Name: expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Författarna är mycket tacksamma för expert tekniskt bistånd av Annabella Pittl och pilot metod utveckling av Haymo Pircher.

<ol>
	<li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily.">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li><li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fumarylacetoacetate+hydrolase+(FAH)+superfamily+of+enzymes:+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria.">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).</li><li>Guimar&#227;es, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+&#946;-Keto+Acid.">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous &#946;-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632 (2016).</li><li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nag+genes+of+Ralstonia+(formerly+Pseudomonas)+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism.">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).</li><li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Mechanism+of+HpcG,+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli.">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li><li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880.">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li><li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+HpcE,+a+bifunctional+decarboxylase/isomerase+with+a+multifunctional+fold.">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li><li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family.">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li><li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458:+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum.">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+&#8211;+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 &#8211; a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li><li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD-1)+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans.">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li><li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor.">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li><li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA.">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714 (2018).</li><li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments:+study+of+protein+and+DNA+interactions.">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li><li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle.">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams.">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution.">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li><li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution.">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation:+A+Model+for+an+Enzyme+System+1.">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li><li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25.">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li><li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2,4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures.">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja och inte deklarera några konkurrerande ekonomiska intressen. H. G. är CEOCSO på MoleculeCrafting. kram EU och förutsatt acylpyruvates för denna studie via anpassad syntes. Arbetet i P. J. D. ' s Lab stöddes av den österrikiska Science Fund (FWF): projekt nummer P 31582-B26. Publicerings avgifterna för detta manuskript har delvis täckts av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF) under projekt nummer P 31582-B26. A. N. och B. R. stöttas av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF) under projektera P28395-B26.

Kritiska steg
FAHD-proteiner är mycket känsliga för saltkoncentrationer. Vid låga NaCl-koncentrationer kan proteinerna fällas ut vid upptining, men de kan vanligt vis rekonstitueras vid högre saltkoncentrationer. Det är, om ett FAHD-protein fälls av någon anledning, det kan återvinnas eller omvikas med högre saltkoncentrationer (> 300 μM). Vissa mer hydrofoba proteiner kan dock inte återvinnas (till exempel Human FAHD2), men rengörings medel som CHAPS (högst 1%) eller glycerol (10%) kan användas för att hålla dem i stabil lösning. I alla fall, chock-frysning med flytande kväve och lagring vid-80 ° c rekommenderas, eftersom det är en mild och långsam process av upptinning.
Några oväntade problem kan uppstå under ni-NTA rening i steg 3.1.10. Av anmärkning, en högre OD i det andra insamlade provet än i det första provet indikerar en alltför hög volym av AGA ros harts (ta en anteckning och använda mindre harts i nästa experiment). Också, den AGA ros harts själv leder till en OD-signal vid 280 nm (dvs., störningar av AGA ros harts sängen kommer att ge artificiella signaler). I tveksamma fall, det rekommenderas att använda andra metoder som en Bradford eller BSA-analys för att bestämma proteinkoncentrationer.
I enzymatiska analyser, det finns tre kritiska aspekter som skall övervägas. För det första är det viktigt att bedöma protein koncentrationen för att få rätt specifika aktiviteter. Proteiners renhets grad påverkar resultatet och måste uppskattas. I fråga om märkt protein måste massan av taggdelen beräknas, och den specifika verksamheten måste korrigeras på motsvarande sätt. För enkla analyser som beskrivs i avsnitt 7 i protokollet är ni-NTA-renhets graden tillräcklig för att skilja mellan aktiva och inaktiva substrat, koffeor osv. När det gäller mer komplexa Michaelis-menten kinetik, alla reaktant och substrat koncentrationer måste bestämmas korrekt. Speciellt när du använder oxaloacetat (som Auto-decarboxylates över tiden) den enzymatiska delen av reaktionen måste korrigeras för Auto-Decarboxylation (under antagande att båda reaktionerna uppträder samtidigt). Initiala förändringar i den optiska densiteten signalen riktas till keto-Enol tautomerization av substratet måste övervägas. För det tredje måste koncentrationerna och volymerna justeras. En reaktion med definierade koncentrationer av enzym och substrat kan ge olika resultat beroende på analys volymen. Om det finns för mycket enzym per brunn, vidhäftning av vätskan kan i själva verket bias resultatet.
För bedömning av Michaelis-menten kinetik rekommenderas att utföra inledande experiment i 100 μL, 200 μL, och 300 μL partier för att hitta den optimala kombinationen. Liknande aspekter gäller förhållandet mellan enzym-substrat koncentrationer för kinetiska analyser. För mycket enzym per substrat eller för mycket substrat per enzym sätta systemet utanför den linjära Steady-State Michaelis sortiment. Initiala experiment krävs för att optimera dessa villkor. Exemplarisk justering för humant FAHD1 (vild-typ) protein finns i avsnitt 8, vilket resulterar i kinetiska diagram (som visas i Figur 5b, till exempel).
