también puede separar la proteína de la mayoría de otras proteínas (Figura8A). Sin embargo, comparando los dos métodos (Figura7C frente a la Figura 8A),el análisis DeDS-PAGE puede demostrar la superioridad de los métodos Ni-NTA. Por lo tanto, se recomienda el uso de suproteína etiquetada.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figura 8 : Resultados representativos de los experimentos FPLC (HIC, intercambio iónico, SEC). (A) Un cromatógrafo típico y un análisis Delagrilamida SDS-PAGE del 12,5% de cromatografía HIC-fenil después de la precipitación de sulfato de amonio (AS) de la proteína FAHD1 sin etiquetar, como se describe en la sección 4 del protocolo. La línea verde refleja el degradado del búfer B que no contiene AS. Durante el proceso AS se lava gradualmente fuera del sistema. La comparación de este panel con la Figura 7C muestra el poder de la cromatografía de afinidad Ni-NTA en comparación con el método HIC-phenyl, y la ventaja de usar un sistema de etiquetas Supara la purificación de proteínas. (B) Un cromatograma ejemplar y un análisis SDS-PAGE de acrilamida del 12,5% de cromatografía de intercambio catiónico de Su-etiquetada FAHD tras la purificación de Ni-NTA. Usando un gradiente de sal, la muestra aplicada se separa en proteínas individuales. (C) Un cromatografía ejemplar y un análisis SDS-PAGE de acrilamida del 12,5% de cromatografía de exclusión de tamaño G75 de Su-etiquetada FAHD tras cromatografía de intercambio catiónico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Consecutivamente, la proteína se separa aún más de las contaminaciones sobrantes por cromatografía de intercambio catión/anión (por ejemplo, ver Figura 8B), seguida de cromatografía de exclusión de tamaño (por ejemplo, ver Figura 8C). Se aconseja establecer una estrategia de purificación inicial en este orden; sin embargo, estas columnas deben utilizarse en combinación, posteriormente y en variación, hasta que la proteína sea lo suficientemente pura.
Los ensayos de actividad simples, con el fin de probar las decisiones del "sí o no" en sustratos activos y/o cofactores, se pueden realizar con susproteínas etiquetadas después de la purificación de Ni-NTA, o proteínas sin etiquetar después de la columna de intercambio iónico. Las actividades específicas y las constantes cinéticas deben determinarse con proteínas de mayor pureza. La cristalización se puede intentar con proteínas después de la columna de intercambio iónico, pero la calidad de los cristales casi siempre se correlaciona con la pureza de las proteínas. Los anticuerpos policlonales pueden criarse contra proteínas en cualquier etapa del protocolo de purificación; sin embargo, aquí la calidad también se correlaciona con la pureza de la proteína.

