Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Onderzoek in de Shao Lab wordt ondersteund door onderzoek innovatieve Award van het College of Medicine en de Junior Faculty pilot Award van het ministerie van interne geneeskunde, Universiteit van Cincinnati en Grant DK K01_095067 van NIDDK/NIH.

Experimentele muizen werden gefokt en onderhouden in onze muizen kolonie. Alle dierlijk werk werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Cincinnati.
1. voorbereiding van CFSE gelabeld apoptotic thymocyten
<ol><li>Euthanaseren twee naïeve C57/B6 muizen door CO2 inhalatie voor 10 min en ontleden om de borstholte te openen, verwijderen (pull out) de thymus met gebogen Fine-Tip Tang in weefselcultuur petr...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

Apoptosis is een hoogst behouden celdood proces dat vele signaalcascades impliceert en proteïne uitdrukking, afscheiding, en vervoer veroorzaakt. Apoptosis wordt vaak geassocieerd met cellulaire morfologie veranderingen17. Apoptotic cellen actief vrijgeven cytokines en chemokines die aantrekken fagocyten om te migreren naar de site en initiëren van het proces van overspoeling, een uiterst complexe route onder strakke controle18. Aan de andere kant, necrotic Cell Death rel...

Ons lichaam genereert 1-10 miljard apoptotic cellen op een dagelijkse basis. Zulk een groot aantal apoptotic cellen moet op een bepaalde manier worden ontruimd dat de immune reacties rustig blijven. Om de goedkeuring van apoptotic cellen tijdig te verzekeren, ontwikkelen talrijke types van weefsel ingezetene cellen en circulerende cellen mechanismen om apoptotic cellen over te spoelen1. Disfunctionele regulering van apoptosis is betrokken bij het begin en de progressie van verschillende inflammatoire aandoeningen en autoimmuniteit2. Apoptosis speelt ook een kritieke rol in de pathogenese van kankerontwikkeling en zijn verdere weerstand tegen conventionele behandelingen3,4. Verwijdering van apoptotic cellen bevordert in het algemeen een anti-inflammatoire reactie, die kan worden gekoppeld aan immunologische tolerantie5. Verstoring van apoptotic Cell klaring drives zelf-immunisatie en draagt bij tot de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten in zowel mensen als muizen6.
Wanneer de cellen apoptosis ondergaan, stellen zij de fosfatidylserine (PtdSer) van de binnen folder aan de buiten folder van het membraan bloot. PtdSer zal dan door fagocyten door oppervlakte receptoren worden erkend. Meer dan een dozijn receptoren zijn geïdentificeerd te herkennen en/of te vergemakkelijken de overspoeling van apoptotic cellen. In het algemeen zijn er ten minste drie soorten oppervlakte-receptoren die betrokken zijn bij de apoptotic cel klaring: Tethering receptoren, herkennen apoptotic cellen; kietelen receptoren, initiëren overspoeling; chaperoning receptoren, vergemakkelijken het hele proces7. TAM receptor tyrosine kinases (TAM RTKs) bestaan uit Tyro-3, AXL, en Mer en worden voornamelijk uitgedrukt door myeloïde cellen van het immuunsysteem8. De primaire functie van TAM RTKs is om te dienen als Tethering receptoren, het vergemakkelijken van de fagocyterende verwijdering van apoptotic cellen en puin. Onze groep heeft gestudeerd TAM gemedieerde apoptotic Cell klaring in de setting van de autoimmuniteit voor vele jaren. De vitamine K-afhankelijke eiwit de groeiarrestatie specifieke proteïne 6 (Gas6) en proteïne S (ProS) bindt aan en activeert de receptoren van TAM9,10. Gas6 wordt geproduceerd in het hart, nieren, en de longen. ProS wordt hoofdzakelijk geproduceerd in lever11. TAM erkent van apoptotic cellen op een zodanige wijze dat de N-terminal van Gas6/ProS bindt aan de PtdSer op een apoptotic cel en de C-terminal van Gas6/ProS bindt aan TAM-receptoren die verankerd op het oppervlak van fagocyten. Samen met de andere receptoren, overspoeling van apoptotic cellen komt12. Hoewel Mer kan binden aan zowel de ligands ProS en Gas6, vonden we dat Gas6 lijkt te zijn de enige ligand voor Mer-gemedieerde macrofagen fagocytose van apoptotic cellen, die kunnen worden geblokkeerd door anti-Mer antilichaam13. Macrofagen zijn professionele fagocyten. Snelle ontruiming van apoptotic cellen door macrofagen is belangrijk voor de remming van ontstekingen en auto-immune reacties tegen intracellulaire antigenen. Mer receptor tyrosine kinase is van cruciaal belang voor de inspoeling van de macrofagen en efficiënte klaring van apoptotic cellen14. In muis milt, Mer voornamelijk uitdrukt op de marginale zone en tastbare lichaam macrofagen13.
Het hier voorgestelde protocol beschrijft een basismethode om cel apoptosis te veroorzaken en manieren aan te tonen om het proces en de efficiency van efferocytosis te meten. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan studie efferocytosis door andere cel types in het overspoelen van apoptotic cellen van verschillende oorsprong.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

