Name: the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nden Grant R15CA169978 tarafından destekleniyordu. Villanova Üniversitesi 'nden ek finansman geldi.

Tüm deneyler ve Yöntemler Villanova Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından yetkilendirilmiş olarak gerçekleştirildi.
1. kültürlü fare mammary tümör hücrelerinde gen Ifadesi
<ol><li>İlk olarak, test edilecek hücre satırlarını hazırlayın.</li>
	<li>
BALB/cV fareler bir üreme kolonisi kullanın. Bu fareler fare meme tümör virüsü Balb/cV strain taşımak, süt6,7i?...

<ol>
	<li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion.">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells.">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB/cV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus.">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li><li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB/cV+mice.">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8.">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).</li><li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis.">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).</li><li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules.">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339 (2011).</li><li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-98+inhibits+the+proliferation,+invasion,+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2.">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), (2018).</li><li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma.">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li><li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition.">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li></ol>

İn vitro invazif tahlil, kanser hücresi istilasını teşvik eden faktörleri incelemek için ucuz, hızlı, nicel ve basit bir yöntemdir. Meme kanseri kadınlar arasında en sık teşhis edilen kanserdir. Meme kanseri üç büyük alt türleri, Üçlü negatif, (veya ER-, PR-, HER2/Neu-), en agresif, en metasrat ve en ölümcül9muhtemeldir. Bu nedenle, metastatik sonuca neden olan genler ve ifadeyi anlamak, hastalığın yeni terapötik hedeflerini ve genetik belirteçlerini bulmanı...

