Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

מחקר במעבדת האלה נתמך על ידי מחקר של פרס חדשני של המכללה לרפואה ואת הפרס טייס הפקולטה זוטר מהמחלקה לרפואה פנימית, אוניברסיטת סינסינטי וגרנט DK K01_095067 מ NIDDK/NIH.

עכברים ניסיוניים התרבו והחזיקו במושבת העכברים שלנו. כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי.
1. הכנת תימוציטים מותווית של CFSE
<ol><li>המתת חסד שני העכברים C57/B6 על ידי CO2 שאיפת עבור 10 דקות ולנתח כדי לפתוח את חל...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

אפופטוזיס הוא תהליך שימור מאוד תאים מוות המערבת הרבה אותות מפלי ומשרה ביטוי חלבון, הפרשה, ותחבורה. אפופטוזיס קשורה לעיתים קרובות עם שינויים מורפולוגיה הסלולר17. תאים אפוטוטיים משחררים ציטוקינים ונוגדנים שמושכים phagocytes כדי לעבור לאתר וליזום את תהליך של שריפת, מסלול מורכב מאוד ?...

הגוף שלנו מייצר 1-10 מיליארד תאי האפוטוטיים על בסיס יומי. מספר גדול של תאים אפוטוטיים חייב להיות מתנקה באופן שהתגובות החיסונית יישארו בשקט. כדי להבטיח את הסיווג של תאים האפוטוטיים בזמן, סוגים רבים של תאים תושב רקמות ותאים מחזורי לפתח מנגנונים לתאי האפוטוטיים מפרץ1. רגולציה מתפקדת של אפופטוזיס כבר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלות דלקתיות שונות החסינות האוטומטית2. אפופטוזיס גם משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של התפתחות הסרטן ההתנגדות הבאה שלה טיפולים קונבנציונליים3,4. הסרת תאים אפוטוטיים מקדמת בדרך כלל תגובה אנטי דלקתית, אשר עשויה להיות מקושרת לסובלנות החיסונית5. הפרעה של הסיווג תא האפוטוטיק כוננים חיסון עצמי תורמת לפיתוח של מחלות אוטואימוניות מערכתית בבני אדם ועכברים6.
כאשר התאים עוברים ואפופטוזיס, הם חושפים את הפוספלדיסרין (פטין) מתוך העלון הפנימי אל העלעל החיצוני של הקרום. לאחר מכן יהיה מזוהה על ידי phagocytes באמצעות קולטני פני השטח. למעלה מתריסר קולטנים זוהו לזהות ו/או להקל על הבזלת של תאים אפוטוטיים. באופן כללי, ישנם לפחות שלושה סוגים של קולטני פני השטח המעורבים בסיווג התא האפוטוטית: הקולטנים קולטני, לזהות תאים אפוטוטיים; לדגדג קולטנים, ליזום שתבלע; קולטנים למשגיחים, להקל על התהליך כולו7. שיטת הקולטן טאם (TAM RTKs) מורכבת מ- Tyro-3 , Xl, ו- Mer והם מבוטאים בעיקר על ידי תאים מיאלואידים של מערכת החיסון8. התפקיד העיקרי של TAM RTKs הוא לשמש קולטנים הקשירה, הקלה על הסרת phagocytic של תאים אפוטוטיים ופסולת. הקבוצה שלנו למדה את הסיווג של התאים טאם בתיווך במסגרת החסינות האוטומטית במשך שנים רבות. הגידול ויטמין K התלוי חלבון מעצר מסוים חלבון 6 (Gas6) וחלבון S (היתרונות) נקשר ומפעיל את קולטני טאם9,10. Gas6 מופק בלב, הכליות, והריאות. מקצוענים מיוצרים בעיקר בכבד11. TAM מזהה בתאים אפוטוטיים בצורה כזאת, כי N-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לפטין על תא האפוטוטיק ואת C-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לקולטני TAM המעוגן על פני השטח של phagocytes. יחד עם קולטני אחרים, הבזים של תאים אפוטוטיים מתרחש12. למרות Mer יכול לאגד הן מומחי ליגנדס ו Gas6, מצאנו כי Gas6 מופיע להיות ligands עבור מר בתיווך מקרופאג phagocyציטוזה של תאים אפוטוטיים, אשר ניתן לחסום על ידי נוגדן אנטי מאר13. מקרופאגים הם phagocytes מקצועי. סיווג מהיר של תאים אפוטוטיים על ידי מקרופאגים חשוב עיכוב של דלקת ותגובות אוטואימוניות נגד אנטיגנים תאיים. קולטן מר טירולך קינאז הוא קריטי עבור מקרופאג הבזים וסיווג יעיל של תאים אפוטוטיים14. בטחול העכבר, Mer מבטא בעיקר על אזור שולי מקרופאגים גוף מוחשי13.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה בסיסית כדי לגרום אפופטוזיס התא ולהפגין דרכים למדוד את התהליך ואת היעילות של efferocytosis. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות כדי ללמוד efferocytosis על ידי סוגי תאים אחרים בתוך שתבלע של תאים אפוטוטיים של מקורות שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

