Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
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La investigación en el laboratorio de Shao es apoyada por la investigación de premio innovador de la Facultad de medicina y el Premio de piloto de la Facultad Junior del Departamento de medicina interna, Universidad de Cincinnati y Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Ratones experimentales fueron criados y mantenidos en nuestra colonia de ratones. Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con las pautas del Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati.
1. preparación de los timocitos apopónticos etiquetados como CFSE
<ol><li>Eutanasia dos ratones C57/B6 ingenuos por inhalación de CO2 durante 10 min y diseccionar para abrir la cavidad torácica, remover (extraer) el timo con fórcep...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. 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H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

La apoptosis es un proceso de muerte celular altamente conservado que involucra muchas cascadas de señal e induce la expresión de proteínas, secreción, y el transporte. La apoptosis se asocia a menudo con los cambios de morfología celular17. Las células apopónticas liberan activamente citocinas y quimioquinas que atraen a los fagocitos para emigrar al sitio e iniciar el proceso de engulfment, una vía extremadamente compleja bajo control estricto18. Por otro lado, la...

Nuestro cuerpo genera 1-10 mil millones de células apopónticas sobre una base diaria. Se debe borrar un número tan grande de células apopónticas de manera que las respuestas inmunitarias permanezcan en reposo. Para asegurar el aclaramiento de las células apopónticas de manera oportuna, numerosos tipos de células residentes de tejido y células circulantes desarrollan mecanismos para engullir las células apopónticas1. Regulación disfuncional de la apoptosis se ha implicado en la aparición y progresión de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunidad2. La apoptosis también desempeña un papel crítico en la patogénesis del desarrollo del cáncer y su posterior resistencia a los tratamientos convencionales3,4. La eliminación de las células apopónticas generalmente promueve una respuesta antiinflamatoria, que puede estar relacionada con la tolerancia inmunológica5. La alteración del aclaramiento de las células apopónticas impulsa la autoinmunización y contribuye al desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas tanto en humanos como en ratones6.
Cuando las células se someten a la apoptosis, exponen la fosfatidilserina (PtdSer) desde el prospecto interno hasta el prospecto externo de la membrana. El PtdSer será reconocido por los fagocitos a través de los receptores de la superficie. Se han identificado más de una docena de receptores para reconocer y/o facilitar el internalización de las células apopónticas. En general, hay al menos tres tipos de receptores de superficie implicados en el aclaramiento de la célula apopóntica: receptores tethering, reconocer las células apopónticas; receptores de cosquillas, iniciar el engulfment; receptores de Chaperos, facilitan todo el proceso7. Los receptores de tirosina quinasas TAM (TAM RTKs) constan de Tyro-3, AXL y MER y se expresan principalmente por células mieloide del sistema inmunitario8. La función principal de TAM RTKs es servir como receptores de tethering, facilitando la eliminación fagocitaria de células apopónticas y escombros. Nuestro grupo ha estudiado el aclaramiento de células apopécticas mediadas en el entorno de autoinmunidad durante muchos años. El crecimiento proteico dependiente de la vitamina K, proteína específica 6 (Gas6) y proteína S (pros) se une y activa los receptores TAM9,10. Gas6 se produce en el corazón, los riñones y los pulmones. ProS se produce principalmente en el hígado11. TAM reconoce las células apopónticas de tal manera que la terminal N de Gas6/ProS se une al PtdSer en una célula apopéctica y el terminal C de Gas6/ProS se une a los receptores TAM que anclaron en la superficie de los fagocitos. Junto con los otros receptores, el internalización de las células apopónticas se produce12. Aunque Mer puede unirse a los ligandos ProS y Gas6, descubrimos que Gas6 parece ser el ligando único para la fagocitosis de macrófagos mediada por Mer de las células apopónticas, que pueden ser bloqueadas por el anticuerpo anti-Mer13. Los macrófagos son fagocitos profesionales. El aclaramiento rápido de las células apopónticas por macrófagos es importante para la inhibición de la inflamación y las respuestas autoinmunes contra antígenos intracelulares. El receptor de la tirosina quinasa del Mer es crítico para el internalización del macrófago y el aclaramiento eficiente de las células apopónticas14. En el bazo del ratón, Mer expresa principalmente en la zona marginal y los macrófagos corporales tangibles13.
El protocolo presentado aquí describe un método básico para inducir la apoptosis celular y demostrar maneras de medir el proceso y la eficiencia de la efervocitosis. Estos protocolos pueden ser fácilmente adaptados para estudiar la efferocitosis por otros tipos de células en el internalización de las células apopónticas de diferentes orígenes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

La apoptosis celular es un proceso natural y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, la regulación homeostática, la inducción de la tolerancia inmune y la resolución de la inflamación. La acumulación de desechos apopónticos en el cuerpo puede desencadenar respuestas inflamatorias crónicas que conducen a enfermedades autoinmunes sistémicas con el tiempo. El aclaramiento de células apopónticas deterioradas se ha implicado en una variedad de enfermedades autoinmunes. El aclaramiento apopético es un proceso complejo que raramente se detecta en condiciones fisiológicas. Implica abundantes receptores de superficie y moléculas de señalización. El estudio del proceso de aclaramiento de la célula apopéctica proporciona mecanismos moleculares perspicaces y subsiguientes respuestas biológicas, que pueden conducir al desarrollo de nuevas terapias. Aquí describimos los protocolos para la inducción de los timocitos apopónticos, la preparación de los macrófagos peritoneales y el análisis del aclaramiento de las células apopónticas por citometría de flujo y microscopía. Todas las células se someten a la apoptosis en una cierta etapa, y muchas células residenciales y circulantes pueden captación de desechos apopético. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la Unión de la célula apopóntica y la ingestión por muchos otros tipos de células.