İn vitro invazyon tahlil bir hücre yeteneğini bir protein kaplı membran üzerinden göç için ölçüm yaparken yararlı bir araç olabilir, metasjen ilk adımlara benzer. Malign kanser hücrelerinin önemli bir özelliği yoluyla göç ve yakın dokularda istila yeteneğidir. Yayılan veya metaslenmiş kanser daha fazla tedavi zorlukları pozlar ve uzun vadeli hayatta kalma düşük oranlar vardır, lokalize tümörlerin tedavisinde daha kolay ve uzun vadeli hayatta kalma yüksek oranlar var. Metassel için, kanser hücrelerinin primer tümör bırakmak ve dolaşım veya lenfatik sisteme göç gerekir, ekstrasellüler matris ve Bodrum membranı üzerinden geçen gerektiren bir süreç1. Epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) denilen süreçte, tümör hücreleri hücre-hücre temaslarını kırmalı, yön geçirmeli ve yakındaki kan veya lenf damarlarını işgal etmelidir. Bu adımlar kanser ölümcül yapabilir ne olduğundan bu metastaf Cascade ilk adımlar büyük ilgi vardır. Metastakların erken adımlarında yer alan genetik ve epigenetik faktörler, büyük miktarda araştırmanın odağı olmaktadır, ancak bu erken adımları hem in vivo hem de vitro olarak test etmek için doğru ve güvenilir deneysel araçlar gereklidir.
Yara iyileşmesi (çizik) gibi hücre göç değişiklikleri ölçmek için araçlar veya Soft agar gibi 3D ortamlarda büyüme kısmen metastazın erken adımlarını ölçmek için deneysel yöntemler ihtiyacını ele alabilir, ama bir tahlil invazyonu ölçmek için karmaşık bir tümör mikroçevre içinde vücutta meydana beri daha zorlu. İnvazyon ve metastaz açısından önemli faktörleri belirlemek için ilaçların veya gen değişikliklerinin taranması amacıyla, kültürlü hücrelerle içinde vitro olarak kullanılabilecek bir sistem ve in vivo metastatik hücrelerin karşılaştığı zorlukları taklit eden invazif tahlil2, 3' ü yapın. Meme kanseri kadınlarda kanser en sık teşhis türü ve kadınlarda kanser ölümü ikinci önde gelen nedeni, bu yüzden meme kanseri hücre invazyonu ve metastatik sorumlu genler anlayış kamu sağlığı için kritik öneme sahiptir. Dahası, fare hücreleri meme kanseri ve ilerlemesini incelemek için yararlı bir model sistemidir.
İn vitro invazyon tahlil iki büyüme medya odaları gözenekli bir membran ile ayrılır Boyden odası montaj dayanmaktadır3. Tümör mikroortamını taklit etmek için, bir oda içindeki hücreleri diğer bir kemoatraktan 'dan ayıran ve bir Bodrum membran bariyeri olarak hareket eden protein bakımından zengin bir jel de dahil edilir. Chemoattractant doğru göç etmek için, hücreler önce protein açısından zengin bariyer geçmesi gerekir sonra gözenekli membran geçmesi-metastatik hücrelerin stroma üzerinden göç nasıl benzer bir süreç. Protein açısından zengin jel denemenin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir, ancak genellikle kollajen veya Bodrum membran ekstresi oluşur (örneğin, Matrigel)4. Bu proteinler, proteoglikanlar ve büyüme faktörlerinin karmaşık bir karışımıdır, ancak çoğunlukla lamininlerin ve kollajen IV 4,5oluşur. Hücreler daha sonra genellikle polikarbonat, polyester, veya Politetrafloroetilen (PTFE) yapılmış bir gözenekli membran geçmesi gerekir. Membranlar, bir protein jeli (genellikle collagens) ile veya olmadan ticari olarak satın alınabilir veya jel ayrı olarak satın alınabilir ve eklenebilir. Gözenek boyutu hücre boyutuna göre ayarlanabilir. Gözenek boyutları 0,4-8,0 μm ' den itibaren kullanılabilir durumdayken, sadece 3,0-8,0 μm ' den gelen gözenekler hücre göçü için yeterince büyüktür. İstila tahlil, hücrelerin göç ve istila yeteneğine karşı inhibitörlerinin etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. İçinde bulunan tam tümör mikroçevre eksik iken Vivo, in vitro invazyon tahlil hayvan modelleri için ihtiyaç minimize ederken kısa bir süre içinde birçok koşul tarama yararlıdır. Bu deneylerin amacı, şüpheli onkogenler gen ifadesi karşılaştırmak ve kanser hücresi davranış ve hastalık saldırganlık içinde vitro invazyon tahlil ve diğer testleri kullanarak etkilerini belirlemek için. Genel olarak, invazif tahlil, nispeten ucuz, basit ve uyarlanabilir bir yöntem olmakla beraber metastatik potansiyeli belirlemek için tutarlı, nicel ve hızlı sonuçlar sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical cenrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>high glucose, GlutaMAX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invasion Chambers (24-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354480</td>
			<td>Cat. #354481 for 6-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Transfection Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Transfer pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse mammary tumor cells in an in vitro invasion assay as a measure of oncogenic cell behavior

İn vitro invazyon assay bir Boyden odasında bir protein açısından zengin matris kullanır ve kanser hücresi metastani ilk adımlarına benzer bir süreçte matris ve gözenekli bir membran geçmesine kültürlü hücrelerin yeteneğini ölçmek için. Test edilen hücreler, gen ifadesi için değiştirilebilir veya invazyon potansiyelinin değişikliklerini test etmek için inhibitörler ile tedavi edilebilir. Bu deney, hücre istilasını teşvik eden potansiyel onkogenleri keşfetmek ve karakterize etmek için fare meme tümör hücrelerinin agresif fenotipini sınar. Ancak bu teknik çok yönlü olabilir ve birçok farklı uygulamaya adapte edilebilir. Deney bir gün içinde yapılabilir ve sonuçlar ışık mikroskobu tarafından bir günden az bir sürede elde edilir. Sonuçlar, karşılaştırma ve analiz için işgalci hücrelerin sayısının sayılarını içerir. İn vitro invazyon assay, daha önce daha fazla yer alan vivo assays olarak ilk değerlendirme olarak kullanılabilecek bir kültürde hücre davranışını belirlemek için hızlı, ucuz ve net kesilmiş bir yöntemdir.

