Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door Grant R15CA169978 van de National Institutes of Health. Aanvullende financiering kwam van de Villanova University.

Alle experimenten en methoden werden uitgevoerd zoals goedgekeurd door Villanova University institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
1. genexpressie in gekweekte muis mammary tumor cellen
<ol><li>Bereid eerst de te testen cellijnen voor.</li>
	<li>
Gebruik een broed kolonie van BALB/cV muizen. Deze muizen dragen de Balb/cV stam van muis borsttumor virus, overgedragen aan pups in melk6,7. 50 procent van de vrouwe...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB/cV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus.">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li><li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB/cV+mice.">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

De in vitro invasie test is een goedkope, snelle, kwantitatieve en eenvoudige methode voor het bestuderen van de factoren die de invasie van kankercellen bevorderen. Borstkanker is de meest gediagnosticeerde kanker onder vrouwen. Van de drie belangrijkste subtypen van borstkanker, drievoudig negatief, (of er-, PR-, HER2/Neu-), is de meest agressieve, meest waarschijnlijke metastasize, en de meeste dodelijke9. Daarom kan het begrijpen van de genen en expressie die resulteren in metastasen ...

De in vitro invasie test kan een nuttig hulpmiddel zijn bij het meten van het vermogen van een cel om te migreren via een eiwit gecoat membraan, analoog aan de eerste stappen in metastasen. Een belangrijk kenmerk van kwaadaardige kankercellen is hun vermogen om te migreren door en binnendringen in de buurt weefsels. Kanker die zich heeft verspreid of metastaseert, brengt meer behandelings uitdagingen met zich mee en heeft een lager percentage langdurig overleven, terwijl gelokaliseerde tumoren gemakkelijker te behandelen zijn en hogere percentages van overleving op lange termijn hebben. Om metastaseren, kankercellen moeten verlaten van de primaire tumor en migreren naar de bloedsomloop of lymfestelsel, een proces dat het passeren van de extracellulaire matrix en kelder membraan1vereist. In het proces genaamd de epitheliale mesenchymale transitie (EMT), moeten de tumorcellen celcelcontacten breken, directioneel migreren en nabijgelegen bloed of lymfevaten binnendringen. De eerste stappen van deze metastasen Cascade zijn van groot belang, omdat deze stappen zijn wat kan kanker Deadlier maken. De genetische en epigenetische factoren die betrokken zijn bij de eerste stappen van metastase zijn de focus van een grote hoeveelheid onderzoek, maar nauwkeurige en betrouwbare experimentele instrumenten zijn nodig om deze vroege stappen zowel in vivo als in vitro te testen.
Hulpmiddelen voor het meten van veranderingen in Celmigratie zoals wondgenezing (scratch) of groei in 3D-omgevingen zoals zachte agar-assays kunnen gedeeltelijk de behoefte aan experimentele methoden voor het meten van vroege stappen van metastasen aanpakken, maar een test om de invasie te meten is meer uitdagend omdat het proces in het lichaam in een complexe tumor micro-omgeving optreedt. Met het oog op de screening van geneesmiddelen of genveranderingen om belangrijke factoren in de invasie en metastase te bepalen, een systeem dat in vitro met gekweekte cellen kan worden gebruikt en de uitdagingen waarmee gemetastaseerde cellen worden geconfronteerd na te bootsen, is de invasie test2, 3. Borstkanker is de meest gediagnosticeerde vorm van kanker bij vrouwen en de tweede belangrijkste oorzaak van de kanker sterfte bij vrouwen, dus het begrijpen van de genen die verantwoordelijk zijn voor de invasie van borstkanker cellen en metastase is van cruciaal belang voor de volksgezondheid. Bovendien zijn muis cellen een handig modelsysteem voor het bestuderen van borstkanker en de progressie ervan.
De in vitro invasie test is gebaseerd op de vergadering van de Boyden Chamber, waar twee kamers van groeimedia worden gescheiden door een poreus membraan3. Om na te bootsen van de tumor micro omgeving, een eiwitrijke gel is ook opgenomen om cellen in één kamer van een chemoaantretant in de andere scheiden en fungeren als een kelder membraan barrière. Om te migreren naar de chemoaantretant, moeten cellen eerst door de eiwitrijke barrière passeren en vervolgens door het poreuze membraan passeren-een proces dat analoog is aan hoe gemetastaseerde cellen migreren via stroma. De proteïnerijke gel kan worden aangepast op basis van de behoeften van het experiment, maar bestaat meestal uit collageen, of kelder membraan extract (bijv. Matrigel)4. Het is een complex mengsel van eiwitten, proteoglycanen en groeifactoren, maar meestal bestaat uit lamininen en collageen IV 4,5. Cellen moeten dan een poreus membraan passeren dat typisch is gemaakt van polycarbonaat, polyester of polytetrafluorethyleen (PTFE). Membranen kunnen commercieel worden gekocht met of zonder een proteïne-gel (meestal collagens), of de gel kan afzonderlijk worden aangeschaft en toegevoegd. De poriegrootte kan worden aangepast op basis van de celgrootte. Hoewel porie maten verkrijgbaar zijn van 0,4-8,0 μm, zijn alleen poriën van 3,0-8,0 μm groot genoeg voor Celmigratie. De invasie test is gebruikt om de effectiviteit te bepalen van remmers op het vermogen van cellen om te migreren en binnen te vallen. Terwijl de exacte tumor micro omgeving ontbreekt die in vivo aanwezig is, is de in vitro invasie test voordelig bij het screenen van vele aandoeningen in korte tijd, terwijl de behoefte aan diermodellen wordt geminimaliseerd. Het doel van deze experimenten is het vergelijken van genexpressie van vermoedelijke oncogenen en het bepalen van de effecten op het gedrag van kankercellen en de agressiviteit van de ziekte met behulp van de in vitro invasie assay en andere tests. Over het algemeen biedt de invasie test consistente, kwantitatieve en snelle resultaten voor het bepalen van gemetastaseerd potentieel, terwijl het ook een relatief goedkope, ongecompliceerde en aanpasbare methode is.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

