Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

シャオ・ラボの研究は、医学部からの革新的な賞と、シンシナティ大学の内部医学部門からの若手教員パイロット賞と NIDDK/NIH からのグラント DK K01_095067 によって支えられています。

実験マウスを、我々のマウスコロニーにおいて飼育および維持した。すべての動物の仕事は、シンシナティ大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) のガイドラインに従って行われました。
1. CFSE 標識されたアポトーシス胸腺細胞の調製
<ol><li>Euthanize を10分間吸入して 2つのナイーブ C57/B6 マウスを解剖し、胸腔を開いて、湾曲した微細先端鉗子を有する胸腺を ...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

アポトーシスは、多くのシグナルカスケードを含み、タンパク質の発現、分泌、および輸送を誘導する高度に保存された細胞死プロセスです。アポトーシスは、しばしば細胞形態変化17に関連する。アポトーシス細胞は、食細胞を誘引するサイトカインおよびケモカインを積極的に放出し、貪食のプロセスを開始し、タイトコントロール18の下で非常に複雑...

私たちの体は、毎日1-10 のアポトーシス細胞を生成します。このような多数のアポトーシス細胞は、免疫応答が静止したままである方法でクリアされなければならない。アポトーシス細胞のクリアランスを適時に確保するために、多数の種類の組織の居住細胞および循環細胞がアポトーシス細胞1を巻き込むメカニズムを開発する。アポトーシスの機能不全調節は、様々な炎症性疾患および自己免疫2の発症および進行に関与している。アポトーシスはまた、癌の発症の病因および従来の治療法3,4に対するその後の耐性において重要な役割を果たす。アポトーシス細胞の除去は、一般に抗炎症反応を促進し、これは免疫学的許容寛容に結合し得る5。アポトーシス細胞クリアランスの障害は、自己免疫を促進し、ヒトおよびマウス6の両方における全身性自己免疫疾患の発症に寄与する。
細胞がアポトーシスを受けると、それらは内部リーフレットから膜の外側リーフレットにホスファチジルセリン (PtdSer) を暴露する。PtdSer は、その後、表面受容体を介して食細胞によって認識されるであろう。1ダース以上の受容体がアポトーシス細胞の貪食を認識および/または促進することが同定されている。一般に、アポトーシス細胞クリアランスには少なくとも3種類の表面受容体が関与する: テザリング受容体は、アポトーシス細胞を認識する。貪食のくすぐり, 開始します。chaperoning 受容体は、全体のプロセス7を促進する。TAM 受容体チロシンキナーゼ (TAM RTKs) は、 Tyro-3、 xl、およびMer から成り、主に免疫系8の骨髄細胞によって発現される。TAM RTKs の主な機能は、テザリング受容体としての役割を果たし、アポトーシス細胞や破片の貪食除去を促進することです。当社グループは、長年にわたり自己免疫の設定において、TAM 媒介性アポトーシス細胞クリアランスを研究してきました。ビタミン K 依存性タンパク質成長停止特異的タンパク質 6 (Gas6) およびプロテイン S (ProS) は、TAM 受容体9,10に結合し、活性化する。Gas6 は、心臓、腎臓、および肺で生成されます。長所は主に肝臓11で生産される。TAM は、Gas6/ProS の N 末端がアポトーシス細胞上の PtdSer に結合するような方法でアポトーシス細胞を認識し、Gas6/プロの C 末端は食細胞の表面に固定された TAM 受容体に結合します。他の受容体と共に、アポトーシス細胞の貪食が12に生じる。Mer はリガンドの長所と Gas6 の両方に結合することができますが、Gas6 は、抗 Mer 抗体13によってブロックすることができる、アポトーシス細胞の mer 媒介マクロファージ食のための唯一のリガンドであると思われることがわかりました。マクロファージはプロの食細胞です。マクロファージによるアポトーシス細胞の迅速なクリアランスは、細胞内抗原に対する炎症や自己免疫反応の阻害にとって重要である。Mer 受容体チロシンキナーゼは、マクロファージ貪食およびアポトーシス細胞14の効率的なクリアランスにとって重要である。マウス脾臓では、Mer は主にマージナルゾーンおよび有形の体マクロファージ13上に発現する。
ここで提示されるプロトコルは、細胞のアポトーシスを誘導し、プロセスと efferocytosis の効率を測定する方法を示すための基本的な方法を説明しています。これらのプロトコールは、異なる起源のアポトーシス細胞の貪食における他の細胞型による efferocytosis の研究に容易に適応することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

細胞のアポトーシスは自然なプロセスであり、胚発育、恒常性調節、免疫寛容誘導、および炎症の解決において重要な役割を果たします。体内のアポトーシス破片の蓄積は、時間をかけて全身性自己免疫疾患につながる慢性炎症反応を引き起こす可能性があります。アポトーシス細胞の障害は、様々な自己免疫疾患に関与している。アポトーシスクリアランスは、生理的条件下で稀に検出される複雑なプロセスである。それは豊富な表面受容体とシグナル分子を含みます。アポトーシス細胞クリアランスの過程を研究することは、洞察力のある分子メカニズムとその後の生物学的反応をもたらし、新しい治療法の開発につながる可能性があります。ここでは、アポトーシス胸腺細胞の誘導に関するプロトコール、腹膜マクロファージの調製、およびフローサイトメトリーおよび顕微鏡法によるアポトーシス細胞クリアランスの解析について説明します。すべての細胞は特定の段階でアポトーシスを受け、多くの住宅および循環細胞はアポトーシスの破片を吸収することができます。したがって、ここで説明するプロトコルは、多くのアプリケーションで、アポトーシス細胞の結合および他の多くの細胞型による摂取を特徴付けるために使用することができる。