Bir protein matrisinin içinde bulunan bu in vitro invazyon yöntemi, fare meme tümör hücrelerinin agresif fenotipleri ve Onkojenik hücre davranışlarını, çinko parmak proteini ZC3H88' in değiştirilmiş ifadesiyle değerlendirmek için kullanılmıştır. Aynı zamanda 3D ortamlarda hücre göç ve büyüme incelemek diğer yaklaşımlar ile birlikte, bu tümör hücre hatları Zc3h8 ifade daha yüksek düzeyde, veya bir Plasmid tarafından Promoter-arac?...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior at JoVE.com

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Bu protokol, in vitro invazyon test, kantitatif bir protein açısından zengin matris yoluyla göç etmek ve gözenekli bir membran geçmesi için bir hücre hatları yeteneğini ölçmek için yararlı bir araçtır, kanser hücresi invazyonunun erken aşamalarında benzer bir süreç. Bu hücre hatları genetik olarak bir geni ifade etmek veya bu genin hücre göçünde mi yoksa hücre istilasında mı rol oynadığını belirlemek için genin ekspresyonunu azaltmak için değiştirilebilir. Birçok agresif kanserler hücre davranışıdramatik değişiklikler içerir, artan göç ve invazyon da dahil olmak üzere.Yani bu in vitro invazyon tisali, bu süreçte yer alan genleri ve diğer faktörleri daha iyi anlamamızı sağlayabilir. Bu prosedüre başlamak için, 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ve %100 nem oranıyla bir T25 şişesinde yapışkan fare meme tümörü hücrelerini büyütün ve deneyin ilk günü için %70 ila %90 oranında konkaya olurlar. Boyden oda ekler depolama dan almak ve 20 dakika oda sıcaklığına ısınmak için bir hücre kültür başlık aktarın.Her deneme için her hücre satırı için istatistiksel olarak geçerli veriler oluşturmak için üç kesici uç kullanın. Ve sonra gözenekli membran ve jel her iki tarafta sulu böylece eklere önceden ısıtılmış serum içermeyen DMEM medya 500 mikrolitre ekleyin. En az iki saat boyunca %5 karbondioksit ve %100 nem ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, büyüme ortamını kaldırarak ve hücreleri beş mililitre HBSS ile durulayarak hücreleri hazırlayın. HBSS'yi çıkarın ve bir mililitre 0,25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derecede 1 ila 5 dakika veya hücreler yuvarlak görünene veya kopma belirtileri gösterene kadar kuluçkaya yatın.Sonra yavaşça tüm hücreleri ayırmak için şişe dokunun. %10 FBS ile beş mililitre DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. Ve hücre süspansiyonuna steril 15 mililitrelik santrifüj tüpü aktarın.Hücreleri santrifüj ve 1000 kez g beş dakika yavaşça hücreleri pelet. Ortamı çıkarın ve beş mililitre serumsuz DMEM'de peleti yeniden askıya alın. Santrifüj ve yeniden askıya alma işlemini toplam üç yıkıntı için iki kez daha tekrarlayın.Bundan sonra, serumsuz DMEM'in son beş mililitresindeki hücreleri iyice yeniden askıya alın ve hücre kümelerinin olmadığından emin olun. Hücre konsantrasyonu belirlemek için bir hemositometre kullanın sadece canlı hücreleri saymak emin olun. Ve hücre süspansiyonu 50,000 hücre mililitre başına serumsuz DMEM beş mililitre seyreltmek.Daha sonra, kuvözden ekler ile çanak çıkarın ve yavaşça bir eklemek medya aspire. Kesici ucu kaldırın ve medyayı kuyudan aspire edin. Hızlı çalışma, alt odaya chemoattractant ekleyin.Sos'u kuyuya yerleştirin ve 24 kuyuluk için, hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini eklemeye ekleyin. Membranın her iki tarafında hava kabarcıkları olmadığından emin olun. 22 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için çanak dönün.22 saat sonra fiksasyon için %1 paraformaldehit ve bir X PBS çözeltisi hazırlayın. Temiz bir 24 iyi hücre kültürü çanak, her