Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة R15CA169978 من المعاهد الوطنية للصحة. وجاء تمويل إضافي من جامعة فيلانوفا.

وقد أجريت جميع التجارب والأساليب على النحو الذي أذنت به لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانية التابعة لجامعة فيلانوفا.
1. التعبير الجيني في الخلايا السرطانية الثديية الماوس المثقف
<ol><li>أولاً، قم بإعداد خطوط الخلايا ليتم اختبارها.</li>
	<li>
استخدام مستعمرة تربية الف...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB/cV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus.">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li><li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB/cV+mice.">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

اختبار الغزو في المختبر هو طريقة غير مكلفة وسريعة وكمية ومباشرة لدراسة العوامل التي تشجع غزو الخلايا السرطانية. سرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا تشخيص بين النساء. من بين الأنواع الفرعية الرئيسية الثلاثة لسرطان الثدي، السلبية الثلاثية، (أو ER-، PR-، HER2 /neu-)، هو الأكثر عدوانية، والأكث?...

يمكن أن يكون فحص الغزو في المختبر أداة مفيدة عند قياس قدرة الخلية على الهجرة من خلال غشاء مغطى بالبروتين، مماثلة للخطوات الأولى في الانبثاث. ومن السمات الرئيسية للخلايا السرطانية الخبيثة قدرتها على الهجرة من خلال وغزو الأنسجة القريبة. السرطان الذي انتشر أو انتشر يطرح المزيد من التحديات العلاج ولديه معدلات أقل من البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، في حين أن الأورام الموضعية هي أسهل لعلاج ولها معدلات أعلى من البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. من أجل الانتشار ، يجب على الخلايا السرطانية ترك الورم الأساسي والهجرة إلى الدورة الدموية أو الجهاز اللمفاوي ، وهي عملية تتطلب المرور عبر المصفوفة خارج الخلية وغشاء الطابق السفلي1. في العملية التي تسمى الانتقال الظهاري mesenchymal (EMT)، يجب على الخلايا السرطانية كسر اتصالات الخلايا الخلوية، والهجرة باتجاه، وغزو الدم أو الأوعية الليمفاوية القريبة. الخطوات الأولية من هذا التسلسلة الانبثاث هي ذات أهمية كبيرة لأن هذه الخطوات هي ما يمكن أن تجعل السرطان أكثر فتكا. العوامل الوراثية والجينية التي تنطوي عليها الخطوات المبكرة من الانبثاث هي محور كمية كبيرة من البحوث، ولكن هناك حاجة إلى أدوات تجريبية دقيقة وموثوق بها لاختبار هذه الخطوات المبكرة في كل من الجسم الحي والمختبر.
أدوات لقياس التغيرات في هجرة الخلايا مثل التئام الجروح (خدش) الاختبارات أو النمو في بيئات 3D مثل اختبار أجار لينة يمكن أن تعالج جزئيا الحاجة إلى أساليب تجريبية لقياس الخطوات المبكرة من الانبثاث، ولكن الفحص لقياس الغزو هو أكثر تحديا منذ العملية تحدث في الجسم داخل بيئة الورم الدقيقة المعقدة. لأغراض فحص الأدوية أو التعديلات الجينية لتحديد العوامل الهامة في الغزو والانبثاث، وهو نظام يمكن استخدامه في المختبر مع الخلايا المستزرعة وتقليد التحديات التي تواجهها الخلايا النقيلية في الجسم الحي هو اختبار الغزو2، 3. سرطان الثدي هو النوع الأكثر شيوعا تشخيص السرطان في النساء والسبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في النساء، لذلك فهم الجينات المسؤولة عن غزو خلايا سرطان الثدي وورم خبيث أمر بالغ الأهمية للصحة العامة. وعلاوة على ذلك، خلايا الماوس هي نظام نموذج مفيد لدراسة سرطان الثدي وتطوره.
ويستند في المختبر في غزو الاختبار على الجمعية غرفة بويدن حيث يتم فصل غرفتين من وسائل الإعلام النمو بواسطة غشاء مسامية3. لتقليد البيئة الدقيقة الورم، يتم تضمين هلام غنية بالبروتين أيضا لفصل الخلايا في غرفة واحدة من chemoattractant في الآخر، والعمل كحاجز غشاء الطابق السفلي. من أجل الهجرة نحو chemoattractant ، يجب أن تمر الخلايا أولا من خلال الحاجز الغني بالبروتين ثم تمر عبر الغشاء المسامي - وهي عملية مماثلة لكيفية هجرة الخلايا النقيلية من خلال ستروما. يمكن تغيير الجل الغني بالبروتين بناء على احتياجات التجربة، ولكن عادة ما يتكون من الكولاجين، أو استخراج غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، Matrigel)4. وهو خليط معقد من البروتينات، بروتيوغليكانس وعوامل النمو، ولكن في الغالب يتكون من اللامينين والكولاجين الرابع 4،5. ثم يجب أن تمر الخلايا من خلال غشاء مسامية مصنوعة عادة من البولي كربونات، والبوليستر، أو البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE). يمكن شراء الأغشية تجاريا ً مع أو بدون جل بروتين (الكولاجين عادةً)، أو قد يتم شراء الجل بشكل منفصل وإضافته. يمكن تعديل حجم المسام على أساس حجم الخلية. في حين تتوفر أحجام المسام من 0.4 - 8.0 ميكرومتر، المسام فقط من 3.0 - 8.0 ميكرومتر كبيرة بما يكفي لهجرة الخلايا. وقد استخدم تقييم الغزو لتحديد فعالية مثبطات على قدرة الخلايا على الهجرة والغزو. في حين تفتقر إلى البيئة الدقيقة الورم الدقيق الموجود في الجسم الحي، فإن اختبار الغزو في المختبر مفيد في فحص العديد من الحالات في وقت قصير مع التقليل من الحاجة إلى نماذج حيوانية. والهدف من هذه التجارب هو مقارنة التعبير الجيني للمشتبه في أنه من الجينات وتحديد الآثار على سلوك الخلايا السرطانية وعدوانية المرض باستخدام اختبار الغزو في المختبر وغيرها من الاختبارات. وبشكل عام، يوفر اختبار الغزو نتائج متسقة وكمية وسريعة لتحديد الإمكانات النقيلية مع كونه أيضاً طريقة غير مكلفة نسبياً ومباشرة وقابلة للتكيف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

