Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
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이 작품은 건강의 국가 학회에서 교부금 R15CA169978에 의해 지원되었다. 추가 기금은 빌라노바 대학에서 왔다.

모든 실험과 방법은 빌라노바 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인으로 수행되었다.
1. 배양 마우스 유방 종양 세포에서 유전자 발현
<ol><li>먼저, 검사할 세포주를 준비한다.</li>
	<li>
BALB/cV 마우스의 사육 식민지를 사용하십시오. 이 마우스는 마우스 유방 종양 바이러스의 BALB/cV 긴장을, 우유6,7에있는 새끼에...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB/cV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus.">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li><li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB/cV+mice.">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

시험관 내 침범 분석법은 암세포 침입을 촉진하는 요인을 연구하기 위한 저렴하고, 신속하고, 정량적이며, 간단한 방법이다. 유방암은 여자 중 가장 일반적으로 진단된 암입니다. 유방암의 3개의 중요한 특수형의, 삼중 음성, (또는 ER-, PR-, HER2/neu -), 가장 공격적이고, 전이할 가능성이 가장 높으며, 가장 치명적인9. 따라서 전이를 초래하는 유전자와 발현을 이해하면 질병에...

시험관 내 침범 분석은 전이의 첫 번째 단계와 유사하게 단백질 코팅 막을 통해 이동하는 세포의 능력을 측정할 때 유용한 도구가 될 수 있습니다. 악성 암세포의 주요 특징은 인근 조직을 통해 이동하고 침입하는 능력입니다. 퍼지거나 전이한 암은 더 많은 처리 도전을 제기하고 현지화한 종양이 취급하기 쉽고 장기 생존의 더 높은 비율이 있는 동안 장기 생존의 더 낮은 비율이 있습니다. 전이하기 위하여는, 암세포는 1 차적인 종양을 떠나 순환계 또는 림프계로 이동해야 합니다, 세포외 매트릭스 및지하 막을 통과하는 것을 요구하는 프로세스 1. 상피 중간엽 전이 (EMT)라고하는 과정에서 종양 세포는 세포 접촉을 끊고, 방향을 마이그레이션하고, 근처의 혈액 이나 림프관을 침범해야합니다. 이 전이 폭포의 초기 단계는 이 단계가 암을 치명적으로 만들 수 있는 무슨이기 때문에 큰 관심사입니다. 전이의 초기 단계에 관여하는 유전적 및 후생유전학적 요인은 많은 양의 연구의 초점이지만, 정확하고 신뢰할 수 있는 실험 도구는 생체 내 및 시험관 내에서 이러한 초기 단계를 테스트하는 데 필요합니다.
연한 한천 분석실험과 같은 3D 환경에서 상처 치유(스크래치) 분석또는 성장과 같은 세포 이동의 변화를 측정하는 도구는 전이의 초기 단계를 측정하는 실험적 방법의 필요성을 부분적으로 해결할 수 있지만, 침략을 측정하는 분석법은 프로세스가 복잡한 종양 미세 환경 내의 바디에서 생기기 때문에 더 도전적입니다. 침범 및 전이에서 중요한 인자를 결정하기 위해 약물 또는 유전자 변경을 스크리닝하기 위한 목적으로, 배양된 세포와 함께 시험관내에서 사용할 수 있고생체 내에서 전이성 세포가 직면한 과제를 모방할 수 있는 시스템은 침략 분석2, 3. 유방암은 여자에 있는 암의 가장 일반적으로 진단된 모형이고 여자에 있는 암 죽음의 두 번째 주요한 원인, 그래서 유방암 세포 침략 및 전이에 책임 있는 유전자를 이해하는 것은 공중 위생을 위해 매우 중요합니다. 더욱이, 마우스 세포는 유방암과 그것의 진행을 공부하기위한 유용한 모델 시스템입니다.
시험관 내 침략 분석제는 성장 매체의 2개의 약실이 다공성 막3에의해 분리되는 Boyden 챔버 어셈블리를 기반으로 합니다. 종양 미세 환경을 모방하기 위해, 단백질이 풍부한 겔은 또한 다른 한 챔버에서 화학력으로부터 세포를 분리하고 지하 막 장벽으로 작용하기 위해 포함된다. 화학 유착제로 이동하기 위하여는, 세포는 먼저 단백질이 풍부한 방벽을 통과하고 다공성 막을 통과해야 합니다 - 전이성 세포가 기질을 통해 이동하는 방법과 유사한 프로세스. 단백질이 풍부한 겔은 실험의 필요에 따라 변경될 수 있지만, 일반적으로 콜라겐, 또는 지하 막 추출물(예를들어, 마트리겔)4로 구성된다. 단백질, 프로테오글리칸 및 성장 인자의 복잡한 혼합물이지만 대부분 라미닌과 콜라겐 IV 4,5로구성됩니다. 세포는 일반적으로 폴리 카보네이트, 폴리 에스테르 또는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)로 만들어진 다공성 멤브레인을 통과해야합니다. 멤브레인은 단백질 겔(전형적으로 콜라겐)의 유무에 관계없이 상업적으로 구입될 수 있거나, 또는 겔을 별도로 구입하여 첨가할 수 있다. 기공 크기는 세포 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 공극 크기는 0.4 - 8.0 μm에서 사용할 수 있지만 3.0 - 8.0 μm의 기공만 세포 이동에 충분히 큽합니다. 침략 분석은 세포가 이동하고 침입하는 능력에 대한 억제제의 효과를 결정하는 데 사용되었습니다. 생체 내에서 존재하는 정확한 종양 미세 환경이 부족하면서, 시험관내 침습 분석실험은 동물 모델의 필요성을 최소화하면서 짧은 시간에 많은 조건을 스크리닝하는 데 유리하다. 이러한 실험의 목적은 의심되는 종양유전자의 유전자 발현을 비교하고 시험관내 침범 분석 및 기타 검사를 사용하여 암세포 행동 및 질병 공격성에 미치는 영향을 결정하는 것이다. 전반적으로, 침략 분석법은 상대적으로 저렴하고 간단하며 적응 가능한 방법인 동시에 전이성 전위를 결정하기 위한 일관되고 정량적이며 신속한 결과를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