eklemek için bir kuyu var, böylece bireysel kuyulara fiksatif bir mililitre ekleyin. Daha sonra% 10 etanol ile PBS bir çözeltisi% 0.1 kristal menekşe boyama çözeltisi hazırlayın.Her kesici uç için temiz bir kuyuya bu boyama çözeltisinin bir mililitresini ekleyin. Forceps kullanarak, her kesici uç birer birer kaldırın. Her kesici uç içine steril bir pamuklu bez yerleştirin ve herhangi bir göç edilmemiş hücreleri kaldırmak için membranın üst tarafında bez.Bu işlemi ikinci bir pamuklu bez ile tekrarlayın. Ardından, kalan ortamları kesici uçtan çıkarın ve ayrılmış hücreleri temizlemek için 750 mikrolitre PBS ekleyin. PBS'yi çıkarın ve taze PBS ile yıkayın.Daha sonra membranın alt tarafında geçirilen hücreleri düzeltmek için bir kuyu içeren fiksatif içine eklemek yerleştirin. Tüm kesici uçlar için bu işlemi tekrarlayın ve uçların oda sıcaklığında 15 dakika boyunca düzeltilmesine izin verin. Bundan sonra, her bir inserti kuyudan birer birer çıkarın ve 750 mikrolitre PBS ile yıkayın.Ekleyi iyi içeren bir boyama çözeltisine yerleştirin ve tüm geçirilen ve sabit hücreleri boyamak için 15 dakika bekletin. Daha sonra kesici uçları çıkarın ve uçtan akan su temizlenene kadar damıtılmış su içeren bir kabın içine batırın. Fazla su damlacıklarını çıkarın ve kesici ucu bir filtre kağıdının üzerine yanlara yerleştirin.Kesici uçların havayı kurutun. Her kesici uç için temiz bir cam mikroskop kaydırağı etiketleyerek ve her sürün ortasına küçük bir damla mikroskop daldırma yağı yerleştirerek membranı görüntülemeye hazırlayın. Bir neşter kullanarak, membran ayırmak için plastik eklemek içinde membran çevre etrafında kesti.Membranı çıkarmak ve etiketli slayttaki yağ damlasının üzerine yerleştirmek için forceps kullanın. Bileşik bir mikroskop kullanarak hücreleri beş kez, 10 kez veya 20 kez büyütmeyle görüntüleyin. Niceleme için, 10 kat büyütme de birden fazla çakışmayan görüntü alın.Tüm örnekler için alan başına toplam işgalci hücre veya hücre sayısını belirleyin. Her deneme için, her koşulu tahminde üç çoğaltma ucuyla gerçekleştirin ve istatistiksel olarak yararlı sonuçlar için birden çok kez yineleyin. Bu çalışmada, bir protein matrisi ile in vitro invitro invitro invazyon çinko parmak proteini, Zc3h8 değiştirilmiş ifade ile fare meme tümör hücrelerinin onkojenik hücre davranışlarında agresif fenotipleri değerlendirmek için kullanılır.Zc3h8 ekspresyonunun daha yüksek düzeyleri tümör hücre hatlarında veya plazmidden promotör aracılı ekspresyonda görülür, bu da hızlı hücre çoğalma hızları, hızlı göç, 3Boyutlu ortamlarda büyüme ve in vitro invazyon testinde artan tecavüzle sonuçlanır. Tersine, shRNA tarafından azalan ifade daha az agresif çoğalma, göç ve istila ile sonuçlanır. Zc3h8 ifadesinin SHRNA'nın yıkılması üzerine hücre istilası azalırken, ifade kurtarıldığında bu istila kurtarılır.Hücre davranışını incelemek için hızlı, ucuz, esnek ve nispeten kolay bir yaklaşım olduğu için in vitro invazyon testi tekniği son derece yararlıdır. Kültürde yetişen hücrelerin genetik olarak manipüle etmesi kolaydır. Hatta belirli mutasyonlar için test edilebilir.In vitro invazyon sistemi aynı zamanda hücre göçü ve invazyonu üzerindeki etkileri için mikro RNA'lar gibi küçük molekül inhibitörlerinin yanı sıra biyolojik ajanların analizine de olanak sağlar. Bu teşp aynı zamanda matris, gözenek boyutu ve kemoattractant protein içeriğinin değiştirilmesi için izin, esneklik büyük miktarda içerir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Sitogenetik teknikle Bemisia tabaci yumurta döllenme oranı belirleme

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...