För kristallisering pipetteras en droppe protein lösning i mitten av en täckslip och blandas med en droppe kristalliserings cocktail, som vanligt vis består av en buffert (t. ex. Tris-HCl, Hepes) och en utfällande (t. ex. polyetylenglykol, ammonium eller sulfat). En droplet av inhibitor lösning för co-kristallisering (såsom oxalat i detta protokoll) kan eventuellt tillämpas. Täckglasen placeras sedan upp och ner ovanför en brunn av reservoar innehåll ande kristalliserings cocktail, tätning av brunnen lufttät med hjälp av tätnings olja (figur 6b). Helst sker ingen nederbörd inom den droppe i början av experimentet vilket innebär att proteinet förblir i lösning. Eftersom precipitationskoncentrationen i reservoaren är högre än i DROPPEN, börjar droppen att tappa vatten genom avdunstning i brunnen tills jämvikt med reservoaren uppnås. Spridningen av vatten i reservoaren orsakar en långsam volym minskning av minskningen som i sin tur orsakar en ökning av både protein och utfällande koncentration i DROPPEN. Om protein lösningen når det tillstånd som krävs av Super-mättnad och därmed meta-stabilitet, spontan kärn bildning följt av kristall tillväxt kan inträffa. Att nå övermättat tillstånd är ett nödvändigt men inte tillräckligt villkor för kristallisation. Kristallisation av proteiner behöver båda, gynnsamma termodynamiska och kinetiska förhållanden, och tungt beror på de oförutsägbara egenskaperna hos proteinet som skall kristalliseras22.
Ändringar och fel sökning
Uttryck av protein i E. coli kan vara ineffektiv. Varierande IPTG-koncentrationer, uttrycks temperatur och förstärknings tid, till exempel rums temperatur i flera timmar eller i kallt rum över natten, kan behöva testas för varje nytt protein för att hitta optimala förhållanden. Utfällning av protein i inklusionssamorgan observeras ibland för mer hydrofoba FAHD-proteiner. I sådana fall rekommenderas protein uttryck i andra modell system som insektsceller, eftersom inkluderingkroppar är mindre benägna att bilda26.
Eftersom FAHD-proteiner är känsliga för salt-och kofaktorkoncentrationer, samt pH-värde, kan renings strategier för olika homologer, ortologer och punktmutationsvarianter skilja sig åt i enskilda miljöer. De beskrivna renings metoderna är utvecklade för det vildtyps-humana och mus FAHD1 proteinet. Koncentrationer av kemikalier, såsom NaCl och Imidazol, samt pH, kan behöva anpassas för enskilda proteiner med en annan isoelektrisk punkt (pI). Också notera, inte varje hans-märkta protein kan binda väl till en ni-nta harts. Om proteinbindningen till ni-NTA-kolonnen är ineffektiv, kan anpassade koncentrationer av NaCl och Imidazol, samt varierande pH-förhållanden i den löpande bufferten för ni-NTA, bidra till att förbättra kvaliteten på resultatet. Om inte, hoppa över ni-NTA steg och gå vidare till den joniska växlingskromatografi kan också leda till en framgångs rik renings strategi. Om ett protein binder till ni-NTA-kolonnen men inte kan elueras från kolonnen, kan tillsats av några mM EDTA hjälpa till att störa ni2 + -komplexet.
När det gäller processen för kristallisation, måste det förstås att själv organisering av stora och komplexa protein molekyler i en regelbunden periodiska gitter är en inneboende osannolikt process som är starkt beroende av svårt att kontrol lera kinetiska parametrar. Även små förändringar i set-up som används för kristallisation kan dramatiskt förändra resultatet och inga kristaller kommer att bildas. Protein renhet är i allmänhet av största vikt. Som en tumregel, en tungt överbelastad SDS-PAGE gel bör inte Visa andra band. Sekvensen där åtgärder utförs kan också påverka resultatet. Som ett exempel, för att säkerställa reproducerbarhet, är det ofta nödvändigt att hålla pipettsekvensen samma, sedan först tillsätt proteinet, och slutligen lägga utfällande till kristallisation droplet (eller tvärtom). Oavsett vilken metod som används, bör den hållas densamma när du försöker reproducera eller skala upp experiment. Om inga kristaller observeras efter detta protokoll, kan den kemiska utfällande sammansättning, pH, droppe storlek, och protein-till-precipitat förhållandet varieras i små steg. Tålamod och konsekventa observationer av dropparna är dygd.
