Name: experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Shao laboratuvarında yapılan araştırmalar, tıp fakültesinden araştırma yenilikçi Ödülü ve Iç tıp bölümü 'nden küçük fakülte pilot Ödülü, Cincinnati Üniversitesi ve NIDDK/NıH 'dan Grant DK K01_095067 tarafından desteklenmektedir.

Deneysel fareler, fareler kolonisinde yetiştirilen ve sürdürülür. Tüm hayvan çalışmaları, Cincinnati Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıERUC) yönergelerine göre yapılmıştır.
1. CFD etiketli apoptotik thymosit hazırlanması
<ol><li>İki naif C57/B6 fareler tarafından Co2 inhalasyon için 10 dakika ve göğüs boşluğu açmak için ortadan kaldırmak, çıkarmak (dışarı çekin) eğri ince uçlu forseps ile doku kültürü ...

<ol>
	<li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).</li><li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+death+and+lupus.">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).</li><li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research:+Where+do+we+stand.">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells.">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li><li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance.">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+TAM+receptors.">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).</li><li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative,+Gas6,+are+ligands+for+the+Tyro+3/Axl+family+of+receptor+tyrosine+kinases.">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li><li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptor+tyrosine+kinases:+biologic+functions,+signaling,+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer.">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li><li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors,+Gas6,+and+protein+S:+roles+in+inflammation+and+hemostasis.">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li><li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells.">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li><li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells.">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li><li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER.">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li><li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+(SLE)+in+C57BL/6+Mice.">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).</li><li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+tyro3,+axl,+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny.">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance:+progress+and+conundrums.">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li><li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+apoptosis.">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis.">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).</li><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes.">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li><li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocytes:+neutrophils+and+monocytes.">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li></ol>

Apoptozis birçok sinyal Cascades içeren ve protein ifadesi, salgılanması ve ulaşım indükler bir son derece uyumlu hücre ölüm sürecidir. Apoptozis genellikle hücresel morfoloji değişiklikleri ile ilişkilidir17. Apoptotik hücreler, site 'ye göç etmek için fagositler çeken sitokinleri ve kemokinlere aktif olarak serbest bırakır ve sıkı kontrol18' in altında son derece karmaşık bir yol olan alay sürecini başlatır. Öte yandan, necrotik hücre ölü...

Vücudumuzun günlük olarak 1-10 milyar apoptotik hücreler üretir. Apoptotik hücrelerin böyle çok sayıda bağışıklık tepkiler sessiz kalır bir şekilde temizlenmelidir. Apoptotik hücrelerin zamanında temizlenmesini sağlamak için, çok sayıda doku yerleşik hücresi ve dolaşım hücresi apoptotik hücreleri yutan mekanizmalar geliştirir1. Çeşitli enflamatuar hastalığın ve otoimmün2' nin başlangıcı ve progresyonunda apoptozin işlevsiz olarak düzenlenmesi ortaya çıkarılmıştır. Apoptosis Ayrıca kanser gelişiminin patogenezinde ve Konvansiyonel tedavilere karşı sonraki direncinde kritik bir rol oynamaktadır3,4. Apoptotik hücrelerin kaldırılması genellikle immünolojik tolerans5ile bağlantılı olabilecek bir anti-inflamatuar yanıtı teşvik eder. Apoptotik hücre boşluklarının bozulması kendi kendine immünizasyonu tahrik ediyor ve hem insanlar hem de fareler6' da sistemik otoimmün hastalıkların gelişmesine katkıda bulunur.
Hücreler apoptozis geçmesi, onlar fosfatidilserine maruz (PtdSer) membranın dış broşür için iç broşür. Ptdser daha sonra yüzey reseptörleri ile fagositler tarafından tanınacaktır. Bir düzine reseptörlerin üzerinde tanımak ve/veya apoptotik hücrelerin yutulma kolaylaştırmak için tespit edilmiştir. Genel olarak, apoptotik hücre boşlukunda yer alan en az üç tip yüzey reseptörü vardır: reseptörleri tethering, apoptotik hücreleri tanımak; gıdıklamalar reseptörleri, başlatmak engulfment; reseptörleri, tüm süreci kolaylaştırmak7. TAM reseptör Tirozin kinazlar (TAM RTKs) TYRO-3, AXL ve Mer oluşur ve öncelikle bağışıklık sisteminin miyeloid hücreleri tarafından ifade edilir8. TAM RTKs 'nin birincil fonksiyonu, apoptotik hücrelerin ve enkaz fagositik çıkarılması kolaylaştırarak, tethering reseptörleri olarak hizmet etmektir. Grubumuz yıllardır otoimmünite ortamında TAM aracılı apoptotik hücre boşluğu okudu. K vitamini bağımlı protein büyüme tutuklama spesifik protein 6 (Gas6) ve protein S (artıları) bağlar ve tam reseptörleri aktive9,10. Gas6 kalp, böbrek ve akciğerde üretilmektedir. Artılar ağırlıklı olarak karaciğerde üretilmektedir11. TAM apoptotik hücrelerin Gas6/ProS N-terminali apoptotik bir hücre üzerinde PtdSer bağlanır ve Gas6/ProS C-terminali fagositlerin yüzeyine demirlemiş TAM reseptörlerine bağlanır böyle bir şekilde tanır. Diğer reseptörlerle birlikte, apoptotik hücrelerin Yutulmaları12oluşur. Mer hem ligin artıları ve Gas6 bağlayabilirsiniz olsa da, biz Gas6 tek ligand olarak görünür olduğunu bulundu, bu anti-Mer antikor tarafından engellenmiş olabilir apoptotik hücrelerin Mer-aracılı makrophaj fagositoz13. Macrofajlar profesyonel phagocytes vardır. Apoptotik hücrelerin makrofajlar tarafından hızlı bir şekilde temizlenmesi, inflamasyonun inhibisyonu ve hücre içi antijenlere karşı otoimmün tepkiler için önemlidir. Mer reseptörü Tirozin kinaz, makrophaj Yutulmaları ve apoptotik hücrelerin etkili boşluğu için önemlidir14. Fare dalağında, Mer ağırlıklı olarak marjinal bölge ve somut vücut makrofajlar13ifade eder.
Burada sunulan protokol, hücre apoptozu ikna etmek ve süreci ve efferocytosis etkinliğini ölçmek için yollar göstermek için temel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokoller, farklı kökenlerin apoptotik hücrelerin yutulmasında diğer hücre türleri tarafından effersitoz çalışması için kolayca adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ack lysing buffer</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">A10492</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Annexin V/7-AAD</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">559763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Anti-Mer antibody</td>
			<td style="width:131px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">BAF591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CD11b-PE (clone M1/70)</td>
			<td style="width:131px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">CFSE</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">EDTA (0.5 mM)</td>
			<td style="width:131px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">352017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-552-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Horse Serum (Heat-inactivated)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">26050088</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L-5647</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 1% buffer in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PBS, 1x</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">RXDX-106</td>
			<td style="width:131px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:135px;">CEP-40783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Staurosprine (100mg)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP2541-100</td>
			<td style="width:275px;">Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Thioglycolate Medium Brewer Modified</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">243010</td>
			<td style="width:275px;">Prepare 3% thioglycolate buffer in 1&#180;PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental analysis of apoptotic thymocyte engulfment by macrophages

