Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R15CA169978 dei National Institutes of Health. Ulteriori finanziamenti provenivano dall'Università di Villanova.

Tutti gli esperimenti e i metodi sono stati eseguiti come autorizzati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali dell'Università di Villanova (IACUC).
1. Espressione genica nelle cellule tumorali mammarie dei topi colti
<ol><li>In primo luogo, preparare le linee cellulari da testare.</li>
	<li>
Utilizzare una colonia riproduttiva di topi BALB/cV. Questi topi portano il ceppo BALB/cV del virus del tumore mammario dei topi, trasmesso ai cuccioli nel latte...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

Il test di invasione in vitro è un metodo economico, rapido, quantitativo e diretto per studiare i fattori che promuovono l'invasione delle cellule tumorali. Il cancro al seno è il cancro più comunemente diagnosticato tra le donne. Dei tre principali sottotipi di cancro al seno, triplo negativo, (o ER-, PR-, HER2/neu-), è il più aggressivo, più probabile che metastatizza, e più mortale9. Pertanto, comprendere i geni e l'espressione che causano la metastasi può aiutare a trovare nu...

Il saggio di invasione in vitro può essere uno strumento utile quando si misura la capacità di una cellula di migrare attraverso una membrana rivestita di proteine, analoga ai primi passi nella metastasi. Una caratteristica chiave delle cellule tumorali maligne è la loro capacità di migrare attraverso e invadere i tessuti vicini. Il cancro che si è diffuso o metastatizzato pone più sfide di trattamento e ha tassi più bassi di sopravvivenza a lungo termine, mentre i tumori localizzati sono più facili da trattare e hanno tassi più elevati di sopravvivenza a lungo termine. Per metastatizzare, le cellule tumorali devono lasciare il tumore primario e migrare nel sistema circolatorio o linfatico, un processo che richiede il passaggio attraverso la matrice extracellulare e la membrana seminterrato1. Nel processo chiamato transizione epiteliale mesenchymal (EMT), le cellule tumorali devono rompere i contatti delle cellule cellulari, migrare direzionalmente e invadere i vasi sanguigni o linfatici vicini. I primi passi di questa cascata di metastasi sono di grande interesse poiché questi passaggi sono ciò che può rendere il cancro più letale. I fattori genetici ed epigenetici coinvolti nelle prime fasi della metastasi sono al centro di una grande quantità di ricerca, ma sono necessari strumenti sperimentali accurati e affidabili per testare questi primi passi sia in vivo che in vitro.
Gli strumenti per misurare i cambiamenti nella migrazione cellulare come i saggi di guarigione delle ferite (graffio) o la crescita in ambienti 3D come i test di agar morbido possono affrontare parzialmente la necessità di metodi sperimentali per misurare i primi passi della metastasi, ma un saggio per misurare l'invasione è più impegnativo dal momento che il processo si verifica nel corpo all'interno di un complesso microambiente tumorale. Ai fini dello screening di farmaci o alterazioni genetiche per determinare fattori importanti nell'invasione e nella metastasi, un sistema che può essere utilizzato in vitro con cellule coltivate e imitare le sfide affrontate dalle cellule metastatiche in vivo è il saggio di invasione2, 3. Il cancro al seno è il tipo di cancro più comunemente diagnosticato nelle donne e la seconda causa di morte per cancro nelle donne, quindi comprendere i geni responsabili dell'invasione delle cellule tumorali e delle metastasi è di fondamentale importanza per la salute pubblica. Inoltre, le cellule del topo sono un utile sistema modello per studiare il cancro al seno e la sua progressione.
Il saggio di invasione in vitro si basa sull'assemblea della Camera di Boyden, dove due camere di mezzo di crescita sono separate da una membrana porosa3. Per imitare il microambiente tumorale, un gel ricco di proteine è incluso anche per separare le cellule in una camera da un chemioattraente nell'altra e agire come una barriera di membrana seminterrato. Per migrare verso il chemioattraente, le cellule devono prima passare attraverso la barriera ricca di proteine e poi passare attraverso la membrana porosa - un processo analogo a come le cellule metastatiche migrano attraverso lo stroma. Il gel ricco di proteine può essere modificato in base alle esigenze dell'esperimento, ma di solito è costituito da collagene, o estratto di membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel)4. È una complessa miscela di proteine, proteoglicani e fattori di crescita, ma per lo più è costituito da laminoine e collagene IV 4,5. Le cellule devono quindi passare attraverso una membrana porosa tipicamente in policarbonato, poliestere o politetrafluoroetilene (PTFE). Le membrane possono essere acquistate commercialmente con o senza un gel proteico (tipicamente collagene), oppure il gel può essere acquistato separatamente e aggiunto. La dimensione del poro può essere regolata in base alle dimensioni della cella. Mentre le dimensioni dei pori sono disponibili da 0,4 - 8,0 m, solo i pori da 3,0 a 8,0 m sono abbastanza grandi per la migrazione cellulare. Il saggio di invasione è stato utilizzato per determinare l'efficacia degli inibitori sulla capacità delle cellule di migrare e invadere. Pur mancando l'esatto microambiente tumorale presente in vivo, il test dell'invasione in vitro è utile per lo screening di molte condizioni in breve tempo riducendo al minimo la necessità di modelli animali. L'obiettivo di questi esperimenti è confrontare l'espressione genica di oncogeni sospetti e determinare gli effetti sul comportamento delle cellule tumorali e sull'aggressività della malattia usando il saggio di invasione in vitro e altri test. Nel complesso, il test di invasione fornisce risultati coerenti, quantitativi e rapidi per determinare il potenziale metastatico, pur essendo un metodo relativamente economico, semplice e adattabile.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