Anmärkningar till katalytiska mekanismer av FAHD1
De presenterade metoderna har utvecklats speciellt för att erhålla FAHD1 proteiner av hög kvalitet. Detta möjliggjorde tillväxt av FAHD1 kristaller såväl som iscensätta av kristaller som innehåller FAHD1 komplex till en inhibitor (oxalate, PDB: 6fog). Röntgen strukturerna ger en 3D-arkitektur av enzymets katalytiska hålighet. Dessa resultat ger en omfattande beskrivning av rester som kan vara viktiga för den katalytiska mekanismen hos detta spännande enzym. FAHD1 beskrevs först för att kunna klyva acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senare, det konstaterades att FAHD1 fungerar också som en dekarboxylas av oxaloacetat12. Även om substrat acylpyruvate och oxaloacetat är olika kemiska bestånds delar, den kemiska transformationer dela mekanistiskt den strategiska klyvning av en gemensam enda C3-c4 Bond, energiskt underlättat om C3 -C4 Bond orbitaler bo ortogonal till π-orbitaler av C2-Carbonyl15. En sådan kon formation tillåter resonans stabilisering av C3-carbanion övergående bildas under klyvning processen. De FAHD1 substrat (oxaloacetat och acylpyruvates) är flexibla molekyler och kan finnas i tautomeriska (keto-Enol) samt C2-hydrerade former (figur 9a). Equilibrien mellan de olika arterna bestäms huvudsakligen av arten av buffertsammansättning som används, pH och förekomst av metall joner. I det följande diskuterar vi hypotetiska mekanistiska scenarier inspirerade från analys av röntgen kristall strukturer som avslöjade den katalytiska centrum av FAHD1.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2.jpg"> Figur 9 : Detaljer om den föreslagna katalytiska mekanismen för mänskliga FAHD1. (A) oxaloacetat finns i kris tal lin tillstånd samt i neutral lösning huvudsakligen i Z-Enol form24. Emellertid under Fysiologiskt pH-villkorar 2en-keto bildar är den dominera framställningen25. (B) kemisk skiss av hFAHD1 hålighet15 med mg-bundet oxaloacetat (vänster) och acylpyruvate (höger, med R1 som organisk vila; den röda pilen betecknar en nukleofil attack av angränsande stabiliserad vatten molekyl) (se diskussion). (C) jämförelse av gynnade kon formationer för C3-c4 klyvning i dekarboxylas (b till c) och hydrolas (b ' till C) mekanism av FAHD1: båda processerna resulterar i mg-complexed pyruvate-enolat (se diskussion). Intermediaterna b och b förväntas stabiliseras med Q109, enligt skiss i panel B (se diskussion). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Den decarboxylase aktiviteten hos FAHD1
Oxaloacetat finns i kristallint tillstånd samt i neutral lösning främst i Z-Enol form24. Men det visades att under fysiologiska pH-villkor (buffertförhållanden vid pH 7,4) den 2-keto formen är den dominerande representationen av oxaloacetat25 (figur 9a), och att enolization är inte en förutsättning för dekarboxylering27 . Av anmärkning, mg2 + joner har ingen inverkan på förhållandet mellan de oxaloacetat arterna vid ett pH av 7,4 eller under28. Införlivandet av oxaloacetat keto form i den katalytiska centrum av FAHD1 (styrs av den bundna oxalat i det komplexerade enzymet (PDB: 6FOG15)) avslöjade rester Q109 som en överensstämmandet regulator av den bundna oxaloacetat15. Som beskrivs i en annan artikel15, vätebindning till karbamol grupp Q109 stabiliserar en oxaloacetat-kon formation till följd av rotation runt C2-C3 Bond (figur 9b, vänster panel). Som en följd av denna rotation, C3-C4 Bond (att klyvas) antar en nära ortogonala disposition i förhållande till π-orbitaler av c2-Carbonyl (figur 9c). Koldioxid kan släppas ut. Den primära produkten av denna process skulle vara resonans stabiliserad mg-enolate av Pyruvat. Det är känt från undersökningar av oxaloacetat-mg komplex att enolate bildar den mest stabila komplex28,29. Förutsatt en jämförbar stabilitet för en mg-pyruvate enolate-komplex kofaktor av FAHD1 kunde blockeras, men lysinrester K123 kan protonate den pyruvate-enolate i en jämvikt för att förbjuda förlust av kofaktor15.
Den givna tolkningen antyder Pyruvat Enol som en distinkt mellanliggande i den katalytiska ODX funktion FAHD1. I detta steg i hypoteser modell, experimentella data ger inte någon ytterligare indikation på varför det slutna locket bör öppna för att frigöra produkten. Det kan dock härledas att den föreslagna mekanismen ser ut som en enzym hämning av produkten: kristall strukturen avslöjar en bevarade vatten molekyl som hålls i riktad riktning mot FAHD1 katalytiska centrum av rester H30 och E33 som presenteras i en kort Helix15, som induceras på ligand bindning och lock stängning. Om den primära Enol skulle stanna i en jämvikt med enolat, den resonans stabiliserade enolate kunde släckas till Pyruvat av vatten molekylen. Den resulterande hydroxylgrupp skulle vara kapabel att förflytta Pyruvat från mg-cofactor på vilken locket skulle öppna. Slutligen skulle den katalytiska centrum återställas i mitokondriell miljö. I detta hypotetiska scenario skulle kaviteten vatten molekyl fungera som en syra, respektive.
Hydrolase aktivitet av FAHD1
Hydrolase aktivitet av ett enzym kräver implicit den mellanliggande bildandet av en hydroxylnucleophile. Denna mekanism finns vanligt vis i kombination med syra-bas katalytisk aktivitet. Över gångs tillståndet för reaktionen måste förberedas via kon Formations kontroll av kritiska aminosyrans sido kedjor i håligheten. I analogi med diskussionen om dekarboxylas funktion, enzym-bundna acylpyruvate i 2-keto form kommer att sättas under kon Formations kontroll av väte-bindning av 4-karbonyl syre till Q109 (figur 9b, höger panel). Kristallen struktur oxalate-bunden FAHD1 (PDB: 6FOG) avslöjar en bevarade vatten molekyl som hålls i riktning riktning mot FAHD1 katalytiska centrum av rester H30 och E33 presenteras i en kort Helix15. Den E33-H30 dyad är behörig att deprotonate riktad placerad vatten och den resulterande hydroxylgrupp är i ideal disposition för att attackera 4-Carbonyl av acylpyruvate presenteras under överensstämningskontroll med Q10915.
