Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

ويدعم البحث في مختبر شاو من قبل جائزه البحوث المبتكرة من كليه الطب والجائزة التجريبية كليه المبتدئين من قسم الطب الباطني ، جامعه سينسيناتي ومنح DK K01_095067 من NIDDK/المعاهد الوطنية للصحة.

تم تربيه الفئران التجريبية والحفاظ عليها في مستعمره الفئران لدينا. وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيواني (IACUC) التابعة لجامعه سينسيناتي.
1. اعداد CFSE المسمية الخلايا الدهنية ثيتوتيك
<ol><li>موت ببطء اثنين من الفئرا?...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

المبرمج هو عمليه الموت خليه المحفوظة للغاية التي تنطوي علي العديد من الشلالات اشاره ويدفع التعبير البروتين, إفراز, والنقل. المبرمج غالبا ما يرتبط مع التغيرات المورفولوجية الخلوية17. الخلايا ابوتوتيك الإفراج بنشاط السايتوكينات والكيميائية التي تجذب البالعات للهجرة إلى الموق...

جسمنا يولد 1-10 مليار خليه ابوتوتيك علي أساس يومي. يجب مسح مثل هذا العدد الكبير من الخلايا ابوتوتيك بطريقه ان الاستجابات المناعية لا تزال هادئه. لضمان أزاله الخلايا ابوتوتيك في الوقت المناسب ، وأنواع عديده من الخلايا المقيمة الانسجه والخلايا المتداولة تطوير أليات لابتلاع الخلايا ابوتوتيك1. وقد تورط تنظيم مختلة من موت الخلايا المبرمج في بداية وتطور مختلف الامراض التهابيه والحصانة الذاتية2. المبرمج أيضا يلعب دورا حاسما في التسبب في تطور السرطان ومقاومتها اللاحقة للعلاجات التقليدية3,4. أزاله الخلايا ابوتوتيك عموما يعزز استجابه مضاده للالتهابات ، والتي قد تكون مرتبطة بالتسامح المناعي5. اضطرابات أزاله الخلايا ابوتوتيك يدفع التمنيع الذاتي ويساهم في تطوير امراض المناعة المناعية الجهازية في كل من البشر والفئران6.
عندما الخلايا الخضوع للخلايا المبرمج, انها تعرض فوسفاتيديلسيرين (PtdSer) من النشرة الداخلية إلى النشرة الخارجية لغشاء. ثم سيتم التعرف علي PtdSer من قبل الخلايا الشحمية من خلال مستقبلات السطح. وقد تم تحديد أكثر من اثني عشر مستقبلا للاعتراف و/أو تسهيل أحاطه الخلايا الميتة. بشكل عام ، هناك ما لا يقل عن ثلاثه أنواع من المستقبلات السطحية المشاركة في أزاله الخلايا ابوتوتيك: مستقبلات الربط ، والتعرف علي الخلايا ابوتوتيك. المستقبلات دغدغه ، والشروع في أحاطه ؛ المستقبلات المشقوقة ، وتسهيل العملية برمتها7. [تام] مستقبلات [تيروزين] [كيناسيس] ([تام] [رتكس]) يتالف [ر] [ترو-3], [اكس], و [م] وعبر عن في الدرجة الاولي ب [ميلينويد] خلايا من ال [ايمون سستم]8. الوظيفة الرئيسية لل RTKs تام هو ان تكون بمثابه مستقبلات الربط ، وتسهيل أزاله الفاغميه من الخلايا ابوتوتيك والحطام. وقد درست مجموعتنا تام بوساطة أزاله الخلايا ابوتوتيك في وضع المناعة الذاتية لسنوات عديده. نمو البروتين المعتمدة علي فيتامين ك القبض علي بروتين محدد 6 (Gas6) والبروتين S (الإيجابيات) بربط وينشط مستقبلات تام9,10. يتم إنتاج Gas6 في القلب والكلي والرئتين. يتم إنتاج الإيجابيات أساسا في الكبد11. يدرك تام من الخلايا ابوتوتيك في مثل هذه الطريقة ان N-الطرفية من Gas6/الإيجابيات بربط PtdSer علي خليه ابوتوتيك والطرفية C من Gas6/الإيجابيات بربط مستقبلات تام التي ترتكز علي سطح الخلايا الشحمية. بالاضافه إلى المستقبلات الأخرى ، يحدث أحاطه الخلايا الميتة12. علي الرغم من ان مير يمكن ربط كل من الإيجابيات يغاندس و Gas6 ، وجدنا ان Gas6 يبدو ان الحرف الوحيد لالبلعمه مير بوساطة الضامة من الخلايا ابوتوتيك ، والتي يمكن حظرها من قبل المضادة--مير الأضداد13. الضامة هي البالعات المهنية. التخليص السريع للخلايا ابوتوتيك من قبل الضامة مهم لتثبيط التهاب والاستجابات المناعية الذاتية ضد المستضدات داخل الخلايا. مستقبلات مير التيروزين كيناز أمر بالغ الاهميه لأحاطه الضامة والتخليص الفعال للخلايا ابوتوتيك14. في الطحال الفار ، ويعبر مير أساسا علي المنطقة الهامشية والضامة الجسم ملموسه13.
يصف البروتوكول المعروض هنا أسلوبا أساسيا للحث علي الخلايا المبرمجة للخلايا ويوضح طرق قياس العملية وكفاءه افيروسيتوسيس. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهوله لدراسة الافيروسيتوسيس من قبل أنواع الخلايا الأخرى في أحاطه خلايا ابوتوتيك من أصول مختلفه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

