Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
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这项工作得到了国家卫生研究院的R15CA169978资助。额外的资金来自维拉诺瓦大学。

所有实验和方法均经维拉诺瓦大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)授权进行。
1. 培养小鼠乳腺肿瘤细胞的基因表达
<ol><li>首先,准备要测试的细胞系。</li>
	<li>
使用BALB/cV小鼠的繁殖群。这些小鼠携带BALB/cV菌株的小鼠乳腺肿瘤病毒,在牛奶6,7中传播给小狗。50%的繁殖雌性在10个月大时出现乳腺肿瘤。
	<ol>
<li>要建立肿瘤?...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB/cV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus.">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li><li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB/cV+mice.">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

体外入侵测定是研究促进癌细胞入侵的因素的一种廉价、快速、定量和直接的方法。乳腺癌是妇女中最常见的癌症。在乳腺癌的三个主要亚型中,三阴性,(或ER,PR-,HER2/neu-),是最具有攻击性的,最有可能转移,也是最致命的9。因此,了解导致转移的基因和表达有助于找到新的治疗靶点和遗传标记。虽然许多对癌细胞入侵和转移重要的基因已经确定和特征,转移驱动因素与转移抑制?...

体外入侵测定在测量细胞通过蛋白质涂层膜迁移的能力时可能是一个有用的工具,类似于转移的第一步。恶性癌细胞的一个关键特征是它们能够通过附近的组织迁移和入侵。已经扩散或转移的癌症带来了更多的治疗挑战,并且长期存活率较低,而局部肿瘤更容易治疗,并且具有更高的长期存活率。为了转移,癌细胞必须离开原发性肿瘤,并迁移到循环或淋巴系统,这个过程需要通过细胞外基质和基底膜1。在称为上皮间质过渡(EMT)的过程中,肿瘤细胞必须打破细胞-细胞接触,定向迁移,并侵入附近的血液或淋巴血管。这个转移级联的初始步骤是极大的兴趣,因为这些步骤是什么可以使癌症更致命。转移早期步骤所涉及的遗传和表观遗传因素是大量研究的重点,但需要准确可靠的实验工具来测试这些早期步骤,包括体内和体外步骤。
测量细胞迁移变化的工具,如伤口愈合(划痕)测定或3D环境中的生长,如软琼脂测定,可以部分满足测量转移早期步骤的实验方法的需要,但测量入侵的测定是更具挑战性,因为这个过程发生在复杂的肿瘤微环境中的体内。为了筛选药物或基因改变,以确定入侵和转移中的重要因素,一个系统,可以在体外使用培养细胞和模拟转移细胞在体内面临的挑战是入侵测定2, 3.乳腺癌是女性最常诊断的癌症类型,也是女性癌症死亡的第二大原因,因此了解导致乳腺癌细胞入侵和转移的基因对公众健康至关重要。此外,小鼠细胞是研究乳腺癌及其进展的有用模型系统。
体外入侵测定基于博伊登室组件,其中两个生长培养层由多孔膜3分离。为了模仿肿瘤微环境,还包括一种富含蛋白质的凝胶,用于将一个腔室中的细胞与另一个腔室中的化学抑制剂分离,并作为基底膜屏障。为了向化学吸引剂迁移,细胞必须首先通过富含蛋白质的屏障,然后穿过多孔膜-这个过程类似于转移细胞如何通过频闪迁移的过程。富含蛋白质的凝胶可以根据实验的需要而改变,但通常由胶原蛋白或基底膜提取物(例如,Matrigel)4组成。它是蛋白质、蛋白酶和生长因子的复杂混合物,但主要由拉明宁和胶原蛋白IV 4,5组成。然后,细胞必须通过通常由聚碳酸酯、聚酯或聚四氟乙烯 (PTFE) 制成的多孔膜。膜可以商业购买,有或没有蛋白质凝胶(通常是胶原蛋白),或者凝胶可以单独购买和添加。孔径可以根据像元大小进行调整。虽然孔径为 0.4 - 8.0 μm,但只有 3.0 - 8.0 μm 的孔隙足够大,适合细胞迁移。入侵测定已用于确定抑制剂对细胞迁移和入侵能力的有效性。虽然缺乏体内存在的确切的肿瘤微环境,体外入侵检测有利于在短时间内筛选许多条件,同时最大限度地减少对动物模型的需求。这些实验的目的是比较疑似肿瘤的基因表达,并使用体外入侵测定和其他测试确定对癌细胞行为和疾病攻击性的影响。总体而言,入侵测定为确定转移电位提供了一致、定量和快速的结果,同时也是一种相对便宜、简单和适应性强的方法。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