Il saggio di invasione in vitro utilizza una matrice ricca di proteine in una camera di Boyden per misurare la capacità delle cellule coltivate di passare attraverso la matrice e una membrana porosa in un processo analogo alle fasi iniziali della metastasi delle cellule tumorali. Le cellule testate possono essere modificate per l'espressione genica o trattate con inibitori per testare i cambiamenti nel potenziale di invasione. Questo esperimento testa il fenotipo aggressivo delle cellule tumorali mammarie dei topi per scoprire e caratterizzare i potenziali oncogeni che promuovono l'invasione cellulare. Questa tecnica, tuttavia, può essere versatile e adattata a molte applicazioni diverse. L'esperimento stesso può essere fatto in un giorno e i risultati vengono acquisiti dalla microscopia leggera in meno di un giorno. I risultati includono i conteggi del numero di celle invasori per il confronto e l'analisi. Il test di invasione in vitro è un metodo rapido, economico e chiaro per determinare il comportamento cellulare in una coltura che può essere utilizzata come valutazione iniziale prima di ulteriori sottovalutazioni di analisi in vivo.

Questo metodo di invasione in vitro attraverso una matrice proteica è stato utilizzato per valutare i fenotipi aggressivi e i comportamenti cellulari oncogeni delle cellule tumorali dei topi con espressione alterata della proteina delle dita di zinco , C3H88. In concomitanza con altri approcci che esaminano anche la migrazione e la crescita delle cellule in ambienti 3D, si è scoperto che livelli più elevati di espressione di c3h8 nelle linee cellulari tumorali, ...

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Il saggio di invasione delle cellule in vitro viene utilizzato per misurare il potenziale della metastasi del cancro quantificando il potenziale cellulare per l'invasione e la migrazione utilizzando inserti di coltura cellulare contenenti matrice proteica. Si sfida nommossa alle cellule di migrare attraverso la matrice proteica e una membrana porosa, verso un chemioattraente, e poi quantificate mediante microscopia leggera.