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

La expresión y purificación de las proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato se describe con ejemplos (expresión en E.coli, FPLC). Las proteínas purificadas se utilizan para la cristalización y la producción de anticuerpos y se emplean para ensayos enzimáticos. Los ensayos fotométricos seleccionados se presentan para mostrar la multifuncionalidad de FAHD1 como oxaloacetato decarboxilasa e hidrolasa de acilpuvato.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Nuestro protocolo describe métodos para la expresión eficiente y purificación del dominio FAH que contiene proteínas, pero también proteínas en general. La proteína FHD-1 desempeña un papel regulador en el ciclo de TCA y el metabolismo energético de las mitocondrias. Pudimos asociar la regulación de la baja de FHD-1 a la senescencia celular y la información sobre la actividad enzimática y la estructura de proteínas son generalmente necesarias para entender los mecanismos moleculares detrás de los fenotipos observados.La principal ventaja de expresar proteínas a través de sistemas vectoriales inducibles IPTG es que todos los métodos son relativamente baratos y fáciles de establecer en cualquier laboratorio. Mediante el uso de proteínas de tipo poli-histidina en combinación con resinas de agarosa NTA de níquel, la inmensa selectividad de la cromatografía de afinidad puede emplearse a bajo costo. Para la mayoría de los propósitos, la proteína obtenida con esta calidad ya puede ser suficiente.FPLC en otras manos, es un método bien establecido y general con varias ventajas en comparación con otros métodos. Primero, inserte de cinco a 10 nanogramos de plásmido en 100 microlitros de bacterias competentes BL21-DE3 pLysS E.coli sobre hielo. Toque ligeramente el tubo para mezclar el contenido.Mantenga las bacterias sobre hielo durante 30 minutos, tocando suavemente el tubo cada pocos minutos. Calienta un agitador térmico a 42 grados centígrados. Coloque el tubo que contiene las bacterias en el aparato y caliente durante 90 segundos.A continuación, coloque el tubo sobre hielo inmediatamente. Después de cinco a 10 minutos en hielo, agregue 600 microlitros de medio NZCYM y coloque el tubo en una incubadora de bacterias. Agitar el tubo a velocidad media orientada a lo largo de la dirección de temblor a 37 grados centígrados durante una hora.Después de la incubación, placa 200 microlitros del cultivo bacteriano en una placa de agar LB de 10 centímetros que contiene la selección de antibióticos de elección. Cultivo de las bacterias en la placa de agar LB en la incubadora de bacterias a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la formación exitosa de colonias, elija una sola colonia y disperse en cinco mililitros de NZCYM con los antibióticos seleccionados.Cultivo en la incubadora de bacterias a 37 grados centígrados durante la noche. Después de un crecimiento bacteriano exitoso, amplificar las bacterias en lotes de 250 mililitros, 500 mililitros o un litro de medio dependiendo de la demanda de cantidad de proteína. Luego, cultiva las bacterias, en la incubadora de bacterias a 37 grados centígrados durante dos a tres horas.Después de la incubación, dibuje una muestra para el análisis fotométrico. Si la densidad óptica a 600 nanómetros ha alcanzado 0,4, aplique 200 micromolares hasta un milimolar de isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Después de tres a cinco horas más en la incubadora de bacterias a 37 grados celsius la expresión de la proteína se agota.Cosecha el pellet bacteriano mediante centrifugación a 5.000 veces G durante cinco minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y congele el pellet a menos 20 grados centígrados para un breve almacenamiento. Por cada 250 mililitros de suspensión bacteriana original, aplique cinco mililitros del tampón seleccionado al pellet bacteriano.Añadir 10 microlitros de beta-mercaptoetanol por cinco mililitros de tampón aplicado. Utilice una pipeta Pasteur de 10 mililitros para forzar mecánicamente el pellet en suspensión rascándose y pipeteando. Transfiera toda la suspensión a un tubo de 50 mililitros.A continuación, sonicar la suspensión. A continuación, centrifugar durante 30 minutos a alta velocidad a cuatro grados centígrados. Filtrar el sobrenadante consecutivamente con unidades de filtro en hielo.Prepare una columna de plástico o vidrio vacía adjuntándola a un retenedor estable y lavándola con un tampón de níquel NTA. Por cada 10 mililitros de suspensión proteica aplicar 500 microlitros de lodo de agarosa NTA de níquel a la columna. Llene la columna completamente con el búfer de funcionamiento de níquel NTA