시험관 내 침범 분석술은 보이든 챔버에서 단백질이 풍부한 매트릭스를 사용하여 암세포 전이의 초기 단계와 유사한 과정에서 배양된 세포가 매트릭스 및 다공성 막을 통과하는 능력을 측정한다. 시험된 세포는 유전자 발현을 위해 변경되거나 억제제로 처리되어 침략 잠재력의 변화를 테스트할 수 있다. 이 실험은 마우스 유방 종양 세포의 공격적인 표현형을 시험하여 세포 침입을 촉진하는 잠재적인 종양 유전자를 발견하고 특성화합니다. 그러나 이 기술은 다재다능하고 다양한 응용 분야에 적용될 수 있습니다. 실험 자체는 하루에 할 수 있고 결과는 하루 안에 가벼운 현미경 검사법에 의해 얻어집니다. 결과는 비교 및 분석을 위한 침입 세포의 수의 수를 포함합니다. 시험관 내 침범 분석법은 생체 외 분석법에 더 관여하기 전에 초기 평가로서 사용될 수 있는 배양에서 세포 거동을 결정하기 위한 신속하고 저렴하며 명확한 방법이다.

단백질 매트릭스를 통한 시험관내 침습의 이러한 방법은 아연 핑거 단백질 ZC3H8 8의 변경된 발현을 가진 마우스 유방 종양세포의 공격적인 표현형 및 종양발생 세포 거동을 평가하기 위해 사용되었다. 또한 3D 환경에서 세포 이동 및 성장을 검사하는 다른 접근법과 함께, 종양 세포주에서 Zc3h8의 발현 수준이 높거나 플라스미드에서 프로모터 매개 발현에 ?...

