Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention R15CA169978 des National Institutes of Health. Des fonds supplémentaires ont été accordés à l'Université Villanova.

Toutes les expériences et méthodes ont été réalisées comme l'autorise le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Villanova (IACUC).
1. Expression génique dans les cellules de tumeur mammaire de souris cultivées
<ol><li>Tout d'abord, préparer les lignées cellulaires à tester.</li>
	<li>
Utilisez une colonie reproductrice de souris BALB/cV. Ces souris portent la souche BALB/cV du virus de tumeur mammaire de souris, transmise aux chiots d...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

L'essai d'invasion in vitro est une méthode peu coûteuse, rapide, quantitative, et simple pour étudier les facteurs favorisant l'invasion de cellules cancéreuses. Le cancer du sein est le cancer le plus souvent diagnostiqué chez les femmes. Des trois principaux sous-types de cancer du sein, triple négatif, (ou ER-, PR-, HER2/neu-), est le plus agressif, le plus susceptible de métastaser, et le plus mortel9. Par conséquent, la compréhension des gènes et de l'expression qui entra?...

L'analyse d'invasion in vitro peut être un outil utile pour mesurer la capacité d'une cellule à migrer à travers une membrane enrobée de protéines, analogue aux premières étapes de la métastes. Une caractéristique clé des cellules cancéreuses malignes est leur capacité à migrer à travers et envahir les tissus voisins. Le cancer qui s'est propagé ou métastasé pose plus de défis de traitement et a des taux plus bas de survie à long terme, alors que les tumeurs localisées sont plus faciles à traiter et ont des taux plus élevés de survie à long terme. Afin de métastaser, les cellules cancéreuses doivent quitter la tumeur primaire et migrer dans le système circulatoire ou lymphatique, un processus qui nécessite de passer par la matrice extracellulaire et la membrane du sous-sol1. Dans le processus appelé la transition mésenchymale épithéliale (EMT), les cellules de tumeur doivent casser des contacts de cellule-cellule, migrer directionnellement, et envahir le sang ou les vaisseaux lymphatiques voisins. Les premières étapes de cette cascade de métastes sont d'un grand intérêt puisque ces étapes sont ce qui peut rendre le cancer plus mortel. Les facteurs génétiques et épigénétiques impliqués dans les premières étapes de la métastes font l'objet d'une grande quantité de recherche, mais des outils expérimentaux précis et fiables sont nécessaires pour tester ces premières étapes in vivo et in vitro.
Les outils pour mesurer les changements dans la migration cellulaire tels que la cicatrisation des plaies (rayures) ou la croissance dans les environnements 3D tels que les essais d'agar doux peuvent répondre en partie à la nécessité de méthodes expérimentales de mesure des premières étapes de la métasse, mais un test pour mesurer l'invasion est plus difficile puisque le processus se produit dans le corps dans un microenvironnement complexe de tumeur. Aux fins du dépistage des médicaments ou des altérations génétiques pour déterminer les facteurs importants dans l'invasion et la métastase, un système qui peut être utilisé in vitro avec des cellules cultivées et imiter les défis rencontrés par les cellules métastatiques in vivo est l'essai d'invasion2, 3. Le cancer du sein est le type de cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes, de sorte que la compréhension des gènes responsables de l'invasion des cellules du cancer du sein et des métastes est d'une importance cruciale pour la santé publique. En outre, les cellules de souris sont un système modèle utile pour étudier le cancer du sein et sa progression.
L'exemple d'invasion in vitro est basé sur l'assemblée de la Chambre Boyden où deux chambres de médias de croissance sont séparées par une membrane poreuse3. Pour imiter le microenvironnement de tumeur, un gel protéine-riche est également inclus pour séparer des cellules dans une chambre d'un chimioattractant dans l'autre et agir comme barrière de membrane de sous-sol. Afin de migrer vers le chimioattractant, les cellules doivent d'abord passer à travers la barrière riche en protéines, puis passer à travers la membrane poreuse - un processus analogue à la façon dont les cellules métastatiques migrent à travers le stroma. Le gel riche en protéines peut être modifié en fonction des besoins de l'expérience, mais se compose généralement de collagène, ou extrait de membrane de sous-sol (par exemple, Matrigel)4. Il s'agit d'un mélange complexe de protéines, de protéoglycanes et de facteurs de croissance, mais se compose principalement de laminins et de collagène IV 4,5. Les cellules doivent alors passer à travers une membrane poreuse typiquement faite de polycarbonate, de polyester ou de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Les membranes peuvent être achetées commercialement avec ou sans gel protéique (généralement des collagènes), ou le gel peut être acheté séparément et ajouté. La taille des pores peut être ajustée en fonction de la taille de la cellule. Alors que les tailles de pores sont disponibles de 0,4 à 8,0 m, seuls les pores de 3,0 à 8,0 m sont assez grands pour la migration cellulaire. L'exemple d'invasion a été utilisé pour déterminer l'efficacité des inhibiteurs sur la capacité des cellules à migrer et à envahir. Bien qu'il manque le microenvironnement tumoral exact qui est présent in vivo, l'analyse d'invasion in vitro est bénéfique au dépistage de nombreuses conditions dans un court laps de temps tout en minimisant le besoin de modèles animaux. Le but de ces expériences est de comparer l'expression génique des oncogènes suspects et de déterminer les effets sur le comportement des cellules cancéreuses et l'agressivité de la maladie en utilisant l'analyse d'invasion in vitro et d'autres tests. Dans l'ensemble, l'essai d'invasion fournit des résultats cohérents, quantitatifs et rapides pour déterminer le potentiel métastatique tout en étant une méthode relativement peu coûteuse, simple et adaptable.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

