Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
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Cette étude a été soutenue en partie par la Société japonaise pour la promotion de la science KAKENHI Grant Number 17K09869 (à AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), une subvention de recherche de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation et une subvention de recherche de la Suzuken Memorial Foundation (tous à TM).

1. Immunoprécipitation
REMARQUE : Nous avons utilisé le tampon de lyse et d'élution de lyse de dodecyl de non-sodium (SDS), tel que décrit dans les sections suivantes. Cependant, l'utilisation d'une autre technique interne d'immunoprécipitation peut également être applicable pour la préparation d'échantillons de LC-MS/MS.
<ol><li>Cellules cultivées transfect avec des vecteurs codant une étiquette d'épitope seule ou une protéine de fusion. Pour l'acquisition de données représen...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

Nous avons précédemment décrit une analyse des modifications oxydatives de l'apolipoprotéine B-100 dans la lipoprotéine de basse densité oxydée utilisant LC-MS/MS précédée d'une technique de digestion on-membrane6. Dans la présente étude, nous avons combiné cette technique avec l'immunoprécipitation et avons identifié plusieurs protéines calpain-6-associées. Cette nouvelle technique représente une méthode pratique de dépistage des protéines associées aux candidats. Calpain-6 ...

Bien que les protéines jouent un rôle constitutif dans les organismes vivants, elles sont continuellement synthétisées, traitées et dégradées dans l'environnement intracellulaire. En outre, les protéines intracellulaires interagissent fréquemment physiquement et biochimiquement, ce qui affecte la fonction d'un ou des deux1,2,3. Par exemple, la liaison directe de l'homolog de protéine spliceosome-associé CWC22 avec le facteur d'initiation de traduction eucaryotique 4A3 (eIF4A3) est nécessaire pour l'assemblage du complexe de jonction d'exon4. Conformément à cela, un mutant eIF4A3 qui manque d'affinité pour CWC22 ne parvient pas à faciliter l'épissage de l'ARNm à jonction exon complexe-conduit4. Ainsi, l'étude des interactions protéiques est cruciale pour la compréhension précise de la régulation physiologique ainsi que des fonctions cellulaires.
Des progrès récents dans la spectrométrie de masse (SeP) ont été appliqués à l'analyse complète des interactions protéines-protéines. Par exemple, la co-précipitation de protéines endogènes ou de protéines étiquetées introduites exogènement avec leurs protéines associées, suivie s'il y a une analyse de la SP, permet d'identifier de nouvelles interactions protéiques5. Cependant, un goulot d'étranglement majeur de l'analyse de la SP/SP est la récupération médiocre des digests tryptiques des échantillons de protéines. Pour effectuer des analyses protéomiques sur les lysates cellulaires, des techniques de digestion en gel et à la membrane sont généralement utilisées pour préparer des échantillons de SP/SP. Nous avons précédemment comparé une procédure de digestion dans-gel avec une technique de digestion sur-membrane6, et a montré que ce dernier a été associé à une meilleure couverture de séquence. La membrane du difluorure de polyvinylidene (PVDF) peut convenir à cette fin parce qu'elle est mécaniquement robuste et résistante aux fortes concentrations de solvants organiques7,8, permettant la digestion enzymatique des immobilisés protéines en présence de 80% d'acétonitrile9. En outre, l'immobilisation sur une membrane peut induire des changements conformationnels dans les protéines cibles, conduisant à des améliorations de l'efficacité de la digestion tryptique10. En conséquence, dans cet article, nous avons décrit l'utilisation de l'analyse immunoprécipitation-LC/MS/MS des interactions de protéine utilisant une technique de digestion sur-membrane. Cette méthode simple facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines, même dans les laboratoires non spécialisés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

De nombreuses protéines intracellulaires interagissent physiquement en fonction de leurs circonstances intracellulaires et extracellulaires. En effet, les fonctions cellulaires dépendent en grande partie des interactions protéines intracellulaires. Par conséquent, la recherche concernant ces interactions est indispensable pour faciliter la compréhension des processus physiologiques. La co-précipitation des protéines associées, suivie de l'analyse de la spectrométrie de masse (SP), permet d'identifier de nouvelles interactions protéiques. Dans cette étude, nous avons fourni des détails de la nouvelle technique de l'analyse immunoprécipitation-chromatographie liquide (LC)-MS/MS combinée à la digestion on-membrane pour l'analyse des interactions protéines-protéines. Cette technique convient aux immunoprécipitants bruts et peut améliorer le débit des analyses protéomiques. Les protéines recombinantes marquées ont été précipitées à l'aide d'anticorps spécifiques; ensuite, les immunoprecipitants effacés sur les morceaux de membrane de difluorure de polyvinylidene ont été soumis à l'alkylation réductrice. Après la trypsinisation, les résidus de protéines digérées ont été analysés à l'aide de LC-MS/MS. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier plusieurs protéines associées candidates. Ainsi, cette méthode est pratique et utile pour la caractérisation de nouvelles interactions protéines-protéines.

Au moyen de la procédure décrite ci-dessus, les immunoprécitants ont été analysés à l'aide de LC-MS/MS (figure 1). Après l'exclusion des protéines exogènes dérivées (protéines d'autres espèces et IgG), 17 protéines ont été identifiées chez des immunoprecipitants associés au calpain-6 (tableau 1) et 15 protéines ont été identifiées chez des immunoprecipitants associés au GFP ( Tableau 2). Parmi les prot...

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Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de digestion on-membrane pour la préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse. Cette technique facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines.