Análisis de la enfaración peritoneal de los timocitos apópticos por macrófagos. Los macrófagos y las células apopónticas peritoneal se prepararon y cocultivaron como se describe en el protocolo. Los macrófagos fueron separados y manchados con el anticuerpo anti-CD11b de PE conjugada durante 20 min en hielo. Los macrófagos fueron lavados y procesados en un CITOMETRO de flujo. Como se ve, no hay macrófago positivo de CFSE en el cuadrante inferior derecho cuando no se agregaron células apopóntic...

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Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Nuestro cuerpo genera de uno a 10 mil millones de células apoptóticas cada día. El aclaramiento eficiente de estas células ayuda a eliminar los desechos celulares y mantener los inventarios. Este método se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la unión de células apoptóticas y la ingesta por muchos otros tipos de células fagocíticas.Demostrar este procedimiento estará Yuxuan Zhen, un técnico superior en mi laboratorio. Para cosechar timocitos, después de abrir la cavidad torácica de un ingenuo ratón C57 negro 6, usa pinzas de punta fina curva para sacar el timo. Coloque el órgano en una placa de cultivo de tejido que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 Medio.Moler todo el timo contra los extremos esmerilados de dos diapositivas de microscopio y filtrar la suspensión de tejido resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Recoger los timocitos por centrifugación y resuspender el pellet en 40 mililitros. Después de contar, centrifugar las células de nuevo y resuspend hasta dos veces 10 a las ocho células en 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros.Etiquete las células con cinco cfSE micromolares en 20 mililitros de PBS por tubo. Invierta los tubos de dos a tres veces para mezclar antes de incubar los timocitos durante no más de dos minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, detener la reacción con 10 mililitros de suero de caballo inactivado por calor y recoger las células por centrifugación.Resuspender las células etiquetadas en 40 mililitros de PBS fresco para el conteo y centrifugación seguido de un lavado adicional con 40 mililitros de medio. Después del lavado medio, resuspender los timocitos a siete veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo de tejido y sembrar las células en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros. A continuación, añadir estaurosporina al cultivo celular en una concentración final de un micromolar y colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas.Para el aislamiento de macrófagos peritoneales, inyecte dos ratones C57 negros 6 por vía intraperitoneal con un mililitro de tiolitismo envejecido en el día cero antes de abrir la piel abdominal sin alterar el peritoneo en el día cinco. Para lavar la cavidad peritoneal, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para empujar rápidamente 10 mililitros de tampón de lavado en la cavidad antes de aspirar lentamente el tampón de lavado para su recolección en un tubo de 50 mililitros. Lave el lavado peritoneal dos veces con PBS.Resuspender los macrófagos peritoneales a dos veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo tisular. Próxima semilla 500 microlitros de macrófagos en cada pozo de una placa de 24 pozos y colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante dos horas. Al final de la incubación, aspirar el sobrenadante para eliminar las células flotantes y añadir 500 microlitros de medio de cultivo tisular a cada pocótulo.Añadir inmediatamente cero a 12 veces 10 a los seis timocitos en 500 microlitros de medio a cada pozo del cultivo y colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas. Al final de la incubación, lavar cada pozo dos veces con PBS fresco para eliminar cualquier célula apoptótica flotante libre seguido de un solo lavado con tampón de tinción. A continuación, etiquete los macrófagos unidos a la placa con 200 microlitros de tampón de tinción complementados con un anticuerpo anti-CD11b apropiado por pozo y coloque la placa a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.En este experimento representativo, hasta el 30% de los macrófagos peritoneales estimulados por tioglycollato demostraron una señal positiva en el canal CFSE que indicaba que estos fagocitos habían ingerido células apoptóticas etiquetadas por CFSE. La observación microscópica del engufato de macrófagos de las células apoptóticas es esencial para investigar la capacidad de los macrófagos para ingerir células apoptóticas como macrófagos positivos de CFSE repartidos en el cuadrante inferior derecho debido a diferentes intensidades que indican que el número de células apoptóticas dentro de los macrófagos individuales es diferente. Una mayor proporción de células apoptóticas a macrófagos no sólo aumenta el número de macrófagos que ingieren células apoptóticas, sino que también mejora la capacidad de los macrófagos para ingerir más células apoptóticas.En otro conjunto de experimentos, alrededor del 15% de los macrófagos se convirtieron en CFSE positivos cuando CFSE etiquetó timocitos apoptóticos se añadieron a la cultura de los macrófagos durante cuatro horas, lo que indica que estos macrófagos eran los macrófagos fagocíticos. El anticuerpo Mer bloquea la efferocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis y la obstrucción general puede representar alrededor del 30% de la eficiencia de la efferocitosis en el entorno actual. Además, un inhibidor del receptor TAM recientemente aprobado atenúa la efferocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis hasta una concentración de aproximadamente 100 nanomolares.Recuerde siempre comprobar el porcentaje de células apoptóticas, ya que este número afecta directamente a la eficiencia de la efferocitosis. Los macrófagos fagocíticos pueden ser analizados más a fondo por Western blot para investigar las moléculas de señalización reguladas por el proceso de engullimiento y por microscopía para estudiar la dinámica del engullimiento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Investigación

Inmunología e Infección

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