Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Forskning i Shao Lab understøttes af forsknings innovativ pris fra College of Medicine og Junior Faculty pilot Award fra Institut for intern medicin, University of Cincinnati og Grant DK K01_095067 fra NIDDK/NIH.

Eksperimentelle mus blev opdrættet og vedligeholdt i vores mus koloni. Alt dyre arbejde blev udført i henhold til retningslinjerne fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved universitetet i Cincinnati.
1. klargøring af cfse mærket apoptotiske thymocytter
<ol><li>Euthanize to naive C57/B6 mus ved co2 indånding i 10 min og dissekere for at åbne brystet hulrum, fjerne (trække) thymus med buede fine-spids pincet i vævskultur petriskål indeholdende 10 m...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

Apoptose er en meget velbevaret celledød proces, der involverer mange signal kaskader og inducerer protein udtryk, sekretion, og transport. Apoptose er ofte forbundet med cellulære morfologi ændringer17. Apoptotiske celler frigive aktivt cytokiner og chemokiner, der tiltrækker fagocytter at migrere til stedet og indlede processen med optænding, en yderst kompleks vej under stram kontrol18. På den anden side frigiver nekrotisk celledød faresignaler, der udløser infla...

Vores krop genererer 1-10 milliarder apoptotiske celler på daglig basis. Et så stort antal apoptotiske celler skal ryddes på en sådan måde, at immunresponset fortsat er i stigning. For at sikre clearance af apoptotiske celler i tide, mange typer af væv residente celler og cirkulerende celler udvikle mekanismer til at opsluge apoptotiske celler1. Dysfunktionel regulering af apoptose har været impliceret i debut og progression af forskellige inflammatoriske sygdom og autoimmunitet2. Apoptose spiller også en afgørende rolle i patogenesen af kræft udvikling og dens efterfølgende resistens over for konventionelle behandlinger3,4. Fjernelse af apoptotiske celler generelt fremmer en anti-inflammatorisk respons, som kan være forbundet med immunologisk tolerance5. Forstyrrelse af apoptotisk celle rydning driver selv immunisering og bidrager til udviklingen af systemiske autoimmune sygdomme hos både mennesker og mus6.
Når cellerne gennemgår apoptose, eksponerer de Phosphatidylserin (PtdSer) fra den indre indlægsseddel til membranens ydre indlægsseddel. PtdSer vil derefter blive genkendt af fagocytter gennem overflade receptorer. Over et dusin receptorer er blevet identificeret til at genkende og/eller lette optænding af apoptotiske celler. Generelt er der mindst tre typer af overflade receptorer involveret i apoptotiske celle clearance: tethering receptorer, genkende apoptotiske celler; tikkende receptorer, initiere optænding; kaperening receptorer, lette hele processen7. TAM-receptor tyrosinkinaser (TAM RTKs) består af TYRO-3, AXL og Mer og udtrykkes primært ved myeloide celler i immunsystemet8. Den primære funktion af TAM RTKs er at tjene som tethering receptorer, lette den fagocytiske fjernelse af apoptotiske celler og snavs. Vores gruppe har studeret Tam medieret apoptotiske celle clearance i fastsættelsen af autoimmuniteten i mange år. Den vitamin K-afhængige protein vækst arrestere specifikke protein 6 (Gas6) og protein S (ProS) binder sig til og aktiverer Tam receptorer9,10. Gas6 er fremstillet i hjertet, nyrerne og lungerne. ProS er hovedsageligt produceret i leveren11. TAM genkender apoptotiske celler på en sådan måde, at N-terminalen i Gas6/ProS binder sig til PtdSer på en apoptotisk celle og C-terminalen i Gas6/ProS binder sig til TAM-receptorer, der er forankret på overfladen af fagocytter. Sammen med de andre receptorer, optænding af apoptotiske celler forekommer12. Selv om Mer kan binde til både ligander ProS og Gas6, vi fandt, at Gas6 synes at være den eneste ligand for Mer-medieret makrophage fagocytose af apoptotiske celler, som kan blokeres af anti-Mer antistof13. Makrofager er professionelle fagocytter. Hurtig clearance af apoptotiske celler ved makrofager er vigtig for hæmning af inflammation og autoimmune reaktioner mod intracellulære antigener. Mer-receptor-tyrosinkinase er afgørende for makrofag-opløbet og effektiv clearance af apoptotiske celler14. I muse milt udtrykker Mer hovedsageligt den marginale zone og de håndgribelige makrofager13.
Den protokol, der præsenteres her beskriver en grundlæggende metode til at fremkalde Cell apoptose og demonstrere måder at måleprocessen og effektiviteten af efferocytose. Disse protokoller kan let tilpasses til at studere efferocytose af andre celletyper i engulfment af apoptotiske celler af forskellig oprindelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