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The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

본 프로토콜, 체외 침입 분석은, 단백질이 풍부한 매트릭스를 통해 이동하고 다공성 막을 통과하는 세포 라인 능력을 정량적으로 측정하는 유용한 도구이며, 암세포 침입의 초기 단계와 유사한 과정이다. 이러한 세포주는 유전자를 과도하게 표현하거나 유전자가 세포 이동 또는 세포 침입에 중요한 역할을 하는지 결정하기 위해 유전자의 발현을 감소시키기 위해 유전적으로 변경될 수 있다. 많은 공격적인 암은 증가한 이주 및 침략을 포함하여 세포 행동에 있는 극적인 변경을 관련시킵니다.그래서 이 체외 침입 분석은 우리가 이 과정에 관련있는 유전자 및 그밖 요인을 더 잘 이해하는 것을 허용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위하여는, 실험의 1일 동안 70%에서 90%의 컨런트가 될 때까지 37°C에서 T25 플라스크에서 부착마우스 유방 종양 세포를 5%의 이산화탄소와 100% 습도로 성장시다. 보관에서 보이든 챔버 인서트를 검색하고 20 분 동안 실온으로 따뜻하게 세포 배양 후드로 옮기.세 번의 인서트를 사용하여 각 실험에 대해 각 셀라인에 대해 통계적으로 유효한 데이터를 생성합니다. 그런 다음 전동된 세럼이 없는 DMEM 매체의 500마이크로리터를 삽입에 추가하여 다공성 멤브레인과 젤이 양쪽에 수분을 공급합니다. 37도에서 이산화탄소 5%, 습도 100%로 최소 2시간 동안 배양합니다.그 후, 성장 매체를 제거하고 HBSS의 5밀리리터로 세포를 헹구어 세포를 준비한다. HBSS를 제거하고 0.25%의 트립신 EDTA 솔루션1밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1~5분 동안 또는 세포가 둥글게 나타나거나 분리의 징후를 보일 때까지 배양합니다.그런 다음 플라스크를 부드럽게 눌러 모든 셀을 분리합니다. 10%의 FBS로 DMEM의 5밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그리고 세포 현탁액을 멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송한다.세포를 원심 분리하고 세포를 부드럽게 펠릿하는 5 분 동안 1000 배 g. 미디어를 제거하고 세럼이없는 DMEM의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 총 세개의 세차재에 대해 원심분리 및 다시 일시 중단 프로세스를 두 번 추가로 반복합니다.그 후, 혈청이 없는 DMEM의 마지막 5밀리리터에서 세포를 철저히 다시 중단하고 세포의 덩어리가 없는지 확인합니다. 혈종계를 사용하여 셀 농도를 결정하여 실행 가능한 세포만 계산합니다. 그리고 혈청없는 DMEM의 5 밀리리터에서 밀리리터 당 50, 000 세포로 세포 현탁액을 희석시.다음으로 인큐베이터에서 인서트가 있는 접시를 제거하고 삽입물에서 미디어를 부드럽게 흡인합니다. 인서트를 들어 올리고 우물에서 미디어를 흡인시합니다. 신속하게 작업하면 화학 요법을 하부 챔버에 추가하십시오.인서트를 우물에 넣고 24개의 웰 디쉬의 경우 셀 서스펜션 500마이크로리터를 삽입에 넣습니다. 멤브레인의 양쪽에 기포가 없는지 확인하십시오. 22 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다.22시간 후, 고정을 위해 1%의 파라포름알데히드와 1개의 X PBS의 솔루션을 준비합니다. 깨끗한 24 개의 잘 세포 배양 접시에 고정의 밀리리터를 개별 우물에 추가하여 각 삽입에 대해 잘 합니다. 