Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
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La ricerca nel laboratorio di Shao è supportata da Research premio innovativo dal Collegio di medicina e il premio Junior facoltà pilota del dipartimento di medicina interna, Università di Cincinnati e Grant DK K01_095067 da NIDDK/NIH.

I topi sperimentali sono stati allevati e mantenuti nella nostra colonia di topi. Tutti i lavori sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Cincinnati.
1. preparazione di CFSE etichettati timociti apoptotici
<ol><li>Euthanize due topi C57/B6 naïve di CO2 inalazione per 10 min e sezionare per aprire la cavità toracica, rimuovere (estrarre) il timo con pinze curve fine-Tip nella ...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

L'apoptosi è un processo di morte cellulare altamente conservato che coinvolge molte cascate di segnale e induce l'espressione proteica, la secrezione e il trasporto. L'apoptosi è spesso associata a cambiamenti della morfologia cellulare17. Le cellule apoptotiche rilasciano attivamente citochines e chemokine che attraggono i fagociti per migrare al sito e avviare il processo di engulfment, un percorso estremamente complesso sotto stretto controllo18. Dall'altro lato, la m...

Il nostro corpo genera 1-10 miliardi di cellule apoptotiche su base giornaliera. Tale numero elevato di cellule apoptotiche deve essere cancellato in modo che le risposte immunitarie rimangano quiescenti. Per garantire la clearance delle cellule apoptotiche in modo tempestivo, numerosi tipi di cellule residenti tessuto e cellule circolanti sviluppano meccanismi per inghiottire le cellule apoptotiche1. La regolazione disfunzionale dell'apoptosi è stata implicata nell'insorgenza e nella progressione di varie malattie infiammatorie e autoimmunità2. L'apoptosi svolge anche un ruolo critico nella patogenesi dello sviluppo del cancro e la sua conseguente resistenza ai trattamenti convenzionali3,4. La rimozione delle cellule apoptotiche generalmente promuove una risposta antinfiammatoria, che può essere legata alla tolleranza immunologica5. La violazione della clearance delle cellule apoptotiche spinge l'auto-immunizzazione e contribuisce allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche sia negli esseri umani che nei topi6.
Quando le cellule subiscono l'apoptosi, espongono la fosfatidilserina (PtdSer) dall'opuscolo interno al foglietto esterno della membrana. PtdSer sarà quindi riconosciuto dai fagociti attraverso i recettori superficiali. Oltre una dozzina di recettori sono stati identificati per riconoscere e/o facilitare l'fiamme di cellule apoptotiche. In generale, ci sono almeno tre tipi di recettori superficiali coinvolti nella clearance delle cellule apoptotiche: recettori tethering, riconoscono le cellule apoptotiche; solletico recettori, avviare engulfment; i recettori di da chaperon, facilitano l'intero processo7. Le tirosina chinasi del recettore TAM (RTK TAM) consistono in TYRO-3, AXL e Mer e sono espresse principalmente da cellule mieloidi del sistema immunitario8. La funzione primaria di TAM RTKs è quella di servire come recettori tethering, facilitando la rimozione fagocitica di cellule apoptotiche e detriti. Il nostro gruppo ha studiato la clearance della cellula apoptotica mediata da TAM nell'impostazione dell'autoimmunità per molti anni. La proteina K-dipendente dall'arresto della crescita proteica specifica 6 (Gas6) e proteina S (Pro) si lega e attiva i recettori Tam9,10. Gas6 è prodotto nel cuore, nei reni e nei polmoni. Pro è prodotto principalmente nel fegato11. TAM riconosce le cellule apoptotiche in modo tale che il N-terminale di Gas6/ProS si lega al PtdSer su una cellula apoptotica e il C-terminal di Gas6/ProS si lega ai recettori TAM che ancorati sulla superficie dei fagociti. Insieme con gli altri recettori, fiamme di cellule apoptotiche si verifica12. Anche se Mer può legarsi sia ai ligandi Pro e Gas6, abbiamo scoperto che Gas6 sembra essere l'unico ligando per la fagocitosi di macrofage mediata da Mer di cellule apoptotiche, che può essere bloccata dall'anticorpo anti-Mer13. I macrofagi sono fagociti professionali. La clearance rapida delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi è importante per l'inibizione dell'infiammazione e delle risposte autoimmuni contro gli antigeni intracellulari. La tirosina chinasi del recettore del Mer è critica per l'fiamme macrofage e la clearance efficiente delle cellule apoptotiche14. Nella milza del topo, Mer si esprime principalmente sulla zona marginale e sui macrofagi corporei tangibili13.
Il protocollo presentato qui descrive un metodo di base per indurre l'apoptosi cellulare e dimostrare modi per misurare il processo e l'efficienza dell'efferocitosi. Questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare l'efferocitosi da altri tipi di cellule in fiamme di cellule apoptotiche di diverse origini.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

