Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of ProteinÃ¢â‚¬â€œProtein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique at JoVE.com

Denne undersøgelse blev delvis støttet af Japan Society for fremme af videnskab KAKENHI Grant nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for fremme af Science KAKENHI Grant nummer 15K09418 (til TM), et forskningsstipendium fra Kanehara Ichiro Medical Science Foundation og et forskningsstipendium fra Suzuken Memorial Foundation (alle til TM).

1. immunopræcipitation
Bemærk: vi brugte ikke-natriumdodecyl sulfat (SDS) lysis buffer og citrat eluering, som beskrevet i de følgende afsnit. Dog kan brugen af en alternativ in-House chromatinimmunpræcipitation teknik også anvendes til at forberede LC-MS/MS prøver.
<ol><li>Transfect-dyrkede celler med vektorer, der koger et epitop-tag alene eller et fusionsprotein. For at erhverve repræsentative data, overføre J774 celler (1 x 106) med vektorer kodning grøn fluorescerend...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

Vi har tidligere beskrevet en analyse af de oxidativ modifikationer af apolipoprotein B-100 i oxideret low-density lipoprotein ved hjælp LC-MS/MS indledes med en on-membran fordøjelse teknik6. I denne undersøgelse kombinerede vi denne teknik med immunopræcipitation og har identificeret flere calpain-6-associerede proteiner. Denne nye teknik repræsenterer en bekvem metode til screening for kandidat associerede proteiner. Calpain-6 er et ikke-proteolytisk medlem af den calpain proteolytiske fam...

Selv om proteiner spiller konstitutive roller i levende organismer, de er kontinuerligt syntetiseres, forarbejdes, og nedbrydes i det intracellulære miljø. Desuden interagerer intracellulære proteiner ofte fysisk og biokemisk, hvilket påvirker funktionen af den ene eller begge1,2,3. For eksempel er den direkte binding af spliceosome-associeret protein ligner CWC22 med eukaryote Translation Initierings faktor 4A3 (eIF4A3) nødvendig for samlingen af exon Junction Complex4. I overensstemmelse med dette, en eIF4A3 mutant, der mangler affinitet for CWC22 undlader at lette exon Junction komplekse-drevet mRNA splejsning4. Således er studiet af protein interaktioner afgørende for den præcise forståelse af fysiologisk regulering samt cellulære funktioner.
De seneste fremskridt i massespektrometri (MS) er blevet anvendt på den omfattende analyse af protein-protein interaktioner. For eksempel, co-udfældning af endogene proteiner eller eksogent indførte mærkede proteiner med deres associerede proteiner, efterfulgt af MS analyse, gør det muligt at identificere nye protein interaktioner5. Men, en stor flaskehals af MS/MS analyse er dårlig opsving fra trypticase fordøjer af protein prøver. Til gennemførelse af proteomiske analyser af celle lysater anvendes in-gel-og membran fordøjelsesteknikker generelt til at forberede MS/MS-prøver. Vi har tidligere sammenlignet en in-gel Fordøjelsesprocedure med en on-membran fordøjelse teknik6, og viste, at sidstnævnte var forbundet med bedre sekvens dækning. Polyvinylidendifluorid (PVDF) membran kan være egnet til dette formål, fordi det er mekanisk robust og modstandsdygtig over for høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler7,8, tillader enzymatisk fordøjelse af immobiliseret proteiner i tilstedeværelse af 80% acetonitril9. Desuden kan immobilisering på en membran fremkalde konformationelle ændringer i målproteiner, hvilket fører til forbedringer i trypticase fordøjelse effektivitet10. I overensstemmelse hermed, i denne artikel, vi har beskrevet brugen af immunoprecipitation-LC/MS/MS analyse af protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik. Denne enkle metode letter den bekvemme analyse af protein-protein interaktioner selv i ikke-specialiserede laboratorier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

Talrige intracellulære proteiner interagerer fysisk i overensstemmelse med deres intracellulære og ekstracellulære omstændigheder. Faktisk, cellulære funktioner i vid udstrækning afhænger af intracellulære protein-protein interaktioner. Derfor er forskning vedrørende disse interaktioner uundværlig for at lette forståelsen af fysiologisk processer. Co-udfældning af associerede proteiner, efterfulgt af massespektrometri (MS) analyse, gør det muligt at identificere nye protein interaktioner. I denne undersøgelse, vi har givet oplysninger om den nye teknik immunopræcipitation-væskekromatografi (LC)-MS/MS analyse kombineret med on-membran fordøjelse til analyse af protein-protein interaktioner. Denne teknik er velegnet til rå immunoprecipitants og kan forbedre gennemløb af proteomiske analyser. Mærkede rekombinante proteiner udfældede ved hjælp af specifikke antistoffer; Dernæst blev immunopræcipitanter slettet på polyvinylidendifluorid membran stykker udsat for reduktiv alkylering. Efter trypsinisering blev de Ford øjede proteinrester analyseret ved hjælp af LC-MS/MS. ved hjælp af denne teknik, vi var i stand til at identificere flere kandidat associerede proteiner. Således, denne metode er praktisk og nyttig til karakterisering af nye protein-protein interaktioner.

Ved hjælp af den ovenfor beskrevne procedure blev immunopræcipitanter analyseret med LC-MS/MS (figur 1). Efter udelukkelse af eksogent afledte proteiner (proteiner fra andre arter og Igg'er) blev der identificeret 17 proteiner i calpain-6-associerede immunopræcipitanter (tabel 1), og der blev identificeret 15 proteiner i gfp-associerede immunopræcipitanter ( Tabel 2). Af calpain-6-og GFP-associerede proteiner blev 11 iden...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of ProteinÃ¢â‚¬â€œProtein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique at JoVE.com

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Her præsenterer vi en protokol for en membran fordøjelsesteknik til fremstilling af prøver til massespektrometri. Denne teknik letter den bekvemme analyse af protein-protein interaktioner.