L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Questo protocollo, il saggio di invasione in vitro, è uno strumento utile per misurare quantitativamente la capacità delle linee cellulari di migrare attraverso una matrice ricca di proteine e passare attraverso una membrana porosa, in un processo simile alle prime fasi dell'invasione delle cellule tumorali. Queste linee cellulari possono essere geneticamente alterate al fine di esprimere es oltre un gene o di avere una ridotta espressione di un gene al fine di determinare se quel gene gioca un ruolo nella migrazione cellulare o nell'invasione cellulare. Molti tumori aggressivi comportano cambiamenti drammatici nel comportamento cellulare, tra cui l'aumento della migrazione e dell'invasione.Quindi questo saggio di invasione in vitro può permetterci di comprendere meglio i geni e altri fattori coinvolti in questo processo. Per iniziare questa procedura, far crescere le cellule tumorali mammarie del topo aderenti in un pallone T25 a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e umidità del 100% fino a quando non sono confluenti dal 70% al 90% per il primo giorno dell'esperimento. Recuperare gli inserti della camera Boyden dallo stoccaggio e trasferirli in una cappa di coltura cellulare per riscaldarli a temperatura ambiente per 20 minuti.Utilizzare tre inserti per generare dati statisticamente validi per ogni riga di cella per ogni esperimento. E poi aggiungere 500 microlitri dei supporti DMEM pre-riscaldati senza siero agli inserti in modo che la membrana porosa e il gel siano idratati su entrambi i lati. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e umidità del 100% per almeno due ore.Successivamente, preparare le cellule rimuovendo il terreno di crescita e risciacquando le cellule con cinque millilitri di HBSS. Rimuovere l'HBSS e aggiungere un millilitro della soluzione EDTA allo 0,25%. Incubare a 37 gradi Celsius per uno o cinque minuti o fino a quando le cellule appaiono arrotondate o mostrano segni di distacco.Quindi toccare delicatamente il pallone per staccare tutte le cellule. Sospendere di nuovo le celle in cinque millilitri di DMEM con 10%FBS. E trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri.Centrifugare le cellule e 1000 volte g per cinque minuti per pellettare delicatamente le cellule. Rimuovere il supporto e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di DMEM senza siero. Ripetere il processo di centrifugazione e nuova sospensione due volte in più per un totale di tre lavaggi.Successivamente, sospendere completamente le cellule negli ultimi cinque millilitri di DMEM senza siero e assicurarsi che non ci siano grumi di cellule. Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare assicurandosi di contare solo le cellule vitali. E diluire la sospensione cellulare a 50.000 cellule per millilitro in cinque millilitri di DMEM senza siero.Quindi, rimuovere il piatto con gli inserti dall'incubatore e aspirare delicatamente il supporto da un inserto. Sollevare l'inserto e aspirare il supporto dal pozzo. Lavorando rapidamente, aggiungere il chemioattrattante alla camera inferiore.Posizionare l'inserto nel pozzo e, per un piatto da 24 porri, aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare all'inserto. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria su entrambi i lati della membrana. Restituire il piatto all'incubatore di coltura cellulare per 22 ore.Dopo 22 ore, preparare una soluzione di paraformaldeide all'1% e un X PBS per la fissazione. In un piatto pulito da coltura cellulare da 24 pozzetti, aggiungere un millilitro del fissatore ai singoli pozzi in modo che ce ne sia un pozzo per ogni inserto. Quindi, preparare la soluzione di colorazione dello 0,1% di viola cristallino in una soluzione di PBS con 10%etanolo.Aggiungere un millilitro di questa soluzione di colorazione a un pozzo pulito per ogni inserto. Utilizzando le forcep, rimuovere ogni inserto uno alla volta. Posizionare un batuffolo di cotone sterile all'interno di ogni inserto e tamponare il lato superiore della membrana per rimuovere eventuali cellule non migrate.Ripetere questo processo con un secondo batuffolo di cotone. Successivamente, rimuovere tutti i supporti rimanenti dall'interno dell'inserto e aggiungere 750 microlitri di PBS per lavare via eventuali celle staccate. Rimuovere il PBS e ripetere il lavaggio con PBS fresco.Quindi posizionare l'inserto in un pozzo contenente fissatore per fissare le cellule migrate sul lato inferiore della membrana. Ripetere questo processo per tutti gli inserti e lasciare che gli inserti si fissino per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere ogni inserto uno alla volta dal suo pozzo e lavarlo con 750 microlitri di PBS.Posizionare l'inserto in una soluzione di colorazione ben contenente e lasciarlo per 15 minuti per macchiare tutte le celle migrate e fisse. Quindi rimuovere gli inserti e immergerli in un becher contenente acqua distillata fino a quando l'acqua che scorre dall'inserto è limpida. Rimuovere eventuali goccioline d'acqua in eccesso e posizionare l'inserto lateralmente su un pezzo di carta da filtro.Lasciare asciugare all'aria gli inserti. Preparare la membrana per l'imaging etichettando un vetrino di vetro pulito per ogni inserto e posizionando una piccola goccia di olio ad immersione al microscopio al centro di ogni diapositiva. Utilizzando un bisturi, tagliare intorno al perimetro della membrana all'interno dell'inserto di plastica per staccare la membrana.Utilizzare le forcep per rimuovere la membrana e posizionarla sopra la goccia d'olio sullo scivolo etichettato. Utilizzando un microscopio composto, visualizzare le celle a cinque volte, 10 volte o 20 volte l'ingrandimento. Per la quantificazione, scatta più immagini non sovrapposte con un ingrandimento 10 volte superiore.Determinare il numero totale di celle o celle invasori per area per tutti i campioni. Per ogni esperimento, eseguire ogni condizione nel saggio con tre inserti replicati e ripetere più volte per risultati statisticamente utili. In questo studio, l'invasione in vitro attraverso una matrice proteica viene utilizzata per valutare i fenotipi aggressivi nei comportamenti cellulari oncogeni delle cellule tumorali mammarie del topo con espressione alterata della proteina delle dita di zinco, Zc3h8.Livelli più elevati di espressione di Zc3h8 sono osservati nelle linee cellulari tumorali o dall'espressione mediata del promotore da un plasmide, con conseguente rapidi tassi di proliferazione cellulare, migrazione rapida, crescita in ambienti 3D e aumento dell'invasione all'interno del saggio di invasione in vitro. Al contrario, la diminuzione dell'espressione da parte dei costrutti di shRNA si traduce in proliferazione, migrazione e invasione meno aggressive. Mentre l'invasione cellulare diminuisce al momento dell'abbattimento dello shRNA dell'espressione Zc3h8, quell'invasione viene salvata quando l'espressione viene salvata.La tecnica di dosaggio dell'invasione in vitro è estremamente utile in quanto è un approccio rapido, economico, flessibile e relativamente facile allo studio del comportamento cellulare. Le cellule coltivate in coltura sono facili da manipolare geneticamente. Possono anche essere testati per mutazioni specifiche.Il sistema di invasione in vitro consente anche l'analisi di inibitori di piccole molecole e agenti biologici come i microRNA per i loro effetti sulla migrazione e l'invasione cellulare. Questo saggio include anche una grande quantità di flessibilità, consentendo l'alterazione del contenuto proteico della matrice, delle dimensioni dei pori e del chemioattrattante.

Research

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