Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
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Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), einem Forschungsstipendium der Kanehara Ichiro Medical Science Foundation, unterstützt. und ein Forschungsstipendium der Suzuken Memorial Foundation (alle an TM).

1. Immunitizipation
HINWEIS: Wir verwendeten Nicht-Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer und Citrat-Elution, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. Die Verwendung einer alternativen internen Immunpräzipitungstechnik kann jedoch auch für die Herstellung von LC-MS/MS-Proben geeignet sein.
<ol><li>Transfekte kultivierte Zellen mit Vektoren, die ein Epitop-Tag allein oder ein Fusionsprotein kodieren. Zur Erfassung repräsentativer Daten übertragen Sie J774-Zellen (1 x 106) m...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

Wir haben zuvor eine Analyse der oxidativen Modifikationen von Apolipoprotein B-100 in oxidiertem Low-Density-Lipoprotein mit LC-MS/MS beschrieben, der eine On-Membran-Verdauungstechnik vorausgegangen ist6. In der vorliegenden Studie haben wir diese Technik mit Immunpräzipitation kombiniert und mehrere Calpain-6-assoziierte Proteine identifiziert. Diese neuartige Technik stellt eine bequeme Methode zum Screening auf Kandidaten-assoziierte Proteine dar. Calpain-6 ist ein nicht-proteolytisches Mitg...

Obwohl Proteine in lebenden Organismen eine konstitutive Rolle spielen, werden sie in der intrazellulären Umgebung kontinuierlich synthetisiert, verarbeitet und abgebaut. Darüber hinaus interagieren intrazelluläre Proteine häufig physikalisch und biochemisch, was die Funktion eines oder beider1,2,3. Beispielsweise ist die direkte Bindung des spliceosomenassoziierten Proteinhomologs CWC22 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4A3 (eIF4A3) für die Montage des exon-Junction-Komplexes4erforderlich. In Übereinstimmung damit, eine eIF4A3 Mutante, die Affinität für CWC22 fehlt nicht exon Junction komplexe mRNA spleißen4zu erleichtern. Daher ist die Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen entscheidend für das genaue Verständnis der physiologischen Regulation sowie der zellulären Funktionen.
Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) wurden auf die umfassende Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet. Zum Beispiel ermöglicht die Ko-Ausfällung von endogenen Proteinen oder exogen eingeführten markierten Proteinen mit ihren zugehörigen Proteinen, gefolgt von einer MS-Analyse, die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen5. Ein großer Engpass bei der MS/MS-Analyse ist jedoch die schlechte Erholung von tryptischen Digests von Proteinproben. Zur Durchführung proteomischer Analysen an Zelllysaten werden in der Regel In-Gel- und On-Membran-Verdauungstechniken zur Vorbereitung von MS/MS-Proben eingesetzt. Wir haben zuvor ein In-Gel-Verdauungsverfahren mit einer On-Membran-Verdauungstechnik6verglichen und gezeigt, dass letztere mit einer besseren Sequenzabdeckung verbunden war. Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran kann für diesen Zweck geeignet sein, weil es mechanisch robust und beständig gegen hohe Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln7,8, ermöglicht die enzymatische Verdauung von immobilisierten Proteine in Gegenwart von 80% Acetonitril9. Darüber hinaus kann die Immobilisierung auf einer Membran konformationale Veränderungen in Denkproteinen auslösen, was zu Verbesserungen der tryptischen Verdauungseffizienz10führt. Dementsprechend haben wir in diesem Artikel die Verwendung von Immunpräzipitation-LC/MS/MS-Analysen von Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membran-Verdauungstechnik beschrieben. Diese einfache Methode erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auch in nicht spezialisierten Laboratorien.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

Zahlreiche intrazelluläre Proteine interagieren physisch in Übereinstimmung mit ihren intrazellulären und extrazellulären Umständen. Tatsächlich hängen die zellulären Funktionen weitgehend von intrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen ab. Daher ist die Forschung über diese Wechselwirkungen unerlässlich, um das Verständnis physiologischer Prozesse zu erleichtern. Die Ko-Ausfällung assoziierter Proteine, gefolgt von einer Massenspektrometrie-Analyse (MS), ermöglicht die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen. In dieser Studie haben wir Details der neuartigen Technik der Immunpräzipitations-Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Analyse in Kombination mit der On-Membran-Verdauung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen bereitgestellt. Diese Technik eignet sich für rohe Immunpräzipitantien und kann den Durchsatz proteomischer Analysen verbessern. Tagged rekombinante Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern gefällt; als nächstes wurden Immunpräzipitanten, die auf Polyvinylidendifluorid-Membranstücke gefleckt wurden, einer reduktiven Alkylierung unterzogen. Nach der Trypsinisierung wurden die verdauten Proteinrückstände mit LC-MS/MS analysiert. Mit dieser Technik konnten wir mehrere kandidatenassoziierte Proteine identifizieren. Daher ist diese Methode praktisch und nützlich für die Charakterisierung neuartiger Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurden Immunpräzipitantien mit LC-MS/MS analysiert (Abbildung 1). Nach dem Ausschluss exogen abgeleiteter Proteine (Proteine anderer Arten und IgGs) wurden 17 Proteine in Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitantien (Tabelle 1) und 15 Proteinen in GFP-assoziierten Immunpräcipitantien ( Tabelle 2). Von den Calpain-6- und GFP-assoziierten Proteinen wurden 11 in beiden Immunpräcipita...