ואפופטוזיס תא הוא תהליך טבעי וממלא תפקיד קריטי בפיתוח עובריים, רגולציה הומסטטית, עמידות החיסונית אינדוקציה, ורזולוציה של דלקת. הצטברות של פסולת אפוטוטית בגוף עלולה לגרום לתגובות דלקתיות כרוניות המובילות מחלות אוטואימוניות מערכתית לאורך זמן. . מעורב במגוון מחלות אוטואימוניות סיווג האפוטוטיק הוא תהליך מורכב שנדיר לעתים רחוקות בתנאים פיזיולוגיים. זה כולל קולטני שטח שופע מולקולות איתות. לימוד התהליך של הסיווג התא האפוטוטיק מספק מנגנונים מולקולריים תובנה ותגובות ביולוגיות עוקבות, אשר עשוי להוביל לפיתוח של therapeutics חדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אינדוקציה של thymocytes האפוטוציטים, הכנת מקרופאגים הצפק, וניתוח של הסיווג התא האפוטוטיק על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ. כל התאים יעברו אפופטוזיס בשלב מסוים, ומגורים רבים במחזור התאים יכולים ספיגה של פסולת אפוטוטית. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין את כריכת התא האפוטוטית ובליעה של סוגים רבים של תאים אחרים.

ניתוח של מקרופאג הצפק-מתווך של האפוטוציטים. מקרופאגים הצפק ותאי האפוטוטיק היו מוכנים ושיתוף תרבותי כפי שמתואר בפרוטוקול. מקרופאגים היו מנותקים ומוכתמים עם הנוגדן PE anti-CD11b באוב עבור 20 דקות על הקרח. מקרופאגים נשטפו לאחר מכן ועובדו באמצעות ציטוטומטר זורם. כפי שנראה, אין CFSE חיובי מקר?...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