asegurando no interrumpir la resina de agarosa y permitir que el búfer corra a través de la gravedad.A continuación, aplique la suspensión proteica en la columna y permita que la muestra se ejecute por gravedad. Después de que la muestra haya pasado, rellene la columna con el búfer de ejecución de NTA de níquel. Coloque una cubeta transparente UV debajo de la columna y recoja un mililitro de tampón de elución NTA de níquel.Compruebe la densidad óptica de la muestra a 280 nanómetros en comparación con una muestra en blanco. De manera óptima, la muestra muestra una densidad óptica superior a 2,5. Dado que las proteínas FAHD y el tampón de elución de níquel NTA se precipitarán al congelarse y descongelar, dializar la proteína contra un tampón diferente durante la noche sobre el hielo usando un microlitro de TDT por cada 100 mililitros de tampón de diálisis.Configure un sistema FPLC y lave la columna con cinco volúmenes de columna de 20% de etanol seguidos de cinco volúmenes de columna de agua. Después de equilibrar la columna, aplique la muestra dializada a la columna y recoja el flujo a través. Configure una elución de degradado.Una vez finalizado el degradado, ejecute con un búfer de sal alta hasta que no se detecten más picos en el intervalo de un volumen de columna. Poner en marcha un lector de microplamas y equilibrar durante 30 minutos a 25 grados centígrados. Preparar un mililitro de una solución de 20 mililitros de un sustrato que se probará en tampón de ensayo enzimático.De acuerdo con el esquema de pipeteo en el protocolo de texto, preparar la enzima en blanco y los pozos de muestra mediante pipetear 90 microlitros de tampón de ensayo enzimático en los pozos con cinco microlitros de solución enzimática. A continuación, prepare el sustrato en blanco y muestree los pozos pipeteando 95 microlitros de tampón de ensayo enzimático en los pozos. Justo antes de medir, aplique cinco microlitros de tampón de ensayo enzimático en los seis pozos en blanco.Aplique cinco microlitros de la solución de sustrato de 20 milimolar a los pozos de muestra. Utilice una pipeta multicanal a un ajuste de 50 microlitros para mezclar suavemente los pozos. A continuación, inserte la placa en el lector de microplamas y mida cada pozo a 255 nanómetros.Por último, realice el análisis en una hoja de cálculo. Aquí se muestran dos ejemplos de placas de agar LB después de una transformación óptima y no óptima. Demasiadas colonias bacterianas indican que dos de las bacterias fueron chapadas o que los antibióticos pueden estar caducados.Muy pocas colonias bacterianas pueden indicar que o bien no se utilizó suficiente plásmido para la transformación o que se utilizaron demasiados antibióticos para seleccionar las bacterias. El pellet bacteriano que contiene la proteína expresada en cantidades de miligramos se cosecha y la expresión se verifica a través de sdS-página. Algunos problemas pueden ocurrir durante este proceso de otro modo simple, incluyendo las proteínas que forman cuerpos de inclusión o la proteína que no se expresa.Si se utiliza una etiqueta His para etiquetar la proteína, la cromatografía de afinidad con agarosa NTA de níquel es un método de captura fácil y barato que elimina la mayoría de las contaminaciones. Si no se utiliza ninguna etiqueta, una combinación de precipitación de sulfato de amonio y una cromatografía de intercambio hidrófobo consecutiva también puede separar la proteína de la mayoría de otras proteínas. La proteína se separa aún más de las contaminaciones sobrantes por cromatografía de intercambio iónico seguida de cromatografía de exclusión de tamaño para obtener una proteína suficientemente pura.Ninguno de los métodos descritos es difícil en particular. Pero todos los métodos requieren entrenamiento. Los primeros intentos pueden fallar, pero los experimentos tendrán éxito después de algunas adaptaciones adicionales.Todos los métodos presentados aquí son métodos generales de purificación de proteínas. Aunque está especializado en proteínas FAHD, el protocolo puede adaptarse a cualquier proteína que uno desee purificar. FAHD-1 humano recombinante ha sido obtenido por los métodos descritos y las estructuras de rayos X de alta resolución contribuyeron masivamente a nuestra comprensión de FAHD-1 por la funcionalidad que actúa como decarboxilasa e hidrolasa.Las bacterias utilizadas en este trabajo son cepas de seguridad y no peligrosas. Las guías de seguridad generales se aplican a todas las columnas químicas y FPLC deben manejarse con cuidado.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

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Investigación

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