Hücre apoptozis doğal bir süreçtir ve embriyonik gelişim, homeostatik düzenleme, bağışıklık toleransı indüksiyon ve inflamasyonun çözünürlüğü önemli bir rol oynar. Vücutta apoptotik enkaz birikimi zaman içinde sistemik otoimmün hastalıklara yol açan kronik inflamatuar tepkiler tetikleyebilir. Engelli apoptotik hücre boşluğu, çeşitli otoimmün hastalıklarda karışmıştır. Apoptotik boşluk fizyolojik koşullarda nadiren algılanan karmaşık bir süreçtir. Bu bol yüzey reseptörleri ve sinyalizasyon molekülleri içerir. Apoptotik hücre boşluğu sürecini incelemek, yeni terapilerinin gelişmesine yol açabilecek anlayışlı moleküler mekanizmalar ve sonraki biyolojik tepkiler sağlar. Burada, apoptotik tirositlerin indüksiyonu, periton makrofajların hazırlanması, ve osiyometri ve mikroskopi ile apoptotik hücre boşluğu analizi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm hücreler belirli bir aşamada apoptozis geçecek, ve birçok konut ve dolaşım hücreleri apoptotik enkaz alabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol birçok uygulamada apoptotik hücre bağlama ve diğer birçok hücre türleri tarafından yutulması karakterize etmek için kullanılabilir.

Apoptotik tirmositlerin periton makrophaj aracılı Yutulmaları analizi. Peritoneal makrofajlar ve apoptotik hücreler, protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış ve kültürlü bir şekilde hazırlanmıştır. Macrofajlar müstakil ve buz üzerinde 20 dakika boyunca PE konjuza Anti-CD11b antikor ile lekelenmiş. Makrofajlar sonra yıkanır ve bir akış cytometer işlenir. Görüldüğü gibi, kültürde hiçbir apoptotik hücre eklenmediği zaman sağ alt çeyreğinde CFSE pozitif makrophaj bulun...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages at JoVE.com