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

La recherche sur l’interaction protéine-protéine est indispensable pour comprendre les processus physiologiques dans plusieurs domaines. Dans cette vidéo, nous introduisons une technique de digestion sur la membrane qui permet aux chercheurs d’effectuer une analyse complète des protéines liantes par la SP d’une manière pratique. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons améliorer le débit de l’analyse protéomique pour les immunoprécipices bruts parce que la séparation des protéines par électrophoresis gel polyacrylamide n’est pas nécessaire.Commencez à conjuguer l’anticorps aux perles magnétiques, en mélangeant l’anticorps anti-GFP avec les perles dans 500 microlitres de tampon de phosphate de citrate. Faire pivoter le mélange à 50 rpm pendant une heure à température ambiante. Et puis laver les perles conjuguées trois fois avec tampon de phosphate de citrate contenant 1% polysorbate 20.Cellules transfectées Lyse selon les instructions manuscrites. Racler le plat et transférer le lysate dans le tube à essai de 1,5 millilitre. Ensuite, dégagez le lysate en centrifugant à 15 000 x g pendant cinq minutes et recueillez le supernatant.Préparez des perles magnétiques non étiquetées en les lavant trois fois avec 500 microlitres de tampon de phosphate de citrate. Après le lavage final, retirer le tampon et ajouter le lysate cellulaire aux perles. Faire pivoter le mélange à 50 RPM pendant 30 minutes à température ambiante.Effectuez la séparation magnétique sur le support magnétique et recueillez le lysate cellulaire. Pour lier les protéines cibles aux perles conjuguées à l’immunoglobuline, placez les perles sur le support magnétique pendant cinq minutes. Jetez le tampon de citrate et ajoutez le lysate de cellules aux perles.Faire pivoter le mélange pendant une heure à 50 rPM. Pour séparer les protéines cibles des protéines non cibles libres, lavez les perles trois fois avec 500 microlitres de tampon de phosphate de citrate contenant 1 % de polysorbate 20. Après le lavage final, ajouter 30 microlitres de tampon de citrate, et laisser reposer les perles pendant cinq minutes à température ambiante pour élucider les protéines cibles.Pour préparer la membrane, couper les membranes PVDF en morceaux de 3 millimètres par 3 millimètres à l’aide de ciseaux chirurgicaux qui ont été nettoyés immédiatement avant l’utilisation. Déposer les morceaux de membrane sur du papier d’aluminium et ajouter deux à cinq microlitres d’éthanol à chaque pièce. Avant que les membranes ne soient complètement sèches, ajouter deux à cinq microlitres de la protéine élitente à chaque pièce et les sécher à l’air jusqu’à ce que la surface de la membrane devienne mate.Transférez ensuite les membranes dans des tubes de 1,5 millilitre et stockez-les à quatre degrés Celsius. Si vous utilisez immédiatement, ajouter de deux à 30 microlitres d’éthanol qui les œuvreront hydrophiles. Retirer l’éthanol à l’aide d’une pipette, mais avant que les membranes ne sèchent, ajouter complètement 200 microlitres de solution de réaction à base de TNT à chaque tube et les incuber à 56 degrés Celsius pendant une heure.Après l’incubation, remplacer la solution de réaction par 300 microlitres de solution iodoacetamide, et incuber dans l’obscurité pendant 45 minutes. Ensuite, lavez les membranes deux fois avec de l’eau distillée et une fois avec 2% d’acétylonitrile en vortexant pendant au moins dix secondes. Travailler avec de l’acétylonitrile diaphane peut être extrêmement dangereux.Un masque, des lunettes et des gants doivent toujours être portés lors de l’exécution de la procédure de digestion sur la membrane. Préparer la trypsine selon les instructions manuscrites, et ajouter 100 microlitres de solution de réaction de trypsine à chaque membrane. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius pour la digestion.Le lendemain, transférez la solution de réaction dans un tube propre de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres de solutions de lavage à la membrane. Incuber la membrane à 60 degrés Celsius pendant deux heures, puis recueillir la solution de lavage et la mélanger avec la solution de réaction. Ajouter 100 microlitres supplémentaires de solution de lavage à la membrane et sonifier pendant 10 minutes.Ensuite, collectez la solution de lavage et mélangez-la avec la solution de réaction. Couvrir le tube à essai d’un morceau de film de laboratoire et faire de petits trous dans le film avec une aiguille. Séchez la solution à l’aide d’un concentrateur sous vide et dissolvez les résidus dans 10 microlitres d’acide 2% formic.Centrifugeuse le tube à 12 000 x g pendant trois minutes, et transférer le supernatant dans un tube d’échantillon. Analyser l’échantillon à l’aide d’un spectromètre de masse relié à un système nano LC/HPLC. En utilisant ce protocole, 17 protéines ont été identifiées dans l’immunoprécipitar associé de Calpain-6, 15 dans l’immunoprécipice GFP-associé, et 11 ont été identifiées dans les deux.Il est important de noter que la détection d’au moins un fragment de peptide haute fidélité est nécessaire pour l’identification positive d’une protéine candidate. Les protéines qui se sont précipitées dans le lysate exprimant le GFP ainsi que les histones, les protéines exogènes et ribosomales ont été omises de la liste. Laver les membranes avant la digestion tryptique avec de l’eau distillée et 2% d’acétylonitrile est l’étape la plus importante dans la procédure de digestion sur la membrane sur les protéines.Suivant cette méthode, il est possible de confirmer la coprésentation des protéines cibles en menant d’autres expériences, telles que l’immunoprécipice et l’analyse des taches occidentales. Cette méthode simple permet aux chercheurs d’explorer les nouvelles interactions protéine-protéine avec une analyse pratique et hautement sensible.

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Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

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