L'apoptosi cellulare è un processo naturale e svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale, nella regolazione omeostatica, nell'induzione della tolleranza immunitaria e nella risoluzione dell'infiammazione. L'accumulo di detriti apoptotici nel corpo può innescare risposte infiammatorie croniche che portano a malattie immunitarie sistemiche nel tempo. Alterata clearance delle cellule apoptotiche è stata implicata in una varietà di malattie autoimmuni. La clearance apoptotica è un processo complesso raramente rilevato in condizioni fisiologiche. Si tratta di abbondanti recettori superficiali e molecole di segnalazione. Studiando il processo di clearance delle cellule apoptotiche fornisce meccanismi molecolari penetranti e successive risposte biologiche, che possono portare allo sviluppo di nuove terapie. Qui, descriviamo i protocolli per l'induzione di thymocytes apoptotici, la preparazione di macrofagi peritoneali, e l'analisi della clearance delle cellule apoptotiche da citometria di flusso e microscopia. Tutte le cellule subiscono l'apoptosi in un certo stadio, e molte cellule residenziali e circolanti possono captazione di detriti apoptotici. Pertanto, il protocollo qui descritto può essere utilizzato in molte applicazioni per caratterizzare l'associazione di cellule apoptotiche e l'ingestione da molti altri tipi di cellule.

Analisi dell'fiamme peritoneale del macrofago mediato di thymocytes apoptotici. I macrofagi peritoneali e le cellule apoptotiche sono state preparate e co-coltivate come descritto nel protocollo. I macrofagi sono stati staccati e macchiati con l'anticorpo anti-CD11b di PE coniugato per 20 minuti sul ghiaccio. I macrofagi sono stati poi lavati ed elaborati in un citometro a flusso. Come si è visto, non esiste un macrofago positivo CFSE nel quadrante in basso a destra quando non sono state aggiunte cellul...