الخلية المبرمج هو عمليه طبيعيه ويلعب دورا حاسما في التنمية الجنينية ، وتنظيم التماثل ، والحث التسامح المناعي ، وحل التهاب. تراكم الحطام ابوتوتيك في الجسم قد يؤدي إلى الاستجابات التهابيه المزمنة التي تؤدي إلى امراض المناعة الذاتية الجهازية مع مرور الوقت. تم التورط في أزاله الخلايا الميتة المصابة بامراض المناعة الذاتية. أزاله ابوتوتيك هي عمليه معقده نادرا ما يتم الكشف عنها في ظل الظروف الفسيولوجية. انه ينطوي علي المستقبلات السطحية وفيرة واشاره جزيئات. دراسة عمليه أزاله الخلايا ابوتوتيك يوفر أليات الجزيئية الثاقبة والاستجابات البيولوجية اللاحقة ، والتي قد تؤدي إلى تطوير التداوي الجديدة. هنا ، ونحن وصف بروتوكولات لتحريض الخلايا الدهنية ، واعداد الضامة البريتوني ، وتحليل أزاله الخلايا ابوتوتيك عن طريق تدفق الخلوي والمجهر. وسوف تخضع جميع الخلايا المبرمج في مرحله معينه ، والعديد من الخلايا السكنية والمنتشرة يمكن امتصاص الحطام ابوتوتيك. ولذلك ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا في العديد من التطبيقات لتوصيف ربط الخلية ابوتوتيك والابتلاع بواسطة العديد من أنواع الخلايا الأخرى.

تحليل أحاطه الضامة البريتوني من الخلايا الدهنية. وقد أعدت الضامة البريتوني والخلايا ابوتوتيك وشارك في استزراع كما هو موضح في البروتوكول. وفصلت الضامة وملطخه PE المضادة لCD11b الجسم لمده 20 دقيقه علي الجليد. ثم تم غسل الضامة ومعالجتها في تدفق الخلوي. كما راينا, لا يوجد الضامة الايجابي?...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

هنا ، نقدم بروتوكولا لاعداد الخلايا الدهنية والضامة البريتونية وتحليل كفاءه افيروسيتوسيس والمثبطة المحددة بوساطة عرقله الخلايا الدهنية أحاطه. هذا البروتوكول لديه تطبيق واسعه في الخلية بوساطة أزاله الجزيئات الأخرى بما في ذلك الخرز الاصطناعي والبكتيريا.