En liknande mekanism har föreslagits för FAH18. Angrepp av hydroxylnucleophile förväntas resultera i en oxyanion arter, som stabiliseras vid orbital kontrollerad C3-C4 Bond klyvning (figur 9c). I denna modell, C3-C4 Bond rotation (figur 9c) händer efter den nukleofiliska attacken av bildade hydroxylgrupp anges i figur 9b (dvs, det förbereder acylpyruvate för bindningen klyvning). De primära produkterna skulle vara ättiksyra och mg-Pyruvat enolate. I detta hypotetiska scenario, ättiksyra kunde släcka Enol till Pyruvat och därefter hjälpa förskjutning av produkten. Ovanför ett pH av 7,5 och i närvaro av mg joner, acylpyruvates finns i en jämvikt mellan keto-och Enol-former, den senare i liten preferens30. Troligen båda formerna är kapabla att binda till kofaktor av FAHD1 under påföljande lock stängning. Behandling av enolsyra acylpyruvate substrat av enzymet hämmas på grund av den plana strukturen av Enol-form. C3-C4 klyvning skulle resultera i en papperba carbanion utan resonans stabilisering.
Därför föreslår vi en katalytisk ketonization steg för att förbereda sig för angrepp av hydroxylnucleophile på Acyl Carbonyl. Denna process av ketonization skulle dock kräva kontroll över Proton införlivandet av FAHD1 rester, vilket skulle tillskriva en inneboende Isomerase aktivitet till FAHD1. Det rapporteras att surheten hos mg-bunden Enol väte avslöjar en 10000-faldig ökning jämfört med den un-komplexerade formen28. En deprotonation av mg bunden Enol-form skulle vara genomförbart genom un-protonated K123. Deprotonation av K123 kan biträdas av karboxylatet av D102. Ett väteobligationsnät bestående av rester D102-K47-K123 skulle kunna fungera som det nödvändiga protonreläet i den katalytiska mitten av FAHD115. En sådan-bildade mellanliggande enolate kunde därefter släckas av en E33-H30-H20 triad under ketonization av substraten15. Den 2-keto form skulle komma under överensstämme kontroll av Q109, och den samtidigt bildade hydroxylgrupp skulle attackera Acyl Carbonyl. Den sammanfattade diskussionen innebär en kontroll av FAHD1 om en vatten molekyl för att växla mellan syra och bas genom samspel mellan kavitetsbildande rester.
Framtida tillämpningar eller anvisningar för metoden
Framtida tillämpningar av de metoder som beskrivs här är många. En uppsjö av prokaryotiska medlemmar i FAH superfamiljen väntar fortfarande funktionell karakterisering. Till och med den tillgängliga informationen om den katalytiska verksamheten hos kända superfamiljmedlemmar i FAH är knapp och i de flesta fall baserad på teoretiska antaganden snarare än experimentella data. Tillämpning av de metoder som beskrivs här för prokaryotiska Fah superfamiljen medlemmar beror på de specifika forsknings intressen i bakteriologi. Å andra sidan, den senaste tidens demonstration att eukaryota Fah superfamiljen medlemmar spela viktiga roller i olika cellulära fack (t. ex. Cytosol vs mitokondrier) belyser behovet av att bättre karakterisera dessa proteiner (varav tre har varit identifierats hittills), särskilt eftersom aktuella data tyder på att vissa okaraktäriserade proteiner kan utföra olika funktioner i samband med mitokondriell biologi, åldrande forskning och cancer forskning. Det föreslås att den fullständiga molekyl ära och fysiologiska karakteriseringen av dessa eukaryotiska FAH superfamiljemedlemmar kan ge viktig insikt i viktiga områden av samtida forskning inom den biomedicinska sektorn. Mer forskning om mekanismerna för FAHD1 (och relaterade enzymer) behövs för att bättre förstå mekanismerna bakom bi-funktionaliteten hos FAHD1, som fortfarande inte är helt klarlagt. Ytterligare studier med FAHD1 mutanter, NMR-utredningar, och strukturella studier på inhibitor komplex kan bidra till att lösa de verkliga mekanistiska scenarier som FAHD1 verkar vara kompetent. Dessutom, datorstödd design av Enol härmar kan binda till mg-kofaktor kommer så småningom att leda till potenta hämmare av FAHD1.

Den fumarylacetoacetat hydrolas (Fah)1,2 superfamiljen av enzymer beskriver en grupp av enzymer som delar den mycket bevarade katalytiska Fah domän3,4,5,6 , 7 för att , 8 , 9 för att , 10. Trots deras gemensamma katalytiska centrum, dessa enzymer är multifunktionella, och de flesta finns i prokaryoter, där de används för att bryta ner föreningar som hämtats från komplexa kol källor3. Endast tre medlemmar av denna familj identifierades i eukaryoter hittills: namnet ger Fah2, liksom Fah domän-innehållande protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 och Fah domän innehåll ande protein 2 (FAHD2). Utarmning av FAHD1 har förknippats med försämrad mitokondriell andning13,16 och associerad med en reversibel typ av cellulär senescens fenotyp14 som är kopplad till intermediär potential brister i elektron transport systemet. Human FAHD1 och dess ortologer i modell system (mus, Nematoden, cancer cellinjer, växter, etc.), samt utvalda punkt mutation varianter, har blivit druggable mål av potentiella intresse. För denna forskning, rekombinant protein i hög renhets grad, liksom information om katalytiska mekanismer som styrs av kristall strukturer och selektiva anti kroppar är avgörande.