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Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Die Erforschung der Protein-Protein-Interaktion ist für das Verständnis physiologischer Prozesse in mehreren Bereichen unerlässlich. In diesem Video stellen wir die On-Membran-Verdauungstechnik vor, die es den Forschern ermöglicht, eine umfassende Analyse von Bindungsproteinen durch MS auf bequeme Weise durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir den Durchsatz der proteomischen Analyse für rohe Immunpräzipitantien verbessern können, da eine Trennung von Proteinen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese nicht erforderlich ist.Beginnen Sie, den Antikörper mit den magnetischen Perlen zu konjugieren, indem Sie den Anti-GFP-Antikörper mit den Perlen in 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer mischen. Drehen Sie das Gemisch bei 50 Umdrehungen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Und dann die konjugierten Perlen dreimal mit Citratphosphatpuffer mit 1%Polysorbat 20 waschen.Lyse transfizierte Zellen nach Manuskriptrichtungen. Die Schale zerkleinern und in das 1,5-Milliliter-Reagenzglas geben. Dann das Lysat durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für fünf Minuten löschen und den Überstand sammeln.Bereiten Sie unbeschriftete Magnetperlen vor, indem Sie sie dreimal mit 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer waschen. Nach der letzten Wäsche den Puffer entfernen und den Perlen Zelllysat hinzufügen. Drehen Sie das Gemisch bei 50 Umdrehungen 30 Minuten bei Raumtemperatur.Führen Sie die magnetische Trennung auf dem magnetischen Ständer durch und sammeln Sie das Zelllysat. Um die Zielproteine an die immunglobulin konjugierten Perlen zu binden, legen Sie die Perlen fünf Minuten lang auf den magnetischen Ständer. Entsorgen Sie den Citratpuffer, und fügen Sie das Zelllysat zu den Perlen hinzu.Drehen Sie die Mischung für eine Stunde bei 50 RPM. Um Zielproteine von den freien Nichtzielproteinen zu trennen, waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer, der 1%Polysorbat 20 enthält. Nach der letzten Wäsche 30 Mikroliter Citratpuffer hinzufügen und die Perlen fünf Minuten bei Raumtemperatur sitzen lassen, um die Zielproteine zu löschen.Zur Vorbereitung der Membran schneiden Sie PVDF-Membranen mit einer chirurgischen Schere in 3-Millimeter-Stücke, die unmittelbar vor dem Gebrauch gereinigt wurden. Legen Sie die Membranstücke auf Aluminiumfolie und fügen Sie zwei bis fünf Mikroliter Ethanol zu jedem Stück hinzu. Bevor die Membranen vollständig trocken sind, fügen Sie jedem Stück zwei bis fünf Mikroliter des Proteins eluent hinzu und trocknen Sie es an der Luft, bis die Membranoberfläche matt wird.Dann Membranen in 1,5 Milliliter-Rohre übertragen und bei vier Grad Celsius lagern. Wenn Sie sofort verwenden, fügen Sie zwei bis 30 Mikroliter Ethanol hinzu, was sie hydrophil macht. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Pipette, aber bevor die Membranen trocknen, fügen Sie 200 Mikroliter DTT-basierte Reaktionslösung zu jeder Röhre vollständig hinzu und inkubieren Sie sie bei 56 Grad Celsius für eine Stunde.Nach der Inkubation die Reaktionslösung durch 300 Mikroliter Iodoacetamid-Lösung ersetzen und 45 Minuten im Dunkeln brüten. Dann waschen Sie die Membranen zweimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 2%Acetonitril durch Wirbeln für mindestens zehn Sekunden. Die Arbeit mit diaphanem astonititrillösen kann extrem gefährlich sein.Eine Maske, eine Brille und Handschuhe sollten immer getragen werden, wenn die On-Membran-Verdauung durchführen. Bereiten Sie Trypsin nach Manuskriptanweisungen vor und fügen Sie jeder Membran 100 Mikroliter Trypsin-Reaktionslösung hinzu. Über Nacht bei 37 Grad Celsius zur Verdauung inkubieren.Übertragen Sie am nächsten Tag die Reaktionslösung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr und fügen Sie der Membran 100 Mikroliter Waschlösungen hinzu. Die Membran zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius inkubieren, dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen. Fügen Sie der Membran weitere 100 Mikroliter Waschlösung hinzu und beschallen Sie sie 10 Minuten lang.Dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen. Bedecken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie und machen Sie kleine Löcher in der Folie mit einer Nadel. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator, und lösen Sie den Rückstand in 10 Mikroliter 2%Ameisensäure auf.Zentrifugieren Sie das Rohr drei Minuten lang bei 12.000 x g und übertragen Sie den Überstand in ein Probenrohr. Analysieren Sie die Probe mit einem Massenspektrometer, das mit einem Nano-LC/HPLC-System verbunden ist. Mit diesem Protokoll wurden 17 Proteine im Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitant identifiziert, 15 im GFP-assoziierten Immunpräcipitant und 11 in beiden.Es ist wichtig zu beachten, dass der Nachweis von mindestens einem High-Fidelity-Peptid-Fragment für die positive Identifizierung eines Kandidatenproteins erforderlich ist. Proteine, die im GFP-exzessigraphischen Lysat ausfielen, sowie Histonen, exogene und ribosomale Proteine wurden von der Liste gestrichen. Das Waschen der Membranen vor der tryptischen Verdauung mit destilliertem Wasser und 2%Acetonitril ist der wichtigste Schritt bei der Behandlung der On-Membran-Verdauung über Proteine.Nach dieser Methode ist es möglich, die Ko-Ausfällung des Zielproteins durch andere Experimente wie Immunpräzipitation und Western Blot-Analyse zu bestätigen. Diese einfache Methode ermöglicht es den Forschern, die neuartigen Protein-Protein-Wechselwirkungen mit bequemen und hochempfindlichen Analysen zu erforschen.

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Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

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Protein Function

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