التحليل التجريبي لأحاطه الخلايا الشحمية بواسطة الضامة

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

يولد الجسم واحد إلى 10 مليار من الخلايا المبرمجة كل يوم. ويساعد إزالة هذه الخلايا بكفاءة في إزالة حطام الخلايا والحفاظ على المخزونات. يمكن استخدام هذه الطريقة في العديد من التطبيقات لتوصيف ربط الخلايا المبرمج وابتلاع العديد من أنواع الخلايا البلعمية الأخرى.إثبات هذا الإجراء سيكون يوكسوان تشن، وهو فني كبير في مختبري. لحصاد الخلايا الزعترية، بعد فتح تجويف الصدر من ماوس أسود C57 سذج، استخدم ملقط طرف ناعم منحني لسحب الغدة الصعترية. وضع الجهاز في طبق ثقافة الأنسجة التي تحتوي على 10 ملليلتر من RPMI 1640 المتوسطة.طحن الغدة الصعترية كلها ضد نهايات متجمد من اثنين من الشرائح المجهر وتصفية تعليق الأنسجة الناتجة من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب 50 ملليلتر. جمع الخلايا الزعتية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر. بعد عد, الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليق ما يصل إلى مرتين 10 إلى الخلايا الثماني في 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد لكل 50 ملليلتر أنبوب.تسمية الخلايا مع CFSE خمسة ميكرومولار في 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب. عكس الأنابيب مرتين إلى ثلاث مرات لخلط قبل احتضان الخلايا الزعتية لمدة لا تزيد عن دقيقتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، أوقف التفاعل مع 10 ملليلتر من مصل الحصان المعطل للحرارة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.Resuspend الخلايا المسماة في 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للعد والطرد المركزي تليها غسل إضافية مع 40 ملليلتر من المتوسطة. بعد غسل المتوسطة، resuspend الخلايا الزعتية في سبع مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من تركيز متوسط ثقافة الأنسجة وبذات الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 100 ملليمتر. ثم إضافة الستوروسبورين إلى ثقافة الخلية في تركيز نهائي واحد micromolar ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة لمدة أربع ساعات.لعزل الضامة البريتونية، حقن اثنين C57 الأسود 6 الفئران intraperitoneally مع ملليلتر واحد من 3٪ من الثيوغليكولات الذين تتراوح أعمارهم بين في اليوم صفر قبل فتح جلد البطن دون إزعاج الصفاق في اليوم الخامس. لطرد تجويف البريتوني، استخدم حقنة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 18 لدفع بسرعة 10 ملليلتر من عازلة الغسيل في التجويف قبل التعرق ببطء المخزن المؤقت للتخزين لجمعها في أنبوب 50 ملليلتر. غسل lava البريتوني مرتين مع برنامج تلفزيوني.resuspend الضامة البريتونية في مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من تركيز متوسط لثقافة الأنسجة. البذور المقبل 500 ميكرولترات من الضامة في كل بئر من لوحة 24 جيدا ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، استنشاق افراط لإزالة الخلايا العائمة وإضافة 500 ميكرولترات من الأنسجة ثقافة المتوسطة لكل بئر.على الفور إضافة صفر إلى 12 مرة 10 إلى ست ثيموليسيت في 500 ميكرولترات من المتوسط إلى كل بئر من الآبار من الثقافة ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الأنسجة لمدة أربع ساعات. في نهاية الحضانة، وغسل كل جيدا مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لإزالة أي الخلايا المبرمج العائمة الحرة تليها غسل واحد مع عازلة تلطيخ. التسمية المقبلة الضامة لوحة ملزمة مع 200 ميكرولترات من ضوء العازلة تكملة مع المضادة المناسبة CD11b في بئر ووضع لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.في هذه التجربة التمثيلية، أظهرت ما يصل إلى 30٪ من الضامة البريتونية المحفزة thiogly، إشارة إيجابية في قناة CFSE تشير إلى أن هذه البلعات قد ابتلعت الخلايا المبرمجة المسمى CFSE. المراقبة المجهرية من الضامة الابتلاع من الخلايا المبرمج ضروري للتحقيق في قدرة الضامة على استيعاب الخلايا المبرمج كما تليفات سفسي الإيجابية المنتشرة في الربع الأيمن السفلي بسبب كثافة مختلفة تشير إلى أن عدد الخلايا المبرمج داخل الضامة الفردية مختلفة. زيادة نسبة الخلايا المبرمج إلى الضامة لا يزيد فقط من عدد الضامة استيعاب الخلايا المبرمج ولكن أيضا يعزز قدرة الضامة على استيعاب المزيد من الخلايا المبرمج.في مجموعة أخرى من التجارب، حوالي 15٪ من الضامة أصبحت إيجابية CFSE عندما تم إضافة CFSE المسمى الخلايا الزعتية المبرمج إلى ثقافة الضامة لمدة أربع ساعات مما يشير إلى أن هذه الضامة كانت الضامة البلعمية. مير الأجسام المضادة كتل التناضح في المدى الغض النظري بطريقة تعتمد على الجرعة ، وعموما انسداد قد تمثل حوالي 30 ٪ من كفاءة ائي في الإعداد الحالي. بالإضافة إلى ذلك، فإن مثبطات مستقبلات TAM المعتمدة حديثًا تُخفف من هضاب الضامة بطريقة تعتمد على الجرعة تصل إلى تركيز نانومولير حوالي 100.تذكر دائما للتحقق من النسبة المئوية للخلايا المبرمج كما يؤثر هذا العدد مباشرة على كفاءة تليف الدم. يمكن تحليل الضامة البلعوية بمزيد من التحليل بواسطة البقع الغربية للتحقيق في جزيئات الإشارة التي تنظمها عملية الابتلاع والمجهر لدراسة ديناميكيات الابتلاع.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...