يستخدم فحص الغزو في المختبر مصفوفة غنية بالبروتين في غرفة Boyden لقياس قدرة الخلايا المستزرعة على المرور عبر المصفوفة وغشاء مسامي في عملية مماثلة للخطوات الأولية لورم الخلايا السرطانية. يمكن تغيير الخلايا المختبرة للتعبير الجيني أو معالجتها بمثبطات لاختبار التغيرات في إمكانية الغزو. تختبر هذه التجربة النمط الظاهري العدواني لخلايا الورم الثديي للماوس لاكتشاف وتوصيف الأنكوجينيات المحتملة التي تعزز غزو الخلايا. هذه التقنية، ومع ذلك، يمكن أن تكون متعددة الاستخدامات وتكييفها مع العديد من التطبيقات المختلفة. يمكن إجراء التجربة نفسها في يوم واحد ويتم الحصول على النتائج عن طريق الفحص المجهري الخفيف في أقل من يوم واحد. وتشمل النتائج عدد الخلايا الغازية للمقارنة والتحليل. اختبار الغزو في المختبر هو طريقة سريعة وغير مكلفة وواضحة لتحديد سلوك الخلايا في ثقافة التي يمكن استخدامها كتقييم أولي قبل أكثر مشاركة في الاختبارات الحية.

تم استخدام هذه الطريقة من الغزو في المختبر من خلال مصفوفة البروتين لتقييم الأنماط الظاهرية العدوانية وسلوكيات الخلايا الأنسيوجينية من الخلايا السرطانية الثديية الماوس مع تغيير التعبير عن بروتين إصبع الزنك ZC3H88. جنبا إلى جنب مع النهج الأخرى التي تدرس أيضا ه?...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior at JoVE.com

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

يتم استخدام اختبار غزو الخلايا في المختبر لقياس إمكانات الانبثاث السرطاني من خلال قياس الإمكانات الخلوية للغزو والهجرة باستخدام إدراج ثقافة الخلايا التي تحتوي على مصفوفة البروتين. يتم تحدي الخلايا للهجرة من خلال مصفوفة البروتين والغشاء المسامي، نحو جاذبية كيميائية، ومن ثم قياسها كميا عن طريق الفحص المجهري الخفيف.