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Vücudumuz her gün 1 ila 10 milyar apoptotik hücre üretir. Bu hücrelerin verimli temizlenmesi hücre enkaz kaldırma ve stokların korunmasında yardımcı olur. Bu yöntem birçok uygulamada apoptotik hücre bağlanmasını ve diğer birçok fagositik hücre tipi tarafından yenmesini karakterize etmek için kullanılabilir.Bu prosedürü gösteren Yuxuan Zhen, benim laboratuvarda kıdemli bir teknisyen olacaktır. Timositleri hasat etmek için, saf bir C57 siyah 6 farenin göğüs boşluğunu açtıktan sonra, timusu çıkarmak için kavisli ince uçlu forceps kullanın. RPMI 1640 Orta 10 mililitre içeren bir doku kültür çanak içine organ yerleştirin.Tüm timusu iki mikroskop kaydırağının buzlu uçlarına karşı öğütün ve ortaya çıkan doku süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Santrifüj ile timositler toplamak ve 40 mililitre pelet resuspend. Sayma sonra, hücreleri tekrar santrifüj ve 50 mililitre tüp başına taze PBS 20 mililitre sekiz hücre ye kadar iki kez 10 kadar askıya.Hücreleri tüp başına 20 mililitre PBS cinsinden beş mikromolar CFSE ile etiketlayın. Tüpleri karıştırmak için 2-3 kez ters oda sıcaklığında ışıktan korunan en fazla iki dakika timositler kuluçkadan önce. Kuluçka sonunda, ısı inaktive at serum 10 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve santrifüj ile hücreleri toplamak.Sayım ve santrifüj için 40 mililitre taze PBS etiketli hücreleri yeniden askıya alın ve ardından 40 mililitre orta ile ilave bir yıkama. Orta yıkamadan sonra, doku kültürü orta konsantrasyon mililitre başına altı hücreye yedi kez 10 timositler resuspend ve 100 milimetre doku kültür çanak hücreleri tohum. Sonra bir mikromolar son konsantrasyonda hücre kültürüne staurosporine ekleyin ve dört saat boyunca bir doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin.Periton makrofaj izolasyonu için, iki C57 siyah 6 fareintraperitoneally bir mililitre ile enjekte 3% yaşlı tiyoglikololat gün sıfır da periton rahatsız etmeden önce karın deri açmadan önce beşinci gün. Periton boşluğunu temizlemek için, 18 gauge iğneile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak 10 mililitrelik yıkama tamponunu yavaşça 50 mililitrelik bir tüpe toplama için azarlamadan önce boşluğa doğru hızla itin. Periton lavajını PBS ile iki kez yıkayın.Periton makrofajlarını iki kez 10'da doku kültürü orta konsantrasyonunun mililitresi başına altı hücreye yeniden askıya alın. Sonraki tohum 24 kuyu plaka her kuyuiçine makrofajlar 500 mikrolitre ve iki saat boyunca bir doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka sonunda, yüzen hücreleri kaldırmak ve her kuyuya doku kültürü orta 500 mikrolitre eklemek için supernatant aspire.Kültürün her kuyusuna 500 mikrolitre orta daki altı timosite 12 çarpı 10'a hemen sıfır ekleyin ve plakayı dört saat boyunca doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Kuluçka sonunda, herhangi bir serbest yüzen apoptotik hücreleri ve ardından boyama tampon ile tek bir yıkama kaldırmak için taze PBS ile her iki kez yıkayın. Sonraki etiket iyi başına uygun bir anti-CD11b antikor ile desteklenen boyama tampon 200 mikrolitre ile plaka bağlı makrofajlar ve 20 dakika boyunca dört derece santigrat plaka yerleştirin.Bu temsili deneyde, tiyoglikolat uyarılmış periton makrofajlarının %30'a kadarı CFSE kanalında bu fagositlerin CFSE etiketli apoptotik hücreleri yutturduklarına dair olumlu bir sinyal göstermiştir. Cfse pozitif makrofajlar farklı yoğunluklara bağlı olarak sağ alt kadranda yayıldığı için apoptotik hücrelerin makrofaj yutma makrofajlarının mikroskobik gözlemi, tek tek makrofajlar içindeki apoptotik hücre sayısının farklı olduğunu gösterir. Apoptotik hücrelerin makrofajlara oranı nın artması sadece apoptotik hücreleri sindiren makrofajların sayısını artırmakla kalmamış, aynı zamanda makrofajların daha apoptotik hücreleri yutma yeteneğini de arttırır.Başka bir deney setinde, CFSE etiketli apoptotik timositler makrofaj kültürüne dört saat eklendiğinde bu makrofajların fagositik makrofajlar olduğunu gösteren makrofajların yaklaşık %15'i CFSE pozitif hale gelmiştir. Mer antikor, makrofaj eferositozisindoza bağlı bir şekilde bloke edilmesive genel tıkanıklık mevcut ortamda eferositoz veriminin yaklaşık %30'una neden olabilir. Buna ek olarak, yeni onaylanmış TAM reseptör inhibitörü makrofaj eferositoz yaklaşık 100 nanomolar konsantrasyona kadar doza bağımlı bir şekilde zayıflatır.Bu sayı eferositozun verimliliğini doğrudan etkilediği için her zaman apoptotik hücrelerin yüzdesini kontrol etmeyi unutmayın. Fagositik makrofajlar, yutma işlemi yle düzenlenen sinyal moleküllerinin araştırılması için Batı lekeleri ve yutma dinamiklerini incelemek için mikroskobik tarafından daha fazla analiz edilebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Alerjik Havayolu Enflamasyon sırasındaki solunum Dendritik Hücre olgunlaşması ve Göç Analizi

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...