体外入侵测定使用博伊登室中富含蛋白质的基质来测量培养细胞通过基质和多孔膜的能力,其过程类似于癌细胞转移的初始步骤。被测试的细胞可以改变基因表达,或用抑制剂处理,以测试入侵潜力的变化。该实验测试小鼠乳腺肿瘤细胞的侵略性表型,以发现和表征促进细胞入侵的潜在肿瘤基因。然而,这种技术是通用的,可以适用于许多不同的应用。实验本身可以在一天内完成,结果在不到一天内通过光显微镜获得。结果包括用于比较和分析的入侵细胞数计数。体外入侵测定是一种快速、廉价和清晰的方法,用于确定培养物中的细胞行为,在更多地参与体内检测之前可用作初始评估。

利用蛋白质基质进行体外入侵的方法,用锌指蛋白ZC3H88的表达改变,评估小鼠乳腺肿瘤细胞的侵略性表型和致致细胞行为。结合其他也检查细胞迁移和生长在3D环境中的方法,发现在肿瘤细胞系中Zc3h8的表达水平较高,或者通过质粒的启动子介导表达,导致细胞快速速率扩散,快速迁移,在3D环境中增长,并在体外入侵测定8增加入侵。相反,shRNA构造?...

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The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

体外细胞入侵测定使用含有蛋白质基质的细胞培养插入物,通过量化细胞入侵和迁移的可能性来测量癌症转移的潜能。细胞面临的挑战是通过蛋白质基质和多孔膜迁移,向化学吸引剂迁移,然后通过光显微镜进行量化。