Detta manuskript beskriver metoder för FAHD-proteinuttryck i E. coli, affiniskromatografi, jonbyteskromatografi, ammoniumsulfatfällning, preparativ och analytisk gel filtrering, kristallisation, röntgen diffraktion och och foto metriska analyser. Syftet med de metoder och protokoll som beskrivs här är att ge vägledning för forskare som arbetar inom olika områden såsom bakteriologi, växt bio logi, samt studier på djur och människor, för att karakterisera medlemmar i superfamiljen FAH, inklusive okarakteriserade superfamilje medlemmar bör de bli relevanta inom ett visst område. De protokoll som beskrivs här kan ge värdefullt stöd för projekt som syftar till att karakterisera andra prokaryota eller eukaryota Fah superfamiljen medlemmar.
Logiken bakom de metoder som beskrivs här är det faktum att för karakterisering av dåligt beskrivna proteiner (i synnerhet metabola enzymer av okänd fysiologisk relevans), tillvägagångs sättet för att börja med renade rekombinanta proteiner gör att utveckling av ovärderliga, högkvalitativa forsknings verktyg såsom in vitro aktiva enzym preparat, högkvalitativa anti kroppar och potenta och specifika farmakologiska hämmare för utvalda enzymer. De beskrivna metoderna kräver snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) och röntgenkristallografi. Alternativa metoder (t. ex. för att uttrycka protein utan kemisk induktion, eller för att Visa protein rening genom centrifugering efter värmebehandling följt av avsaltning och storleks uteslutningskromatografi), kan hittas någon annan stans17. Även om det finns ett bredare spektrum av metoder för uttryck och rening av superfamiljen Fah enzymer2,7,9,17,18, fokuserar detta arbete på uttryck och rening av FAHD-proteiner i synnerhet.
I diskussionen delar upp av detta manuskript, de katalytiska mekanismerna som identifieras för det FAHD1 proteinet (hydrolase, decarboxylase)15 beskrivas i mer specificerar, för att visa det kemiska teckenet av de katalyserade reaktionerna. De uppgifter som erhållits baserat på tidigare arbete7,15,18 (PDB: 6fog, PDB: 6foh) innebär en tredje aktivitet av enzymet som keto-Enol isomeras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) pLysS competent E. coli</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1195</td>
			<td>High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET E. coli T7 Expression Vectors</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30622-758</td>
			<td>VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47727-024</td>
			<td>UV/VIS transparent cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2316</td>
			<td>chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>X998</td>
			<td>chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&#38;pcp_loc=catprod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; resistance endi&#243;ded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">60615</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z706345</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&#174;ion=AT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677108</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&#38;region=AT&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxaloacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>TCA metabolite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium oxlalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71800</td>
			<td>a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9277</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>R90101</td>
			<td>a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td align="right">8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Phenyl HP column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 75 pg (G75)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad Superdex column 200 pg (G200)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN microplate reader</td>
			<td>TECAN Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzoylpyruvate</td>
			<td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td>
			<td>-</td>
			<td>custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDX&#8482; plate (24 wells)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-142</td>
			<td>24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin oil</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22 mm)</td>
			<td>Karl Hecht KG</td>
			<td>14043</td>
			<td>coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM medium</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth (LB) agarose plates</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA elution buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIC running buffer AS</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q low salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q high salt buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G75 / G200 running buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme assay buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein crystallization buffer</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reservoir solution for crystallization</td>
			<td>self-prepared</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, crystallization, and enzyme assays of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins

Fumarylacetoacetat hydrolas (Fah) domän-innehållande proteiner (Fahd) är identifierade medlemmar i Fah superfamiljen i eukaryotes. Enzymer i denna superfamilj visar i allmänhet multi-funktionalitet, som huvudsakligen involverar hydrolas och dekarboxylas mekanismer. Denna artikel presenterar en serie av på varandra följande metoder för uttryck och rening av FAHD proteiner, främst FAHD protein 1 (FAHD1) ortologer bland arter (människa, mus, nematoder, växter, etc.). Omfattade metoder är protein uttryck i E. coli, affiniskromatografi, jonbyteskromatografi, preparativ och analytisk gel filtrering, kristallisation, röntgen diffraktion och foto metriska analyser. Koncentrerat protein med hög renhets grad (> 98%) kan användas för kristallisation eller anti kropps produktion. Proteiner av liknande eller lägre kvalitet kan användas i enzym analyser eller användas som antigener i detektions system (Western-blot, ELISA). I diskussionen av detta arbete, de identifierade enzymatiska mekanismerna i FAHD1 beskrivs för att beskriva dess hydrolas och dekarboxylas bi-funktionalitet mer i detalj.

