Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
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Die Forschung im Shao Lab wird unterstützt durch den Research Innovative Award des College of Medicine und den Junior Faculty Pilot Award von der Abteilung für Innere Medizin der Universität Cincinnati und gewähren DK K01_095067 von NIDDK/NIH.

In unserer Mäusekolonie wurden experimentelle Mäuse gezüchtet und gepflegt. Alle Tierarbeiten wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität von Cincinnati durchgeführt.
1. Zubereitung von CFSE mit Apoptotic Thymozyten gekennzeichnet
<ol><li>Zwei naive C57/B6-Mäuse mit CO2 -Inhalation für 10 min und Sekt, um die Brusthöhle zu öffnen, entfernen (ziehen) den Thymus mit gekrümmten Feinspitzen-Zangen in die Gewebekultur Pe...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

Apoptose ist ein hochkonservierter Zelltod Prozess, der viele Signalkaskaden mit sich bringt und Proteinausdruck, Sekretion und Transport hervorruft. Die Apoptose wird oft mit den Veränderungen der Zellmorphologie 17 in Verbindung gebracht. Apoptotische Zellen setzen aktiv Zytokine und Chemokine frei, die Phagozyten anziehen, um auf die Website zu migrieren und den Prozess der Enge einzuleiten, ein extrem komplexer Pfad unter strenger Kontrolle18. Auf der anderen Seite set...

Unser Körper erzeugt 1-10 Milliarden apoptotische Zellen täglich. Eine so große Anzahl apoptotischer Zellen muss so geklärt werden, dass die Immunreaktionen ruhig bleiben. Um die rechtzeitige Freigabe von apoptotischen Zellen zu gewährleisten, entwickeln zahlreiche Arten von Gewebezellen und zirkulierenden Zellen Mechanismen, um apoptotische Zellenzu verschlingen. Die Dysfunktionale Regulierung der Apoptose wurde in den Beginn und das Fortschreiten verschiedener entzündlicher Erkrankungen und der Autoimmunität2 in den Körper verwickelt. Die Apoptose spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Krebsentwicklung und ihrer anschließenden Resistenz gegen konventionelle Behandlungen3,4. Das Entfernen von apoptotischen Zellen fördert in der Regel eine entzündungshemmende Reaktion, die mit der immunologischen Toleranz in Verbindung gebracht werden kann 5. Die Störung der apoptotischen Zellfreiheit treibt die Selbstironie voran und trägt zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen bei.
Wenn sich die Zellen einer Apoptose unterziehen, setzen sie das Phosphatidylserin (PtdSer) vom inneren Flugblatt zum äußeren Merkblatt der Membran aus. PtdSer wird dann durch Oberflächenrezeptoren durch Phagozyten erkannt. Mehr als ein Dutzend Rezeptoren wurden identifiziert, um die Verengung von apoptotischen Zellen zu erkennen und zu erleichtern. In der Regel sind mindestens drei Arten von Oberflächenrezeptoren in den apoptotischen Zellabstand involviert: Tethering-Rezeptoren, Apoptotikzellen erkennen; Tickling-Rezeptoren, Auflösung auslösen; Begleitrezeptoren, erleichtern den gesamtenProzess 7. TAM-Rezeptor-Tyrosinkinasen (TAM RTKs) bestehen aus T yro-3, Axl und M er und werdenvor allem durch myeloide Zellen des Immunsystems8 ausgedrückt. Die primäre Funktion von TAM RTKs ist es, als innimmende Rezeptoren zu dienen, was die phagozytische Entfernung von apoptotischen Zellen und Schutt erleichtert. Unsere Fraktion hat seit vielen Jahren die Behandlung von TAM vermittelter apoptotischer Zellfreiheit im Rahmen der Autoimmunität untersucht. Das Vitamin K-abhängige Proteinwachstum verhaftet spezifisches Protein 6 (Gas6) und Protein S (ProS) bindetundaktiviert TAM-Rezeptoren 9,10. Gas6 wird im Herzen, in den Nieren und in der Lunge produziert. ProS wird hauptsächlich in der Leber 11produziert. TAM erkennt die apoptotischen Zellen so, dass das N-Terminal von Gas6/ProS auf einer apoptotischen Zelle an den PtdSer bindet und das C-Terminal von Gas6/ProS an TAM-Rezeptoren bindet, die auf der Oberfläche von Phagozyten verankert sind. Zusammen mit den anderen Rezeptoren erfolgt die Verengung der apoptotischen Zellen 12. Obwohl Mer sowohl an die Liganden ProS als auch Gas6 binden kann, haben wir festgestellt, dass Gas6 der einzige Ligand für die von der Mer-vermittelten Makrophage-Phagozytosederapoptotischen Zellen zu sein scheint, die durch den Anti-Mer-Antikörper 13 blockiert werden kann. Makrophagen sind professionelle Phagozyten. Die schnelle Räumung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist wichtig für die Hemmung von Entzündungen und Autoimmunreaktionen gegen intrazelluläre Antigene. Die Mer-Rezeptor-Tyrosinkinase ist entscheidend für die Makrophage-Gravur und die effiziente Räumung der apoptotischen Zellen 14. In der Maus-Milz drückt Mer vor allem auf die Randzoneundgreifbare Körpermakrophagen 13.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode, um die Zellapoptose zu induzieren und Wege aufzuzeigen, wie der Prozess und die Effizienz der Eskrozytose gemessen werden können. Diese Protokolle können leicht angepasst werden, um die Eerozytose durch andere Zelltypen in der Verengung von apoptotischen Zellen unterschiedlicher Herkunft zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