L'analyse d'invasion in vitro utilise une matrice riche en protéines dans une chambre Boyden pour mesurer la capacité des cellules cultivées à passer à travers la matrice et une membrane poreuse dans un processus analogue aux premières étapes de la métasse des cellules cancéreuses. Les cellules testées peuvent être modifiées pour l'expression du gène ou traitées avec des inhibiteurs pour tester les changements dans le potentiel d'invasion. Cette expérience teste le phénotype agressif des cellules de tumeur mammaire de souris pour découvrir et caractériser les oncogènes potentiels qui favorisent l'invasion cellulaire. Cette technique, cependant, peut être polyvalente et adaptée à de nombreuses applications différentes. L'expérience elle-même peut être faite en une journée et les résultats sont obtenus par microscopie légère en moins d'une journée. Les résultats comprennent le nombre de cellules envahissantes pour la comparaison et l'analyse. L'analyse d'invasion in vitro est une méthode rapide, peu coûteuse et claire pour déterminer le comportement cellulaire dans une culture qui peut être utilisée comme une évaluation initiale avant d'être plus impliquée in vivo.

Cette méthode d'invasion in vitro par une matrice de protéine a été employée pour évaluer les phénotypes agressifs et les comportementsde cellules oncogènes des cellules mammaires de tumeur de souris avec l'expression altérée de la protéine de doigt de zinc ZC3H8 8. En conjonction avec d'autres approches qui examinent également la migration et la croissance cellulaires dans les environnements 3D, il a été constaté que des niveaux plus élevés d'expr...

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L'exemple d'invasion cellulaire in vitro est utilisé pour mesurer le potentiel de la métastes du cancer en quantifiant le potentiel cellulaire d'invasion et de migration à l'aide d'inserts de culture cellulaire contenant de la matrice protéique. Les cellules sont mises au défi de migrer à travers la matrice protéique et une membrane poreuse, vers un chimioattractant, puis quantifiées par microscopie légère.

L'utilisation de cellules de tumeur mammaire de souris dans un analyse d'invasion in vitro comme mesure du comportement cellulaire oncogène