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

هذا البروتوكول، مقايسة الغزو في المختبر، هو أداة مفيدة لقياس كمية الخلايا خطوط القدرة على الهجرة من خلال مصفوفة غنية بالبروتين والمرور من خلال غشاء مسامية، في عملية مماثلة للمراحل المبكرة من غزو الخلايا السرطانية. ويمكن تغيير هذه الخطوط الخلوية وراثياً من أجل التعبير عن جين أو تقليل التعبير عن جين من أجل تحديد ما إذا كان هذا الجين يلعب دوراً في هجرة الخلايا أو غزو الخلايا. العديد من أنواع السرطان العدوانية تنطوي على تغييرات جذرية في سلوك الخلايا، بما في ذلك زيادة الهجرة والغزو.لذا هذا الفحص في الغزو المختبري يمكن أن يسمح لنا بفهم الجينات والعوامل الأخرى التي تشارك في هذه العملية بشكل أفضل. لبدء هذا الإجراء، تنمو الخلايا السرطانية الماوس أتباع ماماري في قارورة T25 في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 100٪حتى تكون 70٪ إلى 90٪ التقاء لليوم الأول من التجربة. استرداد إدراج غرفة Boyden من التخزين ونقلها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية إلى الحارة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.استخدم ثلاثة إدراجات لإنشاء بيانات صالحة إحصائياً لكل خط خلية لكل تجربة. ثم إضافة 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام DMEM المصل الخالية من قبل إلى إدراج بحيث يتم ترطيب الغشاء المسامية وهلام على كلا الجانبين. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 100٪ لمدة ساعتين على الأقل.بعد ذلك، قم بإعداد الخلايا عن طريق إزالة وسائط النمو وشطف الخلايا بخمسة ملليلترات من HBSS. إزالة HBSS وإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين EDTA الحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى خمس دقائق أو حتى تظهر الخلايا مدورة أو تظهر علامات الانفصال.ثم اضغط بلطف على القارورة لفصل جميع الخلايا. إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر معقمة.الطرد المركزي الخلايا و1000 مرات ز لمدة خمس دقائق ل بيليه بلطف الخلايا. إزالة وسائل الإعلام وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من DMEM خالية من المصل. كرر عملية الطرد المركزي وإعادة تعليق مرتين إضافية لمجموع ثلاثة يغسل.بعد هذا، بدقة إعادة تعليق الخلايا في المليلتر الخمسة النهائي من DMEM خالية من المصل وضمان عدم وجود كتل من الخلايا. استخدم مقياس الهيموسيت لتحديد تركيز الخلية مع التأكد من عد الخلايا القابلة للحياة فقط. وتمييع تعليق الخلية إلى 50،000 خلية لكل ملليلتر في خمسة ملليلتر من DMEM خالية من المصل.بعد ذلك، قم بإزالة الطبق مع إدراج من الحاضنة، وتبخر بلطف وسائل الإعلام من إدراج. ارفعي إدراج الوسائط من البئر. العمل بسرعة، إضافة العلاج الكيميائي إلى الغرفة السفلى.وضع إدراج في البئر، ولطبق 24 جيدا، إضافة 500 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى إدراج. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء على جانبي الغشاء. إعادة الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 22 ساعة.بعد 22 ساعة، وإعداد حل من 1٪ شبه شكلي واحد وX برنامج تلفزيوني لتثبيت. في طبق ثقافة نظيف 24 خلية جيدا، إضافة ملليلتر واحد من المثبت إلى الآبار الفردية حتى لا يكون هناك بئر واحد لكل إدراج. ثم، وإعداد حل تلطيخ من البنفسج الكريستال 0.1٪ في حل من برنامج تلفزيوني مع الإيثانول 10٪.إضافة ملليلتر واحد من هذا الحل تلطيخ إلى بئر نظيفة لكل إدراج. باستخدام ملقط، إزالة كل إدراج واحد في وقت واحد. ضع مسحة قطنية معقمة داخل كل إدراج ومسحة الجانب العلوي من الغشاء لإزالة أي خلايا غير مشوشة.