Die Zellapoptose ist ein natürlicher Prozess und spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung, der homöostatischen Regulierung, der Immuntoleranzinduktion und der Auflösung von Entzündungen. Die Ansammlung von apoptotischen Schutt im Körper kann chronisch entzündliche Reaktionen auslösen, die im Laufe der Zeit zu systemischen Autoimmunerkrankungen führen. Die gestörte Apoptotikzellfreiheit wurde in eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen verwickelt. Die Apoptotikabstände sind ein komplexer Prozess, der selten unter physiologischen Bedingungen entdeckt wird. Es handelt sich um reichlich Oberflächenrezeptoren und Signalmoleküle. Die Untersuchung des Prozesses der apoptotischen Zellfreiheit bietet aufschlussreiche molekulare Mechanismen und anschließende biologische Reaktionen, die zur Entwicklung neuer Therapeutika führen können. Hier beschreiben wir Protokolle zur Induktion von apoptotischen Thymozyten, zur Herstellung von peritonealen Makrophagen und zur Analyse der apoptotischen Zellfreiheit durch Strömungszytometrie und Mikroskopie. Alle Zellen werden sich in einem bestimmten Stadium einer Apoptose unterziehen, und viele Wohn-und Umlaufzellen können apoptotische Trümmer aufnehmen. Daher kann das hier beschriebene Protokoll in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und-einnahme durch viele andere Zelltypen zu charakterisieren.

Analyse der peritonealen makrophage-vermittelten Verengung von apoptotischen Thymozyten. Peritoneale Makrophagen und apoptotische Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben vorbereitet und mitkultiviert. Macrophagen wurden abgetrennt und mit PE-konjugierten Anti-CD11b-Antikörper für 20 Minuten auf Eis befleckt. Makrophagen wurden dann gewaschen und in einem Strömungszytometer verarbeitet. Wie man sieht, gibt es kein positives Makrophage in der unteren rechten Seite, wenn keine apoptotischen Zellen in ...