Börjar med en för beredd kloning vektor och köpt BL21 (DE3) Plyss E. coli, Plasmid sätts in i bakterierna via värme chock eller någon lämplig alternativ metod (figur 1). Efter en kort period av förstärkning, de transformerade bakterierna är pläterade på LB agar tallrikar, för att växa över natten. Plattorna på denna punkt kan se annorlunda ut, beroende på en mängd olika potentiella fel källor. Plattorna kan vara tomma (dvs. inga kolonier), helt igenväxda av bakterier, eller något däremellan, respektive. Två exempel på LB-agar plåtar efter optimal och icke-optimal omvandling avbildas i figur 7a. Alltför många bakteriekolonier visar antingen att alltför många bakterier har pläterat (sannolikt) eller att antibiotika i användning kan vara passerat (osannolikt). För få bakteriekolonier kan tyda på att antingen inte tillräckligt Plasmid användes för omvandlingen (Använd mer nästa gång) eller att för mycket antibiotika användes för att välja bakterier. I vilket fall som helst, om kolonier är närvarande, bör de vara bra, eftersom användning av två selektiva antibiotika innebär en ganska obetydlig chans att icke omvandlade bakterier att växa. Inga kolonier alls tyder dock på att antingen bakterierna förlorat sin omvandlings kompetens (på grund av fel lagring eller lagring under längre perioder, upprepad frysning och Tina, etc.), var värme chocken inte framgångs rik (ingen Plasmid upptag eller bakterie döden av för mycket värme), kloningen vektorn är skadad, eller av misstag en felaktig uppsättning selektiva antibiotika användes (kontrol lera motståndet genen på Plasmid vektor).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> Figur 7 : Representativa resultat för bakterie omvandling och iMac. A representativa lb-agar-plattor med TRANSFORMERADE BL21 (DE3) E. coli, erhållna genom följande protokoll steg 1,1. Vänster: en tallrik med välfördelade kolonier (positivt exempel). Höger: en tallrik med endast en enda koloni (negativt exempel). Vita cirklar markerar bra kolonier. Den röda cirkeln markerar kolonier som växer för nära varandra och bör inte plockas så länge isolerade kolonier finns tillgängliga. B) en analys av en serie induktions kontroller på 12,5% akrylamid (SDS-Page) ("-" indikerar före iptg-induktion. "+" indikerar efter IPTG-induktion, före pelletskörningen), justerat till lika stora mängder av totalt protein. Detta beskrivs i steg 1,2. (C) en exemplarisk 12,5% akrylamid SDS-Page analys av ni-nta rening av hans-märkta FAHD1 protein. Detta beskrivs i avsnitt 3 i protokollet. Affinitetskromatografi ger protein av hög renhet (> 70%, svart pil), men flera små föroreningar observeras också (Röda pilar). Dessa föroreningar består av icke-FAHD-proteiner som binder till kolonnen, och från proteiner som binder till FAHD-proteinet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Validerade kolonier väljs och plockas. Efter amplifiering i närande medium, protein uttryck utlöses genom tillämpning av den kemiska IPTG. Den bakterie pellets som innehåller det uttryckta proteinet i milligram kvantiteter skördas, och uttryck verifieras via SDS-PAGE (se till exempel figur 7b). Vissa problem kan uppstå under denna annars enkla process. För det första, vissa proteiner bildar inkludering organ, eftersom de tydligen på något sätt störa den naturliga metabolismen av värd bakterier. Detta observerades för någon punkt mutationer av mänskliga FAHD1 och FAHD2. I sådana fall kan andra uttrycks system som insekts celler vara lämpligare och bör övervägas. Efter skörd av en pellet från insekts celler, till exempel, rening av proteiner följer samma steg som beskrivs i detta protokoll. För det andra, DE3-pET -systemet är ibland visat sig vara "läckande" (dvs., protein är redan uttrycks i viss utsträckning före iptg induktion). Den potentiella orsaken till detta är inte väl förstått, men det kan bidra till att uttrycka proteinet långsamt över natten i ett kallt rum inkubator. För det tredje uttrycks inget protein. Detta är förmodligen det värsta scenariot, eftersom det sannolikt tyder på en skadad Plasmid vektor och därför tillrådligt att sekvenera plasmid.