De cel apoptosis is een natuurlijk proces en speelt een kritieke rol in embryonale ontwikkeling, homeostatische regelgeving, immune tolerantie inductie, en resolutie van ontsteking. Accumulatie van apoptotic puin in het lichaam kan leiden tot chronische inflammatoire reacties die leiden tot systemische auto-immuunziekten in de tijd. Verminderde apoptotic cel klaring is betrokken bij een verscheidenheid van auto-immuunziekten. Apoptotic klaring is een complex proces zelden ontdekt onder fysiologische omstandigheden. Het gaat om overvloedig oppervlak receptoren en signalering moleculen. Het bestuderen van het proces van apoptotic cel ontruiming biedt inzichtelijke moleculaire mechanismen en de daaropvolgende biologische reacties, die kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Hier beschrijven we protocollen voor de inductie van apoptotic thymocyten, de voorbereiding van het buikvlies macrofagen, en de analyse van apoptotic cel ontruiming doorstroming Cytometry en microscopie. Alle cellen zullen apoptose ondergaan in een bepaald stadium, en veel residentiële en circulerende cellen kunnen opname apoptotic puin. Daarom, het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotic cel binding en inname door vele andere soorten cellen.

Analyse van het buikvlies macrofagen-gemedieerde overspoeling van apoptotic thymocyten. Buik macrofagen en apoptotic cellen werden voorbereid en co-Cultured zoals beschreven in het protocol. Macrofagen werden losgemaakt en gekleurd met PE geconjugeerd anti-CD11b antilichaam voor 20 min op ijs. Macrofagen werden vervolgens gewassen en verwerkt in een stroom cytometer. Zoals te zien, er is geen CFSE positieve macrofagen in de rechtsonder Kwadrant als er geen apoptotic cellen werden toegevoegd in de cultuur...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.

Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Ons lichaam genereert elke dag één tot 10 miljard apoptotische cellen. De efficiënte klaring van deze cellen helpt bij het verwijderen van celpuin en het onderhouden van inventarissen. Deze methode kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotische cel binding en inname door vele andere fagocytische cel types.Het aantonen van deze procedure zal Yuxuan Zhen zijn, een senior technicus in mijn lab. Om thymocyten te oogsten, gebruik je na het openen van de borstholte van een naïeve C57 zwarte 6 muis gebogen fijne puntkrachten om de thymus eruit te trekken. Plaats het orgaan in een weefselkweekschotel met 10 milliliter RPMI 1640 Medium.Maal de hele thymus tegen de matte uiteinden van twee microscoopdia's en filter de resulterende weefselsuspensie door een 70 micrometercelzeef in een buis van 50 milliliter. Verzamel de thymocyten door centrifugatie en resuspend de pellet in 40 milliliter. Na het tellen, centrifugeren de cellen opnieuw en resuspend tot twee keer 10 tot de acht cellen in 20 milliliter verse PBS per 50 milliliter buis.Label de cellen met vijf micromolar CFSE in 20 milliliter PBS per buis. Keer de buizen twee tot drie keer om te mengen voordat u de thymocyten niet langer dan twee minuten uitbroedt bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie stopt u de reactie met 10 milliliter warmtegeactiveerd paardenserum en verzamelt u de cellen door centrifugatie.Resuspend de gelabelde cellen in 40 milliliter verse PBS voor het tellen en centrifugeren, gevolgd door een extra wasbeurt met 40 milliliter medium. Na de medium wasbeurt, resuspend de thymocyten op een zeven keer 10 tot de zes cellen per milliliter van weefsel cultuur medium concentratie en zaad van de cellen in een 100 millimeter weefsel kweekschotel. Voeg vervolgens staurosporine toe aan de celkweek bij een uiteindelijke concentratie van één micromolar en plaats de plaat vier uur in een weefselkweek incubator.Voor peritoneale macrofagenisolatie, injecteer twee C57 zwarte 6 muizen intraperitoneally met een milliliter van 3% ouder thioglycollate op dag nul voor het openen van de buikhuid zonder het peritoneum op dag vijf te verstoren. Om de buikholte door te spoelen, gebruik een 10 milliliter spuit uitgerust met een 18-meter naald om snel 10 milliliter wasbuffer in de holte te duwen voordat u de wasbuffer langzaam in een 50 milliliter buis spoelt. Was de buikvliesspoeling twee keer met PBS.Resuspend de buikvliesmacrofagen op een twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter van weefsel cultuur medium concentratie. Volgende zaad 500 microliter van macrofagen in elke put van een 24 put plaat en plaats de plaat in een weefsel cultuur incubator voor twee uur. Aan het einde van de incubatie, aspirate de supernatant om de drijvende cellen te verwijderen en voeg 500 microliter van weefsel cultuur medium aan elke put.Voeg onmiddellijk nul tot 12 keer 10 toe aan de zes thymocyten in 500 microliter van medium tot elke put van de cultuur en plaats de plaat vier uur in de weefselkweek incubator. Aan het einde van de incubatie, was elke put twee keer met verse PBS om alle vrij zwevende apoptotische cellen te verwijderen, gevolgd door een enkele wasbeurt met kleuring buffer. Vervolgens label de plaatgebonden macrofagen met 200 microliter kleuring buffer aangevuld met een passende anti-CD11b antilichaam per put en plaats de plaat op vier graden Celsius gedurende 20 minuten.In dit representatieve experiment toonde tot 30% van de thioglycollate gestimuleerde peritoneale macrofagen een positief signaal aan in het CFSE-kanaal dat aangeeft dat deze fagocyten cfse-gelabelde apoptotische cellen hadden ingenomen. Microscopische observatie van macrofaagvergulfment van apoptotische cellen is essentieel voor het onderzoeken van de capaciteit van macrofagen om apoptotische cellen in te nemen, aangezien CFSE-positieve macrofagen zich in het kwadrant rechtsonder verspreiden als gevolg van verschillende intensiteiten die erop wijzen dat het aantal apoptotische cellen binnen individuele macrofagen anders is. Een hogere verhouding van apoptotische cellen tot macrofagen verhoogt niet alleen het aantal macrofagen dat apoptotische cellen inneemt, maar verhoogt ook het vermogen van de macrofagen om meer apoptotische cellen in te nemen.In een andere reeks experimenten werd ongeveer 15% van de macrofagen CFSE-positief toen CFSE met het label apoptotische thymocyten gedurende vier uur aan de macrofaagcultuur werd toegevoegd, wat aangeeft dat deze macrofagen de fagocytische macrofagen waren. Mer-antilichaam blokkeert macrofaag-efferocytose op een dosisafhankelijke manier en de algehele blokkade kan ongeveer 30% van de efficiëntie van de efferocytose in de huidige stand vertegenwoordigen. Bovendien verzwakt een nieuw goedgekeurde TAM-receptorremmer macrofaageefoccytose op een dosisafhankelijke manier tot een concentratie van ongeveer 100 nanomolar.Vergeet niet om het percentage van de apoptotische cellen te controleren, omdat dit getal direct van invloed is op de efficiëntie van efferocytose. De fagocytische macrofagen kunnen verder worden geanalyseerd door westerse vlek om de signaalmoleculen te onderzoeken die door engulfmentproces worden geregeld en door microscopie om de dynamiek van engulfment te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...