De in vitro invasie test gebruikt een eiwitrijke matrix in een Boyden kamer om het vermogen van gekweekte cellen te meten door de matrix en een poreus membraan te passeren in een proces dat analoog is aan de initiële stappen van kankercellen metastasen. De geteste cellen kunnen worden gewijzigd voor de genexpressie of worden behandeld met remmers om te testen op veranderingen in het invasie potentieel. Dit experiment test het agressieve fenotype van de muizen-borstkanker tumorcellen te ontdekken en karakteriseren de potentiële oncogenen die celinvasie bevorderen. Deze techniek kan echter veelzijdig zijn en aan veel verschillende toepassingen worden aangepast. Het experiment zelf kan worden gedaan in een dag en de resultaten worden verworven door lichte microscopie in minder dan een dag. De resultaten omvatten tellingen van het aantal binnenvallende cellen voor vergelijking en analyse. De in vitro invasie test is een snelle, goedkope en duidelijke methode voor het bepalen van het Celgedrag in een cultuur die kan worden gebruikt als een initiële beoordeling voordat er meer bij vivo-testen wordt betrokken.

Deze methode van in vitro invasie door middel van een eiwit matrix werd gebruikt om de agressieve fenotypes en oncogene celgedragingen van muizen-borstkanker tumorcellen met veranderde expressie van het zink vinger eiwit ZC3H88te beoordelen. In combinatie met andere benaderingen die ook de Celmigratie en groei in 3D-omgevingen onderzoeken, bleek dat hogere niveaus van expressie van Zc3h8 in tumor cellijnen, of door Promoter-gemedieerde expressie van een plasmide, r...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior at JoVE.com