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Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Unser Körper erzeugt täglich ein bis zehn Milliarden apoptotische Zellen. Die effiziente Clearance dieser Zellen hilft bei der Beseitigung von Zellablagerungen und der Aufrechterhaltung von Lagerbeständen. Diese Methode kann in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und -aufnahme durch viele andere phagozytische Zelltypen zu charakterisieren.Demonstriert dieses Verfahren wird Yuxuan Zhen, ein leitender Techniker in meinem Labor. Um Thymosyten zu ernten, verwenden Sie nach dem Öffnen der Brusthöhle einer naiven C57 black 6 Maus gekrümmte feine Spitzenzange, um den Thymus herauszuziehen. Legen Sie das Organ in eine Gewebekulturschale mit 10 Milliliter rpMI 1640 Medium.Schleifen Sie den ganzen Thymus gegen die gefrosteten Enden zweier Mikroskopschlitten und filtern Sie die resultierende Gewebesuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie die Thymosyten durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 40 Millilitern wieder auf. Nach dem Zählen zentrieren Sie die Zellen wieder und setzen Sie bis zu zwei Mal 10 bis zu den acht Zellen in 20 Millilitern frischer PBS pro 50 Milliliter Tube wieder ab.Beschriften Sie die Zellen mit fünf mikromolaren CFSE in 20 Milliliter PBS pro Tube. Invertieren Sie die Rohre zwei bis drei Mal, um sie zu mischen, bevor Sie die Thymosyten für nicht mehr als zwei Minuten bei Lichtschutz inkubieren. Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Reaktion mit 10 Millilitern Hitze inaktiviertes Pferdeserum und sammeln die Zellen durch Zentrifugation.Setzen Sie die beschrifteten Zellen in 40 Millilitern frischer PBS für Zählen und Zentrifugieren wieder auf, gefolgt von einer zusätzlichen Wäsche mit 40 Millilitern Medium. Nach der mittleren Wäsche die Thymosyten siebenmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Gewebekultur mittlere Rinnskonzentration aussetzen und die Zellen in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale säen. Dann staurosporin in die Zellkultur in einer mikromolaren Endkonzentration hinzufügen und die Platte vier Stunden lang in einen Gewebekultur-Inkubator geben.Zur peritonealen Makrophagenisolierung, injizieren Sie zwei C57 schwarze 6 Mäuse intraperitoneal mit einem Milliliter von 3% im Alter von Thioglycolat am Tag Null, bevor Sie die Bauchhaut öffnen, ohne das Peritoneum am fünften Tag zu stören. Um die Peritonealhöhle zu spülen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Spur-Nadel, um schnell 10 Milliliter Waschpuffer in den Hohlraum zu schieben, bevor Sie langsam den Waschpuffer zur Abholung in ein 50-Milliliter-Rohr anzapfen. Waschen Sie die Peritonealspülung zweimal mit PBS.Setzen Sie die peritonealen Makrophagen bei zwei mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter Gewebekultur mittlere Konzentration aus. Nächster Samen 500 Mikroliter Makrophagen in jeden Brunnen einer 24 Brunnenplatte und legen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie den Überstand, um die schwimmenden Zellen zu entfernen und fügen Sie 500 Mikroliter Gewebekultur Medium zu jedem Brunnen.Fügen Sie sofort Null bis 12 mal 10 zu den sechs Thymosyten in 500 Mikroliter n. Medium zu jedem Brunnen der Kultur hinzu und legen Sie die Platte vier Stunden lang im Inkubator der Gewebekultur auf. Am Ende der Inkubation, waschen Sie jeden Brunnen zwei Mal mit frischen PBS, um alle frei schwebenden apoptotischen Zellen gefolgt von einer einzigen Wäsche mit Färbepuffer zu entfernen. Als nächstes beschriften Sie die plattengebundenen Makrophagen mit 200 Mikrolitern Färbepuffer, ergänzt durch einen geeigneten Anti-CD11b-Antikörper pro Brunnen, und legen Sie die Platte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius ab.In diesem repräsentativen Experiment zeigten bis zu 30% der thioglyolat stimulierten peritonealen Makrophagen ein positives Signal im CFSE-Kanal, das darauf hindeutet, dass diese Phagozyten CFSE-markierte apoptotische Zellen aufgenommen hatten. Die mikroskopische Beobachtung der Makrophagenverschluckung von apoptotischen Zellen ist für die Untersuchung der Fähigkeit von Makrophagen, apoptotische Zellen aufzunehmen, als CFSE-positive Makrophagen sich im unteren rechten Quadranten ausbreiten, da verschiedene Intensitäten darauf hindeuten, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen innerhalb einzelner Makrophagen unterschiedlich ist. Ein höheres Verhältnis von apoptotischen Zellen zu Makrophagen erhöht nicht nur die Anzahl der Makrophagen, die apoptotische Zellen aufnehmen, sondern verbessert auch die Fähigkeit der Makrophagen, mehr apoptotische Zellen aufzunehmen.In einer anderen Reihe von Experimenten wurden etwa 15% der Makrophagen CFSE-positiv, als CFSE-beschriftete apoptotische Thymozyten vier Stunden lang der Makrophagenkultur hinzugefügt wurden, was darauf hindeutet, dass diese Makrophagen die phagozytischen Makrophagen waren. Mer-Antikörper blockiert die Makrophagen-Efferozytose dosisabhängig und die Gesamtblockade kann etwa 30 % der Efferozytose-Effizienz in der aktuellen Einstellung ausmachen. Darüber hinaus dämt ein neu zugelassener TAM-Rezeptor-Inhibitor die Makrophagen-Efferozytose dosisabhängig bis zu einer Nanomolarkonzentration ab.Denken Sie immer daran, den Prozentsatz der apoptotischen Zellen zu überprüfen, da diese Zahl direkt die Effizienz der Efferozytose beeinflusst. Die phagozytischen Makrophagen können von Western Blot weiter analysiert werden, um die Signalmoleküle zu untersuchen, die durch verschlungenen Prozess und mikroskopische Simulation reguliert werden, um die Dynamik der Verschlingen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...