腹膜マクロファージを媒介とするアポトーシス胸腺細胞の貪食の解析腹膜マクロファージおよびアポトーシス細胞を調製し、プロトコールで説明したように共培養した。マクロファージを、氷上で20分間にわたって PE 共役抗 CD11b 抗体で剥離および染色した。その後、マクロファージをフローサイトメーターで洗浄・処理した。見られるように、アポトーシス細胞が培養物に加え?...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis の効率および特異的阻害剤媒介性貪食のアポトーシス胸腺細胞のブロッキングを分析する。このプロトコルは、人工ビーズおよび細菌を含む他の粒子の細胞媒介性クリアランスにおいて広範な適用を有する。

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

私たちの体は毎日1〜100億個のアポトーシス細胞を生成します。これらの細胞の効率的なクリアランスは、細胞の破片を除去し、在庫を維持するのに役立ちます。この方法は、多くのアプリケーションにおいて、他の多くの貪食細胞タイプによるアポトーシス細胞結合および摂取を特徴付けるために用いることができる。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の上級技術者であるユクサン・ジェンです。胸腺細胞を収穫するには、ナイーブC57ブラック6マウスの胸腔を開いた後、曲面した細かい先端鉗子を使用して胸腺を引き出す。10ミリリットルのRPMI培地を含む組織培養皿に臓器を入れます。2つの顕微鏡スライドの曇った端に対して胸腺全体を粉砕し、得られた組織懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにフィルター処理します。遠心分離によって胸腺細胞を収集し、40ミリリットルでペレットを再中断します。カウント後、再び遠心分離し、50ミリリットルチューブあたり新鮮なPBSの20ミリリットルで8細胞に最大2倍10倍まで再懸濁する。細胞に、チューブあたりPBSの20ミリリットルで5ミクロモルCFSEをラベル付けします。チューブを2〜3回反転させ、胸腺細胞を光から保護された室温で2分以下にインキュベートする前に混合します。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルの加熱不活化馬血清で反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。標識された細胞を40ミリリットルの新鮮なPBSで再中断し、その後40ミリリットルの培地で追加の洗浄を行う。培地洗浄後、胸腺細胞を7倍10回にして、培養培地濃度のミリリットル当たり6細胞に再懸濁し、100ミリの組織培養皿に細胞を播種する。次に、1つのマイクロモル最終濃度で細胞培養にスタウロスポリンを加え、4時間組織培養インキュベーターにプレートを入れます。腹膜マクロファージ分離の場合、5日目に腹膜を乱すことなく腹部皮膚を開く前に、ゼロ日目に3%熟成チオグリコール酸の1ミリリットルで腹腔内に2つのC57黒6マウスを注入する。腹腔を洗い流すために、18ゲージ針を装備した10ミリリットルのシリンジを使用して、10ミリリットルの洗浄バッファーを空洞に素早く押し込み、50ミリリットルのチューブに回収するための洗浄バッファーをゆっくりと吸引します。腹膜洗浄をPBSで2回洗います。腹膜マクロファージを、組織培養培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に対して2倍10回で再懸濁する。次の種子500マイクロリットルのマクロファージを24ウェルプレートの各ウェルに入れ、2時間組織培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりに、上清を吸引して浮遊細胞を除去し、各ウェルに500マイクロリットルの組織培養培地を加える。培養物の各ウェルに500マイクロリットルの培地で6回の胸腺細胞に直ちに0〜12倍10を加え、4時間組織培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSでそれぞれをよく2回洗い、フリーの浮遊アポトーシス細胞を取り除き、続いて染色バッファーで1回洗浄します。次に、プレート結合マクロファージに、十分に適した抗CD11b抗体を補った200マイクロリットルの染色バッファーで標識し、プレートを摂氏4度で20分間置きます。本代表的な実験では、チオグリコール酸刺激性腹膜マクロファージの最大30%が、これらの食細胞がCFSE標識アポトーシス細胞を摂取したことを示すCFSEチャネルで陽性シグナルを示した。アポトーシス細胞のマクロファージ巻き込みの顕微鏡観察は、個々のマクロファージ内のアポトーシス細胞の数が異なることを示す異なる強度のために、CFSE陽性マクロファージが右下象限に広がるにつれて、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの能力を調べるために不可欠である。マクロファージに対するアポトーシス細胞の比率が高くなると、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの数が増えるだけでなく、より多くのアポトーシス細胞を摂取するマクロファージの能力も高まります。別の実験では、CFSE標識アポトーシス胸腺細胞がマクロファージ培養物に4時間添加されたときに、マクロファージの約15%がCFSE陽性となった。Mer抗体は用量依存的にマクロファージ・エフェロサイトーシスをブロックし、全体的な閉塞は現在の設定におけるefferocytosis効率の約30%を占める可能性がある。さらに、新たに承認されたTAM受容体阻害剤は、約100ナノモル濃度までの用量依存的な方法でマクロファージ・エフェロサイトーシスを減衰させる。この数は、直接エフェロサイトスの効率に影響を与えるとして、常にアポトーシス細胞の割合を確認することを忘れないでください.食細胞性マクロファージは、ウエスタンブロットによってさらに分析され、巻き込みプロセスによって調節されるシグナル伝達分子を調べ、巻き込みのダイナミクスを研究するための顕微鏡検査によって分析することができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...