הגוף שלנו מייצר אחד עד 10 מיליארד תאים אפטוטיים בכל יום. הסיווג היעיל של תאים אלה מסייע בהסרת פסולת תאים ושמירה על מלאי. שיטה זו עשויה לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין איגוד תאים אפטוטיים בליעה על ידי סוגים רבים אחרים של תאים phagocytic.הדגמת הליך זה יהיה Yuxuan ג'ן, טכנאי בכיר במעבדה שלי. כדי לקצור thymocytes, לאחר פתיחת חלל החזה של עכבר C57 שחור נאיבי 6, להשתמש מלקעות קצה דק מעוקל לשלוף את התימוס. מניחים את האיבר לתוך צלחת תרבות רקמות המכיל 10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני.טוחנים את כל התימוס כנגד הקצוות הקפואים של שתי מגלשות מיקרוסקופ ומסננים את ההשעיה של הרקמה שנוצרת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר. לאסוף את thymocytes על ידי צנטריפוגה ולתלות את גלולה ב 40 מיליליטר. לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend עד פעמיים 10 לשמונה תאים ב 20 מיליליטר של PBS טרי לכל צינור 50 מיליליטר.סמן את התאים עם חמישה CFSE מיקרומולרי ב 20 מיליליטר של PBS לכל צינור. הפוך את הצינורות פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב לפני דגירה thymocytes במשך לא יותר משתי דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של חום מושבת סרום סוס ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.תן שימוש חוזר בתאים המסומנים ב-40 מיליליטר של PBS טרי לספירה וצנטריפוגה ואחריו שטיפה נוספת עם 40 מיליליטר של מדיום. לאחר שטיפה בינונית, להשתמש מחדש thymocytes ב 7 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של רקמות תרבות ריכוז בינוני וזרע את התאים בצלחת 100 מילימטר רקמה. לאחר מכן הוסיפו סטאורוספורין לתרבות התאים בריכוז סופי מיקרומולרי אחד וה מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות הרקמות במשך ארבע שעות.לבידוד מקרופאג צפק, הזריקו שני עכברים שחורים C57 6 תוך-אפית עם מיליליטר אחד של תיוגליקולאט בגיל 3% ביום אפס לפני פתיחת עור הבטן מבלי להפריע לפריטון ביום החמישי. כדי לשטוף את חלל הצפי, השתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט מד 18 לדחוף במהירות 10 מיליליטר של חיץ לשטוף לתוך החלל לפני שאיפה איטית את מאגר לשטוף לאוסף לתוך צינור 50 מיליליטר. לשטוף את שטיפת צבד פעמיים עם PBS.תן שימוש חוזר במאקרופאגים צפי פעמיים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני של תרבות הרקמות. הזרע הבא 500 microliters של מקרופאגים לתוך כל באר של צלחת 24 גם למקם את הצלחת באינקובטור תרבות רקמות במשך שעתיים. בסוף הדגירה, שאפו את העל-טבעי כדי להסיר את התאים הצפים ולהוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיום של תרבות רקמות לכל באר.מיד להוסיף אפס ל 12 פעמים 10 לשישה thymocytes ב 500 microliters של בינוני לכל באר של התרבות ולמקום את הצלחת באינקובטור תרבות הרקמה במשך ארבע שעות. בסוף הדגירה, לשטוף כל טוב פעמיים עם PBS טרי כדי להסיר את כל התאים apoptotic צף חינם ואחריו לשטוף אחד עם חיץ כתמים. לאחר מכן תייג את המקרופאגים הקשורים לצלחת עם 200 מיקרוליטרים של מאגר כתמים בתוספת נוגדן אנטי-CD11b מתאים ל הבאר והצב את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.בניסוי מייצג זה, עד 30% מהמקרופאגים התיוגליקולטים הממריצים את ה- peritoneal הפגינו איתות חיובי בערוץ CFSE המציין כי phagocytes אלה בלעו תאים אפופוטוטיים המסומנו על ידי CFSE. תצפית מיקרוסקופית של אפילוף מקרופאג של תאים אפופטיים חיונית לחקירת היכולת של מקרופאגים לבלוע תאים אפטוטיים כמו מקרופאגים חיוביים CFSE פרושים ברביע הימני התחתון בשל התעצמויות שונות המציין כי מספר תאים apoptotic בתוך מקרופאגים בודדים שונה. יחס גבוה יותר של תאים אפופטיים למאקרופגים לא רק מגדיל את מספר המקרופגים הנבלעים תאים אפופטיים, אלא גם משפר את היכולת של המקרופגים לבלוע יותר תאים אפופטיים.בסדרה אחרת של ניסויים, כ -15% מהמקרופאג'ים הפכו לחיוביים CFSE כאשר CFSE שכותרתו thymocytes apoptotic נוספו לתרבות המקרופאז 'במשך ארבע שעות המציין כי מקרופאגים אלה היו מקרופאגים phagocytic. הנוגדן Mer חוסם את יעילות המקרופאגים באופן תלוי מינון והחסימה הכוללת עשויה להיות אחראית ל-30% מיעילות היעילות של היעילות בסביבה הנוכחית. בנוסף, מעכב קולטן TAM שאושר לאחרונה מחליט את יעילות המקרופאז' באופן תלוי מינון עד לריכוז של כ -100 ננומולרים.זכור תמיד לבדוק את אחוז התאים apoptotic כמו מספר זה משפיע ישירות על היעילות של efferocytosis. מקרופאגים phagocytic ניתן לנתח עוד יותר על ידי כתם מערבי כדי לחקור את מולקולות איתות מוסדר על ידי תהליך אפילציה על ידי מיקרוסקופיה כדי לחקור את הדינמיקה של אפילציה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...