그런 다음, 10%에탄올로 PBS용액으로 0.1%의 크리스탈 바이올렛의 염색 용액을 준비한다.이 염색 용액1밀리리터를 각 인서트로 깨끗하게 잘 할 수 있습니다. 집게를 사용하여 각 삽입을 한 번에 하나씩 제거합니다. 멸균 면봉을 각 인서트 내부에 놓고 멤브레인의 상부를 면봉하여 마이그레이션되지 않은 세포를 제거합니다.두 번째 면봉으로 이 과정을 반복하십시오. 다음으로, 삽입 의 내부에서 남은 매체를 제거하고 분리 된 세포를 씻어 PBS의 750 마이크로 리터를 추가합니다. PBS를 제거하고 신선한 PBS로 세척을 반복합니다.그런 다음 멤브레인의 밑면에 이동된 세포를 고정하기 위해 고정을 포함하는 우물에 삽입을 배치합니다. 모든 인서트에 대해 이 프로세스를 반복하고 인서트가 실온에서 15분 동안 수정하도록 합니다. 그런 다음 각 삽입을 우물에서 한 번에 하나씩 제거하고 PBS 750 마이크로리터로 세척합니다.인서트를 염색 용액을 잘 넣고 15분 동안 그대로 두어 마이그레이션된 모든 셀과 고정된 셀을 얼룩지게 합니다. 그런 다음 인서트를 제거하고 삽입물에서 흐르는 물이 맑을 때까지 증류수를 포함하는 비커에 담급드세요. 여분의 물방울을 제거하고 삽입물을 필터 용지 에 옆으로 놓습니다.인서트가 공기를 건조하게 합니다. 각 삽입에 대해 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 라벨을 부착하고 각 슬라이드의 중앙에 작은 현미경 침지 오일을 배치하여 이미징을위한 멤브레인을 준비합니다. 메스를 사용하여 플라스틱 인서트 내부의 멤브레인 둘레를 잘라 멤브레인을 분리합니다.집게를 사용하여 멤브레인을 제거하고 라벨이 부착된 슬라이드의 오일 드롭 위에 놓습니다. 복합 현미경을 사용하여 세포를 5배, 10배 또는 20배 배율로 봅니다. 정량화의 경우 여러 개의 겹치지 않는 이미지를 10배 배율로 가져 가라.모든 샘플에 대해 영역당 침입 셀 또는 셀의 총 수를 결정합니다. 각 실험에 대해 세 개의 복제 인서트와 함께 분석에서 각 조건을 수행하고 통계적으로 유용한 결과를 위해 여러 번 반복합니다. 이 연구에서는, 단백질 매트릭스를 통한 체외 침입은 아연 핑거 단백질, Zc3h8의 변경된 발현을 가진 마우스 유방 종양 세포의 종양 발생 세포 거동에서 공격적인 표현형을 평가하는 데 사용된다.Zc3h8 발현의 상부는 종양 세포주 또는 플라스미드로부터 발기인 중재발현에 의해 볼 수 있으며, 세포 증식, 빠른 이동, 3D 환경에서의 성장 및 체외 침입 분석 내의 증가된 침범의 결과로 생긴다. 반대로, shRNA 구조에 의한 발현감소는 덜 공격적인 확산, 이주 및 침입을 초래합니다. Zc3h8 표현의 shRNA 넉다운시 세포 침공이 감소하지만, 그 침략은 표현이 구출될 때 구출됩니다.체외 침입 분석 기술은 세포 행동을 연구하는 신속하고 저렴하며 유연하며 비교적 쉬운 접근 방식이기 때문에 매우 유용합니다. 배양에서 자란 세포는 유전적으로 조작하기 쉽습니다. 그(것)들은 또한 특정 돌연변이를 위해 시험될 수 있습니다.체외 침입 시스템은 또한 세포 이동 및 침략에 그들의 효력을 위해 마이크로 RNA 같이 작은 분자 억제제 뿐만 아니라 생물학 에이전트의 분석을 허용합니다. 이 분석은 또한 매트릭스, 모공 크기 및 화학 요법의 단백질 함량의 변경을 허용하는 유연성의 큰 양을 포함한다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Bemisia tabaci Cytogenetic 기술을 사용 하 여 계란 수정 속도 결정

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...