Om en his-tag användes för att tagga proteinet är affinitetskromatografi med ni-nta AGA ros en enkel och billig fångst metod som eliminerar de flesta kontamineringar (figur 7c). Liknande metoder finns för andra taggsystem (t. ex. STREP-II). Om ingen tagg användes kan en kombination av ammoniumsulfatfällning och på varandra följande hydrofobiska växlingskromatografi också separera proteinet från de flesta andra proteiner (figur 8a). Men om man jämför de två metoderna (figur 7c jämfört med figur 8a) kan ni-nta-metodernas ÖVERLÄGSENHET PÅVISAS genom SDS-Page-analys. Med hjälp av hans-märkta protein rekommenderas därför.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> Figur 8 : Representativa resultat för FPLC-experiment (HIC, JONBYTE, SEK). A en typisk kromatogram-och 12,5-procentig akrylamid, SDS-Page-analys av HIC-fenylkromatografi efter ammoniumsulfat (as) utfällning av OTAGGADE FAHD1-protein, enligt beskrivningen i avsnitt 4 i protokollet. Den gröna linjen återspeglar övertoningen av bufferten B som inte innehåller AS. Under processen som gradvis tvättas bort från systemet. Om man jämför denna panel med figur 7c visar den kraften hos ni-nta affiniskromatografi jämfört med HIC-fenyl-metoden, och fördelen med att använda ett his-tag-system för protein rening. B en exemplarisk kromatogram och 12,5% akrylamid SDS-Page-analys av katjonbyteskromatografi av hans-märkta Fahd efter ni-nta-rening. Med en saltgradient separeras det applicerade provet i enskilda proteiner. C) ett exemplariskt kromatogram och 12,5% akrylamid SDS-Page-analys av G75-storlek exkluderings kromatografi av hans-märkta Fahd efter katjonbyteskromatografi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Efter varandra separeras proteinet ytterligare från överblivna föroreningar med katjonkromatografi (t. ex. se figur 8b), följt av storleks-uteslutningskromatografi (t. ex. se figur 8c). Det rekommenderas att upprätta en initial renings strategi i denna ordning; dessa kolonner bör dock användas i kombination, därefter och i variation, tills proteinet är tillräckligt rent.
Enkel aktivitet analyser, för att testa för "ja eller nej" beslut om aktiva substrat och/eller kofaktorer, kan utföras med hans-märkta proteiner efter ni-nta rening, eller omärkta proteiner efter den joniska utbytet kolonn. Specifika aktiviteter och kinetiska konstanter måste bestämmas med protein av högsta renhet. Kristallisation kan prövas med proteiner efter den joniska utbytet kolonn, men kvaliteten på kristaller nästan alltid korrelerar med protein renhet. Polyklonala anti kroppar kan höjas mot proteiner i något skede av renings protokollet. men här kvaliteten också korrelerar med proteinet renhet.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins at JoVE.com

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Uttryck och rening av fumarylacetoacetat hydrolas domän-innehåll ande proteiner beskrivs med exempel (uttryck i E. coli, FPLC). Renade proteiner används för kristallisation och anti kropp produktion och användas för enzym analyser. Utvalda Foto metriska analyser presenteras för att Visa multifunktionaliteten hos FAHD1 som oxaloacetat dekarboxylas och acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Vårt protokoll beskriver metoder för effektivt uttryck och rening av FAH-domän som innehåller proteiner men även proteiner i allmänhet. FHD protein-1 spelar en reglerande roll i TCA cykeln och energimetabolism mitokondrierna. Vi kunde associera FHD-1 nedreglering till cellulära senescence och information om enzym verksamhet och protein struktur krävs i allmänhet för att förstå molekylära mekanismer bakom observerade fenotyper.Den största fördelen med att uttrycka proteiner via IPTG inducerbara vektorsystem är att alla metoder är relativt billiga och lätta att etablera i alla laboratorium. Genom att använda poly-histidin typ proteiner i kombination med nickel NTA agaros hartser, den enorma selektivitet affinitet kromatografi kan vara anställd till låg kostnad. För de flesta ändamål, protein som erhållits vid denna kvalitet kan redan räcka.FPLC på de andra händerna, är en väl etablerad och generell metod med flera fördelar jämfört med andra metoder. För det första, sätt in fem till 10 nanogram plasmid i 100 mikroliter av kompetenta BL21-DE3 pLysS E.coli bakterier på is. Knacka lätt på tuben för att kunna blanda innehållet.Håll bakterierna på is i 30 minuter, försiktigt knacka röret med några minuters mellanrum. Värm en termoshaker till 42 grader celsius. Placera röret som innehåller bakterierna i apparaten och värm i 90 sekunder.Sedan, placera röret på is omedelbart. Efter fem till 10 minuter på is, tillsätt 600 mikroliter av NZCYM medium och placera röret i en bakterie inkubator. Skaka röret med medelhastighet orienterad längs skakriktningen i 37 grader celsius i en timme.Efter inkubation, platta 200 mikroliter av bakteriekulturen på en 10 centimeter LB agar platta som innehåller urvalet antibiotika val. Odla bakterierna på LB-agarplattan i bakterieinkubatorn vid 37 grader celsius över natten. Efter lyckad kolonibildning, plocka en enda koloni och skingra den i fem milliliter NZCYM med de utvalda antibiotika.Kultur i bakterieinkubatorn vid 37 grader celsius över natten. Efter lyckad bakterietillväxt, förstärka bakterierna i 250 milliliter, 500 milliliter eller en liter partier av medium beroende på efterfrågan av protein kvantitet. Sedan, kultur bakterierna, i bakterier inkubatorn vid 37 grader celsius i två till tre timmar.Efter inkubation, rita ett prov för fotometrisk analys. Om den optiska densiteten vid 600 nanometer har nått 