Cell apoptose er en naturlig proces og spiller en afgørende rolle i fosterudvikling, homeostatisk regulering, immuntoleranceinduktion, og opløsning af betændelse. Ophobning af apoptotiske rester i kroppen kan udløse kroniske inflammatoriske reaktioner, der fører til systemiske autoimmune sygdomme over tid. Nedsat apoptotisk celle clearance har været impliceret i en række autoimmune sygdomme. Apoptotisk clearance er en kompleks proces, der sjældent påvises under fysiologiske forhold. Det involverer rigelige overflade receptorer og signalering molekyler. Studiet af processen med apoptotisk celle clearance giver indsigtsfulde molekylære mekanismer og efterfølgende biologiske reaktioner, som kan føre til udvikling af nye behandlingsmetoder. Her beskriver vi protokoller til induktion af apoptotiske thymocytter, fremstilling af peritonealdialyse makrofager og analyse af apoptotisk celle clearance ved flow cytometri og mikroskopi. Alle celler vil gennemgå apoptose på et bestemt stadie, og mange beboelses-og cirkulerende celler kan optages apoptotisk snavs. Derfor kan den protokol, der er beskrevet her, bruges i mange applikationer til at karakterisere apoptotiske cellebinding og indtagelse af mange andre celletyper.

Analyse af peritonealdialyse macrophage-medieret optænding af apoptotiske thymocytter. Peritoneal makrofager og apoptotiske celler blev tilberedt og co-kuleret som beskrevet i protokollen. Makrofager blev løsrevet og plettet med PE konjugeret anti-CD11b-antistof i 20 minutter på is. Makrofager blev derefter vasket og forarbejdet i et flow cytometer. Som set er der ingen CFSE-positiv makrofag i nederste højre kvadrant, når der ikke er tilsat apoptotiske celler i kulturen (figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Her præsenterer vi en protokol til at forberede apoptotiske thymocytter og peritonealdialyse makrofager og analysere effektiviteten af efferocytose og den specifikke inhibitor-medieret blokering af apoptotiske thymocytter engulfment. Denne protokol har en bred anvendelse i celle-medieret clearance af andre partikler, herunder kunstige perler og bakterier.