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Ce protocole, l’analyse d’invasion in vitro, est un outil utile pour mesurer quantitativement la capacité d’une lignée cellulaire à migrer à travers une matrice riche en protéines et à passer à travers une membrane poreuse, dans un processus similaire aux premiers stades de l’invasion des cellules cancéreuses. Ces lignées cellulaires peuvent être génétiquement modifiées afin de sur-exprimer un gène ou d’avoir une expression réduite d’un gène afin de déterminer si ce gène joue un rôle dans la migration cellulaire ou l’invasion cellulaire. De nombreux cancers agressifs impliquent des changements spectaculaires dans le comportement cellulaire, y compris l’augmentation de la migration et l’invasion.Ainsi, cet essai d’invasion in vitro peut nous permettre de mieux comprendre les gènes et autres facteurs impliqués dans ce processus. Pour commencer cette procédure, cultiver des cellules tumorales mammaires de souris adhérentes dans un flacon T25 à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité jusqu’à ce qu’ils soient 70% à 90% confluent pour le premier jour de l’expérience. Récupérez les inserts de chambre Boyden de stockage et transférez-les à une hotte de culture cellulaire pour réchauffer à température ambiante pendant 20 minutes.Utilisez trois inserts pour générer des données statistiquement valides pour chaque lignée cellulaire pour chaque expérience. Et puis ajouter 500 microlitres du sérum préchauffé sans DMEM médias aux inserts de sorte que la membrane poreuse et le gel sont hydratés des deux côtés. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité pendant au moins deux heures.Après cela, préparer les cellules en enlevant le média de croissance et en rinçant les cellules avec cinq millilitres de HBSS. Retirez le HBSS et ajoutez un millilitre de 0,25% trypsine EDTA solution. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules apparaissent arrondies ou montrent des signes de détachement.Puis appuyez doucement sur le flacon pour détacher toutes les cellules. Suspendre à nouveau les cellules en cinq millilitres de DMEM avec 10%FBS. Et transférer la suspension cellulaire dans un tube stérile centrifugeuse de 15 millilitres.Centrifuger les cellules et 1000 fois g pendant cinq minutes pour pelleter doucement les cellules. Retirez le média et suspendez la pastille en cinq millilitres de DMEM sans sérum. Répétez le processus de centrifugation et de re-suspension deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages.Après cela, soigneusement re-suspendre les cellules dans les cinq derniers millilitres de DMEM sans sérum et s’assurer qu’il n’y a pas de touffes de cellules. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire en vous assurant de ne compter que les cellules viables. Et diluer la suspension cellulaire à 50 000 cellules par millilitre en cinq millilitres de DMEM sans sérum.Ensuite, retirez le plat avec les inserts de l’incubateur, et aspirez doucement le média d’un insert. Soulevez l’insert et aspirez les supports du puits. En travaillant rapidement, ajouter le chimioattractant à la chambre basse.Placez l’insert dans le puits, et pour un plat de 24 puits, ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire à l’insert. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air présentes de chaque côté de la membrane. Remettre le plat à l’incubateur de culture cellulaire pendant 22 heures.Après 22 heures, préparer une solution de 1% de paraformaldéhyde et un X PBS pour la fixation. Dans un plat propre de culture de cellules de 24 puits, ajoutez un millilitre du fixatif aux puits individuels ainsi il y a un puits pour chaque insert. Ensuite, préparez la solution de coloration de 0,1% de violet cristal dans une solution de PBS avec 10% d’éthanol.Ajoutez un millilitre de cette solution de coloration à un puits propre pour chaque insert. À l’aide de forceps, retirez chaque insert un à la fois. Placez un coton-tige stérile à l’intérieur de chaque insert et écouvillonnez le côté supérieur de la membrane pour enlever les cellules non mélangées.Répétez ce processus avec un deuxième coton-tige. Ensuite, retirez tout autre média de l’intérieur de l’insert et ajoutez 750 microlitres de PBS pour laver les cellules détachées. Retirer le PBS et répéter le lavage avec du PBS frais.Ensuite, placez l’insert dans un puits contenant fixatif pour fixer les cellules migrées sur le dessous de la membrane. Répétez ce processus pour tous les inserts et laissez les inserts fixer pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, retirez chaque insert un à la fois de son puits et lavez-le avec 750 microlitres de PBS.Placez l’insert dans une solution de coloration contenant bien et laissez-le pendant 15 minutes pour tacher toutes les cellules migrées et fixes. Retirez ensuite les inserts et trempez-les dans un bécher contenant de l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau qui s’enfuit de l’insert soit claire. Retirer les gouttelettes d’eau excédentaires et placer l’insert latéralement sur un morceau de papier filtre.Laissez sécher l’air des inserts. Préparez la membrane à l’imagerie en étiquetant une lame de microscope en verre propre pour chaque insert, et en plaçant une petite goutte d’huile d’immersion au microscope au centre de chaque diapositive. À l’aide d’un scalpel, couper autour du périmètre de la membrane à l’intérieur de l’insert en plastique pour détacher la membrane.Utilisez des forceps pour enlever la membrane et la placer sur la goutte d’huile sur la lame étiquetée. À l’aide d’un microscope composé, visualisez les cellules à cinq fois, 10 fois ou 20 fois le grossissement. Pour la quantification, prenez plusieurs images qui ne se chevauchent pas à 10 fois le grossissement.Déterminer le nombre total de cellules envahissantes ou de cellules par zone pour tous les échantillons. Pour chaque expérience, effectuez chaque condition dans l’analyse avec trois inserts de répétition et répétez plusieurs fois pour des résultats statistiquement utiles. Dans cette étude, l’invasion in vitro par une matrice protéique est utilisée pour évaluer les phénotypes agressifs dans les comportements cellulaires oncogènes des cellules tumorales mammaires de souris avec l’expression altérée de la protéine de doigt de zinc, Zc3h8.Des niveaux plus élevés d’expression Zc3h8 sont observés dans les lignées cellulaires tumorales ou par l’expression médiatisée d’un plasmide, ce qui entraîne des taux rapides de prolifération cellulaire, une migration rapide, une croissance dans les environnements 3D et un empiétement accru dans l’analyse d’invasion in vitro. Inversement, la diminution de l’expression par shRNA se traduit par une prolifération, une migration et une invasion moins agressives. Alors que l’invasion cellulaire diminue lors du renversement shRNA de l’expression Zc3h8, cette invasion est sauvée lorsque l’expression est sauvée.La technique d’analyse d’invasion in vitro est extrêmement utile car il s’agit d’une approche rapide, peu coûteuse, flexible et relativement facile à étudier le comportement cellulaire. Les cellules cultivées en culture sont faciles à manipuler génétiquement. Ils peuvent même être testés pour des mutations spécifiques.Le système d’invasion in vitro permet également l’analyse des inhibiteurs des petites molécules ainsi que des agents biologiques comme les micro ARN pour leurs effets sur la migration et l’invasion cellulaires. Cet essai inclut également une grande quantité de flexibilité, permettant l’altération de la teneur en protéines de la matrice, de la taille des pores et du chimioattractant.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

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