0,4, applicera 200 mikromolar upp till en millimolar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Efter tre till fem timmar till i bakterieinkubatorn vid 37 grader är proteinuttryck uttömt.Skörda bakteriepelleten via centrifugeringen vid 5, 000 gånger G i fem minuter. Sedan, kasta supernatanten och frys pelleten vid minus 20 grader celsius för kort förvaring. För varje 250 milliliter av originalbakteriell suspension, applicera fem milliliter av den valda bufferten på bakteriepelleten.Tillsätt 10 mikroliter av beta-merkaptoanol per fem milliliter av tillämpad buffert. Använd en 10 milliliter Pasteur pipet för att mekaniskt tvinga pelleten till fjädring genom repor och pipettering. Överför all suspension till ett 50 milliliterrör.Sen sonikera suspensionen. Därefter centrifug i 30 minuter vid hög hastighet vid fyra grader celsius. Filtrera supernatanten i följd med filterenheter på is.Förbered en tom plast eller glas kolonn genom att fästa den på en stabil hållare och tvätt med nickel NTA kör buffert. För varje 10 milliliter protein suspension applicera 500 mikroliter av nickel NTA agaros slurry till kolonnen. Fyll kolonnen helt med nickel NTA kör buffert se till att inte störa agaros harts och låta bufferten att köra igenom av gravitationen.Därefter applicera protein suspensionen till kolonnen och låta provet att köra igenom av gravitationen. När provet har passerat genom, fyll kolumnen med nickel NTA kör buffert. Placera en UV transparent cuvette nedanför kolonnen och samla en milliliter nickel NTA eluering buffert.Kontrollera provets optiska densitet vid 280 nanometer jämfört med ett blankprov. Optimalt visar provet en optisk densitet på större än 2,5. Eftersom FAHD-proteiner och nickel NTA elueringsbuffert kommer att fällas vid frysning och upptining, dialysera proteinet mot en annan buffert över natten på is med hjälp av en mikroliter DTT per 100 milliliter dialysbuffert.Ställ in ett FPLC-system och tvätta kolonnen med fem kolonnvolymer av 20%etanol följt av fem kolonnvolymer vatten. Efter equilibrating kolumnen, tillämpa dialyzed prov på kolumnen och samla flödet genom. Ställ in en toningseuering.När övertoningen har avslutats kör du med hög saltbuffert tills inga fler toppar har identifierats över intervallet för en kolumnvolym. Starta upp en mikroplatta läsare och jämvikt i 30 minuter vid 25 grader celsius. Bered en milliliter av en 20 millimolarlösning av ett substrat som ska testas i enzymanalysbuffert.Enligt pipetteringsschemat i textprotokollet, bereda enzymet blank och prov brunnar genom pipettering 90 mikroliter av enzym assay buffert i brunnarna med fem mikroliter enzymlösning. Förbered sedan substratet blank och prov brunnar genom pipettering 95 mikroliter av enzym assay buffert i brunnarna. Precis innan mätning, applicera fem mikroliter av enzymanalysbuffert till de sex tomma brunnarna.Applicera fem mikroliter av 20 millimolubstratlösningen på provbanorna. Använd en flerkanalspip med 50 mikroliterinställning för att försiktigt blanda brunnarna. Sedan sätter du in plattan i mikroplattans läsare och mäter varje brunn vid 255 nanometer.Slutligen utför analysen i ett kalkylblad. Två exempel LB agar plattor efter optimal och icke-optimal omvandling avbildas här. Alltför många bakteriekolonier indikerar antingen att två många bakterier var pläterade eller att antibiotikan kan vara utgångna.För få bakteriekolonier kan tyda på att antingen inte tillräckligt med plasmid användes för omvandlingen eller att för mycket antibiotika användes för att välja ut bakterierna. Bakteriepelleten som innehåller det uttryckta proteinet i milligrammängder skördas och uttryck verifieras via SDS-sida. Vissa problem kan uppstå under denna annars enkla process, inklusive de proteiner som bildar inkluderingsorgan eller det protein som inte uttrycks.Om en His-tag används för att märka proteinet, affinitet kromatografi med nickel NTA agaros är en enkel och billig fångstmetod eliminera de flesta föroreningar. Om ingen tagg används, kan en kombination av ammoniumsulfatutfällning och en på varandra följande hydrofoba utbyteskromatografi också separera proteinet från majoriteten av andra proteiner. Proteinet separeras vidare från överblivna föroreningar genom jonbyteskromatografi följt av storleksuteslutningskromatografi för att erhålla ett tillräckligt rent protein.Ingen av de beskrivna metoderna är särskilt svår. Men alla metoder kräver träning. Första försöken kan misslyckas men experimenten kommer att lyckas efter några ytterligare anpassningar.Alla metoder som presenteras här är allmänna metoder för proteinrening. Även specialiserade för FAHD proteiner, protokollet kan anpassas till något protein man skulle vilja rena. Rekombinanta mänskliga FAHD-1 har erhållits genom de beskrivna metoderna och högupplösta röntgenstrukturer bidragit massivt till vår förståelse av FAHD-1 genom funktionalitet som fungerar som både, decarboxylase och hydrolas.Bakterier som används i detta arbete är säkerhetsstammar och inte farliga. Allmänna säkerhetsguider gäller för alla kemikalier och FPLC-kolonner ska hanteras varsamt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinera våta och torra Lab Tekniker Guide kristallisation av stora coiled-coil proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttryck, Kristallisation och Biofysiska Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverad nukleotidpyrofosforylas, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriellt uttryck och rening av human matrix metalloproteinase-3 med hjälp av affinitetskromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...