小鼠乳腺肿瘤细胞在体外入侵测定中作为致癌细胞行为的测量

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

该协议，体外入侵测定，是一个有用的工具，定量测量细胞线的能力，通过蛋白质丰富的基质迁移，并通过多孔膜，这个过程类似于癌细胞入侵的早期阶段。这些细胞系可以进行基因改变，以便过度表达基因或减少基因的表达，以确定该基因在细胞迁移或细胞入侵中是否发挥作用。许多侵略性癌症涉及细胞行为的戏剧性变化，包括增加迁移和入侵。因此，这种体外入侵分析可以让我们更好地了解这个过程所涉及的基因和其他因素。为了开始这个程序，在T25烧瓶中生长粘附的小鼠乳腺肿瘤细胞，在37摄氏度下，有5%的二氧化碳和100%的湿度，直到它们在第一天被70%到90%的汇合。从存储中取回博伊登腔室插入物，并将其转移到细胞培养罩中，以加热至室温 20 分钟。使用三个插入来为每个实验的每个单元格行生成统计上有效的数据。然后将500微升的预加热无血清DMEM介质添加到刀片中，使多孔膜和凝胶在两侧进行水合。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳和100%的湿度孵育至少两个小时。在此之后，通过去除生长介质和用五毫升的HSS冲洗细胞来准备细胞。取出 HBSS 并添加 0.25% trypsin EDTA 溶液的一毫升。在37摄氏度下孵育一至五分钟，或直到细胞出现圆形或出现分离迹象。然后轻轻敲拍烧瓶，分离所有细胞。用10%FBS将细胞重新悬浮在5毫升DMEM中。将细胞悬浮液转移到无菌的15毫升离心管。离心细胞和1000倍g5分钟，轻轻地颗粒细胞。取出介质，将颗粒重新悬浮在五毫升无血清 DMEM 中。重复离心和重新悬挂过程两次，总共洗三次。在此之后，彻底重新悬浮在无血清DMEM的最后五毫升细胞，并确保没有细胞团。使用血细胞计确定细胞浓度，确保只计算可行细胞。在5毫升无血清DMEM中稀释细胞悬浮液至每毫升5万个细胞。接下来，将带刀片的盘子从培养箱中取出，然后轻轻地从刀片中吸出介质。提起刀片，从井中吸出介质。快速工作，将化疗法添加到下院。将刀片放入井中，对于 24 个井盘，向刀片中加入 500 微升的电池悬浮液。确保膜两侧没有气泡。将菜返回细胞培养箱22小时。22 小时后，准备 1% 甲醛溶液和一个 X PBS 进行固定。在干净的24孔细胞培养皿中，将一毫升的固定剂添加到单个孔中，以便每个插入有一口井。然后，用10%乙醇在PBS溶液中准备0.1%水晶紫罗兰的染色溶液。将一毫升的染色溶液添加到每个刀片的清洁井中。使用钳子，一次卸下每个插入件。将无菌棉签放在每个刀片内，并拭子在膜的上侧，以去除任何未移民的细胞。使用第二个棉签重复此过程。接下来，从刀片内部取出任何剩余的介质，并添加 750 微升 PBS 以洗去任何分离的电池。取出 PBS，用新鲜的 PBS 重复洗涤。然后将刀片放入含有固定物的井中，以固定膜底面的迁移细胞。对所有刀片重复此过程，让刀片在室温下固定 15 分钟。在此之后，从井中每次取出一个刀片，然后用 750 微升 PBS 清洗。将刀片放入含污渍溶液的井中，并留15分钟，以染色所有迁移和固定的细胞。然后取出刀片，浸入装有蒸馏水的烧杯中，直到从刀片上流下来的水清除。清除多余的水滴，侧身将插入物放在一张滤纸上。让刀片空气干燥。通过为每个刀片标记干净的玻璃显微镜幻灯片，并将一小滴显微镜浸入油放入每个幻灯片的中心，为成像做好准备。使用手术刀，在塑料插入件内侧膜的周长周围切割膜，以分离膜。使用钳子取出膜并将其放在标记的滑轨上的油滴顶部。使用复合显微镜，以五倍、十倍或二十倍的放大率观察细胞。要进行量化，请以 10 倍的放大倍率拍摄多个非重叠图像。确定所有样本每个区域的入侵细胞或细胞总数。对于每个实验，使用三个复制插入执行测定中的每个条件，并重复多次，以取得统计上有用的结果。在这项研究中，通过蛋白质基质进行体外入侵，用于评估小鼠乳腺肿瘤细胞的恶性表型，并改变锌指蛋白Zc3h8的表达。Zc3h8表达水平较高，出现在肿瘤细胞系或从质粒中通过启动子中表达，导致细胞增殖速度迅速，迁移速度快，3D环境中生长，并在体外入侵测定中增加侵蚀。相反，shRNA构造的表达减少会导致攻击性降低、迁移和入侵。当细胞入侵在Zc3h8表达的shRNA敲击时减少时，当表达被救出时，这种入侵被拯救。体外入侵测定技术是非常有用的，因为它是一种快速，廉价，灵活，相对容易的方法研究细胞行为。培养中的细胞很容易在基因上操作。他们甚至可以测试特定的突变。体外入侵系统还允许分析小分子抑制剂以及微生物制剂，如微RNA，以了解其对细胞迁移和入侵的影响。这种测定还包括很大的灵活性，允许改变基质的蛋白质含量，孔径和化疗。

Research

JoVE Journal

Genetics

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饲养并在隐藏甲壳虫双链RNA介导的基因敲除，<em&gt;白腹皮蠹</em

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科研

遗传学

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

单细胞测序拷贝数改变的检测

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In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

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体外生物荧光法对乳腺上皮细胞昼夜节律的表征

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Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

酵母神经退行性蛋白病模型中组蛋白后转化修饰改变的表征

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