كرر هذه العملية مع مسحة القطن الثانية. بعد ذلك، قم بإزالة أي وسائط متبقية من داخل إدراج وإضافة 750 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لغسل أي خلايا منفصلة. إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار غسل مع برنامج تلفزيوني جديد.ثم ضع إدراج في إصلاح يحتوي على تثبيت لإصلاح الخلايا المهاجرة على الجانب السفلي من الغشاء. كرر هذه العملية لجميع إدراج والسماح للإدخال إصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إزالة كل إدراج واحد في وقت واحد من بئره وغسله مع 750 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.ضع إدراج في بئر تحتوي على حل تلطيخ وتركها لمدة 15 دقيقة لطخة جميع الخلايا التي تم ترحيلها وثابتة. ثم إزالة إدراج وتراجع لهم في منقار يحتوي على الماء المقطر حتى المياه التي تجري قبالة إدراج واضح. إزالة أي قطرات الماء الزائدة ووضع إدراج جانبية على قطعة من ورقة مرشح.اسمحوا إدراج الهواء الجاف. إعداد الغشاء للتصوير عن طريق وضع علامة على شريحة مجهر الزجاج نظيفة لكل إدراج، ووضع قطرة صغيرة من زيت الغمر المجهر في وسط كل شريحة. باستخدام مشرط، وقطع حول محيط الغشاء على داخل إدراج البلاستيك لفصل الغشاء.استخدام ملقط لإزالة الغشاء ووضعها على رأس قطرة النفط على الشريحة المسمى. باستخدام المجهر المركب، عرض الخلايا في خمس مرات، 10 مرات، أو 20 مرة التكبير. للحصول على القياس الكمي، يمكنك التقاط صور متعددة غير متداخلة عند التكبير 10 مرات.تحديد العدد الإجمالي للخلايا الغازية أو الخلايا في كل منطقة لجميع العينات. لكل تجربة، قم بتنفيذ كل شرط في المقايسة مع ثلاثة إدراجات مكررة وكرر عدة مرات للحصول على نتائج مفيدة إحصائياً. في هذه الدراسة، في المختبر الغزو من خلال مصفوفة البروتين يستخدم لتقييم الأنماط الظاهرية العدوانية في سلوكيات الخلايا oncogenics من الخلايا الماوس ماماري الخلايا السرطانية مع التعبير المتغيرة من البروتين إصبع الزنك، Zc3h8.وينظر إلى مستويات أعلى من التعبير Zc3h8 في خطوط الخلايا السرطانية أو عن طريق التعبير عن طريق المروج بوساطة من plasmid، مما أدى إلى معدلات سريعة لانتشار الخلايا، والهجرة السريعة، والنمو في بيئات 3D، وزيادة التعدي داخل مقايسة الغزو في المختبر. وعلى العكس من ذلك، فإن انخفاض التعبير عن طريق SHRNA يؤدي إلى انتشار أقل عدوانية والهجرة والغزو. في حين أن غزو الخلية يقلل على ضربة قاضية من التعبير Zc3h8، يتم إنقاذ هذا الغزو عندما يتم إنقاذ التعبير.تقنية فحص الغزو في المختبر مفيد للغاية لأنه نهج سريع وغير مكلف ومرنة وسهلة نسبيًا لدراسة سلوك الخلية. الخلايا التي تزرع في الثقافة من السهل التلاعب وراثيا. بل يمكن اختبارها للكشف عن طفرات محددة.كما يسمح نظام الغزو في المختبر لتحليل مثبطات الجزيئات الصغيرة وكذلك العوامل البيولوجية مثل RNAs الصغيرة لآثارها على هجرة الخلايا والغزو. هذا الفحص يشمل أيضا قدرا كبيرا من المرونة، والسماح لتغيير محتوى البروتين من المصفوفة، وحجم المسام وchemoattractant.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

في المختبر فحص الإضاءة الحيوية تميز إيقاع سيركاديان في الخلايا الظهارية الثديية

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

تحديد "معدل إخصاب البيض" من حيث دراسة استخدام "تقنية الخلوية الوراثية"

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

بروتوكول في المختبر لتقييم مستويات MicroRNA، وظائف، والجينات المستهدفة المرتبطة بها في الخلايا السرطانية

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

استخدام الأنسجة المجمدة في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...