Eksperimentel analyse af apoptotisk Thymocyt engulfment af makrofager

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Vores krop genererer en til 10 milliarder apoptotiske celler hver dag. Den effektive clearance af disse celler hjælper med at fjerne cellerester og vedligeholde lagerbeholdninger. Denne metode kan anvendes i mange applikationer til at karakterisere apoptotisk cellebinding og indtagelse af mange andre fagocytiske celletyper.Demonstration af denne procedure vil være Yuxuan Zhen, en ledende tekniker i mit laboratorium. At høste thymocytter, efter åbning af brysthulen af en naiv C57 sort 6 mus, bruge buede fine spids kraftberykninger til at trække sig ud thymus. Placer organet i en vævskulturskål, der indeholder 10 milliliter RPMI 1640 Medium.Grind hele thymus mod de matterede ender af to mikroskop dias og filtrere den resulterende væv suspension gennem en 70 mikrometer celle si i en 50 milliliter rør. Opsaml thymocytterne ved centrifugering og opstimer pellet i 40 milliliter. Efter optælling centrifugeres cellerne igen og opspjæls op til to gange 10 til de otte celler i 20 milliliter frisk PBS pr. 50 milliliterrør.Mærke cellerne med fem mikromolar CFSE i 20 milliliter PBS pr. rør. Inverter rørene to til tre gange for at blande, før thymocytterne inkuberes i højst to minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning standses reaktionen med 10 milliliter varmeinaktiveret hesteserum, og cellerne opsamres ved centrifugering.De mærkede celler opstemts i 40 milliliter frisk PBS til optælling og centrifugering efterfulgt af en ekstra vask med 40 milliliter medium. Efter medium vask, resuspend thymocytter på en syv gange 10 til de seks celler pr milliliter af væv kultur medium koncentration og frø cellerne i en 100 millimeter væv kultur parabol. Derefter tilsættes staurosporin til cellekulturen ved en en mikromolar endelig koncentration og læg pladen i en vævskulturinkubator i fire timer.For peritoneal makrofag isolation, injicere to C57 sorte 6 mus intraperitoneally med en milliliter på 3% alderen thioglycollate på dag nul før åbning af abdominal hud uden at forstyrre bughinden på dag fem. For at skylle bughulen skylles en 10 millilitersprøjte udstyret med en 18 gauge nål til hurtigt at skubbe 10 milliliter vaskebuffer ind i hulrummet, før vaskbufferen langsomt indsugning i et 50 milliliterrør. Peritoneal lavagen vaskes to gange med PBS.Opsaltning af peritoneal makrofager på en to gange 10 til de seks celler pr milliliter af væv kultur medium koncentration. Næste frø 500 mikroliter af makrofager i hver brønd af en 24 brønd plade og placere pladen i et væv kultur inkubator i to timer. I slutningen af inkubationen, aspirere supernatant at fjerne de flydende celler og tilsæt 500 mikroliter af væv kultur medium til hver brønd.Tilsæt straks nul til 12 gange 10 til de seks thymocytter i 500 mikroliter af medium til hver brønd af kulturen og læg pladen i vævskulturinkubatoren i fire timer. Ved slutningen af inkubationen vaskes hver brønd to gange med frisk PBS for at fjerne eventuelle fritflydende apoptotiske celler efterfulgt af en enkelt vask med farvningsbuffer. Næste mærke plade-bundet makrofager med 200 mikroliter af farvning buffer suppleret med en passende anti-CD11b antistof per brønd og placere pladen på fire grader Celsius i 20 minutter.I dette repræsentative eksperiment viste op til 30 % af thioglycollatet peritoneal makrofager et positivt signal i CFSE-kanalen, der indikerede, at disse fagocytter havde indtaget CFSE-mærkede apoptotiske celler. Mikroskopisk observation af makrofagopslugelse af apoptotiske celler er afgørende for at undersøge makrofagernes evne til at indtage apoptotiske celler, da CFSE-positive makrofager spredes i nederste højre kvadrant på grund af forskellige intensiteter, der indikerer, at antallet af enpoptotisk celler i de enkelte makrofager er forskelligt. Et højere forhold mellem apoptotiske celler og makrofager øger ikke kun antallet af makrofager, der indtager apoptotiske celler, men øger også makrofagernes evne til at indtage flere apoptotiske celler.I et andet sæt af eksperimenter blev ca. 15 % af makrofagerne CFSE-positive, da CFSE-mærket apoptotiske thymocytter blev føjet til makrofagkulturen i fire timer, hvilket indikerede, at disse makrofager var de fagocytiske makrofager. Mer antistof blokerer makrofag efferocytose i en dosis-afhængig måde og den samlede blokering kan tegne sig for omkring 30% af efferocytose effektivitet i den nuværende indstilling. Desuden dæmper en nyligt godkendt TAM-receptorhæmmer makrofageeæfferocytose på en dosisafhængig måde op til en koncentration af ca. 100 nanomolar.Husk altid at kontrollere procentdelen af apoptotiske celler, da dette tal direkte påvirker effektiviteten af efferocytose. De fagocytiske makrofager kan analyseres yderligere af Western blot for at undersøge de signalmolekyler, der reguleres af opsvpæringsprocessen, og ved mikroskopi for at studere opslugelses dynamikken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse af Pulmonal dendritiske celle modning og migration under Allergisk luftvejene

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Anvendelse af<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; For at studere autofagi-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Stærkt Effektiv Transfektion af menneskelige THP-1 makrofager ved nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomisk Profilering af makrofager ved 2D elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantificering af Cytosolisk vs. vakuolær<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primære Makrofager af Differential Permeabilisering

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolisk karakterisering af polariseret M1 og M2 knoglemarv-afledte Makrofager Brug Real-time Ekstracellulær Flux Analyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...