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Dit protocol, de in vitro invasie test, is een nuttig instrument voor het kwantitatief meten van een cel lijnen vermogen om te migreren door middel van een eiwitrijke matrix en passeren een poreus membraan, in een proces vergelijkbaar met de vroege stadia van kankercel invasie. Deze cellijnen kunnen genetisch worden gewijzigd om een gen meer dan uit te drukken of om verminderde uitdrukking van een gen te hebben om te bepalen of dat gen een rol in celmigratie of celinvasie speelt. Veel agressieve kankers betrekken dramatische veranderingen in het celgedrag, met inbegrip van verhoogde migratie en invasie.Dus deze in vitro invasie test kan ons in staat stellen om de genen en andere factoren die betrokken zijn bij dit proces beter te begrijpen. Om te beginnen met deze procedure, groeien aanhangende muis borsttumorcellen in een T25 fles op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 100% vochtigheid totdat ze 70%tot 90% samenvloeien voor dag een van het experiment. Haal de Boyden kamer inserts uit de opslag en breng ze naar een cel cultuur kap te warm tot kamertemperatuur voor 20 minuten.Gebruik drie wisselplaten om statistisch geldige gegevens voor elke celregel voor elk experiment te genereren. En voeg vervolgens 500 microliter van de voorverwarmde serumvrije DMEM-media toe aan de wisselplaten, zodat het poreuze membraan en de gel aan beide zijden gehydrateerd worden. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 100% vochtigheid gedurende ten minste twee uur.Bereid hierna de cellen voor door de groeimedia te verwijderen en de cellen te spoelen met vijf milliliter HBSS. Verwijder de HBSS en voeg een milliliter van 0,25% trypsin EDTA-oplossing toe. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één tot vijf minuten of totdat cellen afgerond verschijnen of tekenen van onthechting vertonen.Tik vervolgens voorzichtig op de kolf om alle cellen los te maken. Schort de cellen opnieuw op in vijf milliliter DMEM met 10%FBS. En breng de celsuspensie over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter.Centrifugeer de cellen en 1000 keer g gedurende vijf minuten om de cellen voorzichtig te pelleteren. Verwijder de media en schort de pellet opnieuw op in vijf milliliter serumvrije DMEM. Herhaal het centrifugatie- en herschorten proces twee extra keren voor een totaal van drie wasbeurten.Daarna worden de cellen in de laatste vijf milliliter serumvrije DMEM grondig opnieuw opschorsen en ervoor zorgen dat er geen klonten cellen zijn. Gebruik een hemocytometer om de celconcentratie te bepalen om ervoor te zorgen dat alleen levensvatbare cellen tellen. En verdun de celsuspensie tot 50.000 cellen per milliliter in vijf milliliter serumvrije DMEM.Verwijder vervolgens de schotel met de inzetstukken uit de couveuse en haal de media voorzichtig uit een insert. Til de wisselplaat op en aspirate de media uit de put. Snel werken, voeg de chemoattractant toe aan de onderste kamer.Plaats de insert in de put, en voor een 24 goed schotel, voeg 500 microliter van de cel suspensie aan de insert. Zorg ervoor dat er aan weerszijden van het membraan geen luchtbellen aanwezig zijn. Breng het gerecht 22 uur terug naar de couveuse van de celkweek.Bereid na 22 uur een oplossing van 1% paraformaldehyde en één X PBS voor fixatie. In een schone 24 goed cel cultuur schotel, voeg een milliliter van de fixatieve aan individuele putten, zodat er een goed voor elke insert. Bereid vervolgens de kleuroplossing van 0,1% kristalviolet voor in een oplossing van PBS met 10% ethanol.Voeg een milliliter van deze kleuring oplossing om een schone put voor elke insert. Verwijder elke insert één voor één met behulp van tangen. Plaats een steriel wattenstaafje in elke insert en wattenstaafje de bovenzijde van het membraan om eventuele ongemigreerde cellen te verwijderen.Herhaal dit proces met een tweede wattenstaafje. Verwijder vervolgens de resterende media van de binnenkant van de wisselplaat en voeg 750 microliter PBS toe om losse cellen weg te spoelen. Verwijder de PBS en herhaal de was met verse PBS.Plaats vervolgens de insert in een put met fixatief om de gemigreerde cellen aan de onderkant van het membraan te bevestigen. Herhaal dit proces voor alle wisselplaten en laat de wisselplaten 15 minuten repareren bij kamertemperatuur. Verwijder hierna elke insert één voor één uit zijn put en was deze met 750 microliter PBS.Plaats de insert in een put met kleuroplossing en laat deze 15 minuten staan om alle gemigreerde en vaste cellen te bevlekken. Verwijder vervolgens de wisselplaten en dompel ze in een beker met gedestilleerd water totdat het water dat van de wisselplaat afloopt duidelijk is. Verwijder overtollige waterdruppels en plaats de insert zijwaarts op een stuk filterpapier.Laat de inzetstukken drogen. Bereid het membraan voor op beeldvorming door het labelen van een schone glazen microscoop dia voor elke insert, en het plaatsen van een kleine druppel microscoop onderdompeling olie in het midden van elke dia. Met behulp van een scalpel, gesneden rond de omtrek van het membraan aan de binnenkant van de plastic insert om het membraan los te maken.Gebruik tangen om het membraan te verwijderen en plaats het op de top van de oliedruppel op de gelabelde dia. Met behulp van een samengestelde microscoop, bekijk cellen op vijf keer, 10 keer, of 20 keer vergroting. Voor kwantificering, neem meerdere niet-overlappende beelden op 10 keer vergroting.Bepaal het totale aantal binnenvallende cellen of cellen per gebied voor alle monsters. Voer voor elk experiment elke voorwaarde in de test uit met drie repliceren wisselplaten en herhaal meerdere keren voor statistisch nuttige resultaten. In deze studie wordt in vitro invasie door middel van een eiwitmatrix gebruikt om de agressieve fenotypen in oncogenics celgedrag van muizenpoezogelijke tumorcellen te beoordelen met veranderde expressie van het zinkvingerwit, Zc3h8.Hogere niveaus van Zc3h8 expressie wordt gezien in tumorcellijnen of door promotor bemiddelde expressie van een plasmide, wat resulteert in snelle tarieven van celproliferatie, snelle migratie, groei in 3D-omgevingen, en verhoogde aantasting binnen de in vitro invasie test. Omgekeerd, verminderde expressie door shRNA construeert resulteert in minder agressieve proliferatie, migratie en invasie. Terwijl de celinvasie bij shRNA knockdown van uitdrukking Zc3h8 vermindert, wordt die invasie gered wanneer de uitdrukking wordt gered.De in vitro invasie test techniek is zeer nuttig omdat het een snelle, goedkope, flexibele en relatief gemakkelijke benadering van het bestuderen van celgedrag. Cellen gekweekt in cultuur zijn gemakkelijk genetisch te manipuleren. Ze kunnen zelfs worden getest op specifieke mutaties.De in vitro invasie systeem maakt het ook mogelijk voor de analyse van kleine molecuulremmers en biologische agentia zoals micro RNAs voor hun effecten op celmigratie en invasie. Deze test omvat ook een grote mate van flexibiliteit, waardoor de wijziging van het eiwitgehalte van de matrix, porie grootte en chemoattractant.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen maatregel chromatine toegankelijkheid in zoogdiercellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...