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Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l'efficienza dell'efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un'ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Il nostro corpo genera da uno a 10 miliardi di cellule apoptotiche ogni giorno. L'efficiente clearance di queste cellule aiuta a rimuovere i detriti cellulari e a mantenere gli inventari. Questo metodo può essere usato in molte applicazioni per caratterizzare il legame e l'ingestione di cellule apoptotiche da molti altri tipi di cellule fagocitiche.A dimostrare questa procedura sarà Yuxuan Zhen, un tecnico senior nel mio laboratorio. Per raccogliere i timociti, dopo aver aperto la cavità toracica di un ingenuo topo C57 nero 6, utilizzare forcette curve a punta fine per estrarre il timo. Mettere l'organo in un piatto di coltura tissutale contenente 10 millilitri di RPMI 1640 Medium.Macinare l'intero timo contro le estremità smerigliate di due vetrini del microscopio e filtrare la sospensione tissutale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Raccogliere i timociti mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 40 millilitri. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e rimorsi fino a due volte 10 alle otto cellule in 20 millilitri di PBS fresco per tubo da 50 millilitri.Etichettare le celle con cinque CFSE micromolare in 20 millilitri di PBS per tubo. Invertire i tubi da due a tre volte per mescolare prima di incubare i timociti per non più di due minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, interrompere la reazione con 10 millilitri di siero di cavallo inattivato dal calore e raccogliere le cellule per centrifugazione.Resuspend le cellule etichettate in 40 millilitri di PBS fresco per il conteggio e la centrifugazione seguita da un lavaggio aggiuntivo con 40 millilitri di mezzo. Dopo il lavaggio medio, risosopendare i timociti a un sette per 10 alle sei cellule per millilitro della concentrazione media di coltura tissutale e seminare le cellule in un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri. Quindi aggiungere la staurosporina alla coltura cellulare a una concentrazione finale micromolare e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per quattro ore.Per l'isolamento macrofago peritoneale, iniettare due topi C57 neri 6 intraperitonealmente con un millilitro di tioglicollato invecchiato al 3% al giorno zero prima di aprire la pelle addominale senza disturbare il peritoneo il quinto giorno. Per lavare la cavità peritoneale, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per spingere rapidamente 10 millilitri di tampone di lavaggio nella cavità prima di aspirare lentamente il tampone di lavaggio per la raccolta in un tubo da 50 millilitri. Lavare la lavanda peritoneale due volte con PBS.Resospendare i macrofagi peritoneali a una concentrazione media di coltura tissutale due volte 10 a sei cellule per millilitro. Seme successivo 500 microlitri di macrofagi in ogni pozzo di una piastra di 24 pozza e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per due ore. Alla fine dell'incubazione, aspirare il supernatante a rimuovere le cellule galleggianti e aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura tissutale ad ogni pozzo.Aggiungere immediatamente zero a 12 per 10 ai sei timociti in 500 microlitri di mezzo ad ogni pozzo della coltura e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura tissutale per quattro ore. Al termine dell'incubazione, lavare ogni bene due volte con PBS fresco per rimuovere eventuali cellule apoptotiche galleggianti libere seguite da un singolo lavaggio con tampone di colorazione. Etichettare successivamente i macrofagi legati alla piastra con 200 microlitri di tampone di colorazione integrati con un anticorpo anti-CD11b appropriato per pozzo e posizionare la piastra a quattro gradi Celsius per 20 minuti.In questo esperimento rappresentativo, fino al 30% dei macrofagi peritoneali stimolati dal tioglicollato hanno dimostrato un segnale positivo nel canale CFSE che indica che questi fagociti avevano ingerito cellule apoptotiche etichettate CFSE. L'osservazione microscopica dell'inghiottimento di macrofagi delle cellule apoptotiche è essenziale per studiare la capacità dei macrofagi di ingerire cellule apoptotiche come macrofagi positivi CFSE sparsi nel quadrante in basso a destra a causa di diverse intensità che indicano che il numero di cellule apoptotiche all'interno dei singoli macrofagi è diverso. Un rapporto più elevato tra cellule apoptotiche e macrofagi non solo aumenta il numero di macrofagi che ingeriscono cellule apoptotiche, ma migliora anche la capacità dei macrofagi di ingerire cellule più apoptotiche.In un'altra serie di esperimenti, circa il 15% dei macrofagi divenne positivo al CFSE quando il CFSE etichettato timociti apoptotici fu aggiunto alla coltura del macrofago per quattro ore indicando che questi macrofagi erano i macrofagi fagocitici. L'anticorpo Mer blocca l'efferocitosi macrofagia in modo dose-dipendente e il blocco complessivo può rappresentare circa il 30% dell'efficienza dell'efferocitosi nell'ambiente attuale. Inoltre, un inibitore del recettore TAM appena approvato attenua l'efferocitosi del macrofago in modo dose-dipendente fino a una concentrazione di circa 100 nanomolare.Ricorda sempre di controllare la percentuale di cellule apoptotiche poiché questo numero influisce direttamente sull'efficienza dell'efferocitosi. I macrofagi fagocitici possono essere ulteriormente analizzati dalla macchia occidentale per indagare le molecole di segnalazione regolate dal processo di inghiottimento e dalla microscopia per studiare la dinamica dell'inghiottimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l&#39;infiammazione allergica delle vie aeree

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

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