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Forskning protein-protein interaktion er uundværlig for at forstå fysiologiske processer i flere områder. I denne video introducerer vi on-membran fordøjelse teknik, som gør det muligt for forskerne at udføre en omfattende analyse af bindende proteiner ved MS på en bekvem måde. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan forbedre gennemløb af proteomiske analyse for rå immunaffæt, fordi adskillelse af proteiner ved polyarylamid gel elektroforese er ikke nødvendig.Begynd at konjugere antistoffet til de magnetiske perler ved at blande anti-GFP antistof med perlerne i 500 mikroliter citratphosphat buffer. Drej blandingen ved 50 omdr./min. i en time ved stuetemperatur. Og derefter vaske de konjugerede perler tre gange med citrat fosfat buffer indeholder 1% polysorbat 20.Lyse transficerede celler i henhold til manuskriptanvisninger. Skrab skålen og overfør lysatet til reagensglasset på 1,5 milliliter. Fjern derefter lysatet ved centrifugering ved 15,000 x g i fem minutter og opsaml supernatanten.Forbered ikke-mærkede magnetiske perler ved at vaske dem tre gange med 500 mikroliter citrat fosfat buffer. Efter den endelige vask fjernes bufferen og tilføjes cellelysat til perlerne. Drej blandingen ved 50 omdr./min. i 30 minutter ved stuetemperatur.Udfør magnetisk adskillelse på den magnetiske stander og opsaml cellelysatet. For at binde målproteinerne til de immunglobulinkonjugerede perler skal du placere perlerne på den magnetiske stand i fem minutter. Kassér citratbufferen, og tilsæt cellelysatet til perlerne.Drej blandingen i en time ved 50 omdr./min. For at adskille målproteiner fra de frie ikke-målproteiner vaskes perlerne tre gange med 500 mikroliter citratphosphatbuffer indeholdende 1% polysorbat 20. Efter den endelige vask tilsættes 30 mikroliter citratbuffer, og lad perlerne sidde i fem minutter ved stuetemperatur for at fremkalde målproteinerne.For at forberede membranen skæres PVDF membraner i 3 millimeter med 3 millimeter stykker ved hjælp af kirurgisk saks, der blev rengjort umiddelbart før brug. Placer stykker af membran på aluminiumsfolie og tilføje to til fem mikroliter af ethanol til hvert stykke. Før membraner er helt tørre, tilsættes to til fem mikroliter af proteinet elueringsstof til hvert stykke og lufttørrer dem, indtil membranens overflade bliver mat.Derefter overføre membraner i 1,5 milliliter rør og gemme dem på fire grader Celsius. Hvis du bruger det samme, tilsættes to til 30 mikroliter ethanol, som vil gøre dem hydrofile. Fjern ethanol med en pipette, men før membranerne tørrer, tilsættes helt 200 mikroliter af DTT-baseret reaktionsopløsning på hvert rør, og inkuber dem ved 56 grader Celsius i en time.Efter inkubation erstattes reaktionsopløsningen med 300 mikroliter iodoacetamidopløsning, og inkuberes i mørke i 45 minutter. Derefter vaskes membranerne to gange med destilleret vand og en gang med 2%acetonitril ved vortexing i mindst ti sekunder. Arbejde med diaphanous-relaterede acetonitril kan være yderst farligt.Der skal altid bæres maske, briller og handsker, når der udføres den on-membran fordøjelsesprocedure. Forbered trypsin i henhold til manuskript retninger, og tilsæt 100 mikroliter trypsin reaktion løsning til hver membran. Inkubere natten over ved 37 grader Celsius for fordøjelsen.Den næste dag overføres reaktionsopløsningen til et rent 1,5 milliliterrør, og der tilsættes 100 mikroliter vaskeopløsninger til membranen. Membranen inkuberes ved 60 grader Celsius i to timer, opsaml derefter vaskeopløsningen og bland den med reaktionsopløsningen. Tilsæt yderligere 100 mikroliter vaskeopløsning til membranen og sonikere den i 10 minutter.Opsaml derefter vaskeopløsningen og bland den med reaktionsopløsningen. Dæk reagensglasset med et stykke laboratoriefilm og lav små huller i filmen med en nål. Opløsningen tørres med en vakuumkoncentrator, og restproduktet opløses i 10 mikroliter på 2 % myresyre.Centrifuge røret ved 12, 000 x g i tre minutter, og overfør supernatanten til et prøverør. Analysér prøven ved hjælp af et massespektrometer, der er forbundet med et nano-LC/HPLC-system. Ved hjælp af denne protokol blev der identificeret 17 proteiner i calpain-6-associeret immunoprecipitant, 15 i det GFP-associerede immunoprecipitant, og 11 blev identificeret i begge.Det er vigtigt at bemærke, at påvisning af mindst én high fidelity peptid fragment er nødvendig for positiv identifikation af en kandidat protein. Proteiner, der udfældede i GFP-ekspresserende lysat samt histoner, udefrakommende og ribosomale proteiner, blev udeladt fra listen. Vask af membraner før tryptisk fordøjelse med destilleret vand og 2%acetonitril er det vigtigste skridt i proceduren for on-membran fordøjelse over proteiner.Efter denne metode, Er det muligt at bekræfte co-udfældning af målprotein ved at gennemføre andre eksperimenter, såsom immunoprecipitation og Western blot analyse. Denne enkle metode gør det muligt for forskerne at udforske de nye protein-protein interaktioner med praktisk og høj-følsomme analyse.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metode til syntese af Peptoider med Blandet lysin-type / Arginin-type monomerer og evaluering af deres anti-Leishmania aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...