Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of ProteinÃ¢â‚¬â€œProtein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך בחלק על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 17K09869 (כדי AM), יפן האגודה לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 15K09418 (ל TM), מענק מחקר מבית החולים Kanehara איצ'ירו המדע ומענק מחקר מקרן הזיכרון של סוזוקן (all-TM).

1. Immunoprecipitation
הערה: השתמשנו במאגר הליזה שאינו נתרן dodecyl סולפט (SDS) ומשחרלי ציטראט, כפי שמתואר בסעיפים הבאים. עם זאת, השימוש בטכניקה immunoprecipitation חלופית בתוך הבית עשוי להיות גם ישים עבור הכנת דגימות LC-MS/MS.
<ol><li>מעבר תאים מתורבתים עם וקטורים קידוד תג אפירופה לבד או חלבון פיוז'ן. עבור...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

בעבר תיארנו ניתוח של שינויים חמצוניים של אפוליפופרוטאין B-100 ב תחמוצת בצפיפות נמוכה ליפופרוטאין באמצעות LC-ms/ms לפניו על-ידי טכניקה העיכול הממברנה6. במחקר הנוכחי, אנו משולבים טכניקה זו עם immunoprecipitation וזיהה מספר calpain-6-הקשורים חלבונים. טכניקה זו מייצגת שיטה נוחה להקרנה עבור חלבונים ...

למרות החלבונים לשחק תפקידים מחוקה באורגניזמים חיים, הם מסונתז ללא הרף, מעובד, ומושפל בסביבה תאיים. יתר על כן, חלבונים תאיים לעתים קרובות האינטראקציה פיזית ביולוגית, אשר משפיע על הפונקציה של אחד או שניהם1,2,3. לדוגמה, הכריכה הישירה של הומוCWC22 החלבון המשויך ל-איקריוטית באמצעות תרגום מסוג 4a3 (eIF4A3) הכרחית להרכבת מתחם הצומת אקסון4. בהתאם למצב זה, מוטציה eIF4A3 חסר אהדה עבור CWC22 נכשלת להקל על החדרת הצומת mRNA מונחה מורכבים מורכב של שחבור4. לפיכך, המחקר של אינטראקציות חלבונים הוא חיוני להבנה מדויקת של רגולציה הפיזיולוגית כמו גם של פונקציות סלולריות.
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטר המסה (MS) הוחלו על הניתוח המקיף של אינטראקציות חלבונים בחלבון. למשל, שיתוף משקעים של חלבונים אנדוגני או אקסוגנבאופן ברור הציג חלבונים מתויגים עם החלבונים המשויכים שלהם, ואחריו ניתוח MS, מאפשר זיהוי של אינטראקציות החלבון הרומן5. עם זאת, בקבוק אחד גדול של ניתוח MS/MS הוא התאוששות ירודה מעיכול טריפטי של דגימות חלבון. עבור ניהול ניתוחים פרוטאומית על lysates תא, ב-ג'ל ושיטות עיכול על-ממברנה מועסקים בדרך כלל כדי להכין בדיקות MS/MS. בעבר השוונו הליך העיכול ב-ג'ל עם טכניקת העיכול6, והראה כי האחרון היה קשור כיסוי רצף טוב יותר. Pvc difluoride (pvdf) קרום עשוי להיות מתאים למטרה זו, כי היא חזקה מכנית עמידים בפני ריכוזים גבוהים של ממיסים אורגניים7,8, המתיר העיכול אנזימטי של קיבוע חלבונים בנוכחות 80% acetonitrile9. יתר על כן, השתק על קרום יכול לגרום לשינויים שינויים בחלבונים היעד, המוביל שיפורים ביעילות העיכול הטריפטי10. בהתאם לכך, במאמר זה, תיארנו את השימוש בניתוח immunoprecipitation-LC/MS/MS של אינטראקציות חלבונים באמצעות טכניקת העיכול על הממברנה. שיטה פשוטה זו מקלה על הניתוח הנוח של אינטראקציות חלבונים בחלבון גם במעבדות שאינן מתמחות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

חלבונים תאיים רבים אינטראקציה פיזית בהתאם לנסיבות תאיים שלהם מסחטות. אכן, פונקציות הסלולר תלוי במידה רבה חלבון תאיים – אינטראקציות חלבון. לכן, המחקר הנוגע לאינטראקציות אלו הוא הכרחי להקלה על הבנת התהליכים הפיזיולוגיים. שיתוף משקעים של חלבונים משויכים, ולאחריו ניתוח ספקטרומטר המסה (MS), מאפשר זיהוי אינטראקציות של חלבונים חדשניים. במחקר זה, סיפקנו את הפרטים של הטכניקה הרומן של immunoprecipitation-נוזלי כרומטוגרפיה (LC)-MS/MS ניתוח בשילוב עם העיכול על הקרום לניתוח של חלבון-אינטראקציות החלבון. טכניקה זו מתאימה לimmunoprecipitants גולמי ויכולה לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטאואריים. מתויג רקומביננטי חלבונים היו זירז באמצעות נוגדנים ספציפיים; בשלב הבא, immunoprecipitants מחק על החלקים הממבראני של הממברנה, שהיו חשופים לאלקיללציה. בעקבות טריסיזציה, משקעי החלבון המשועכלים נותחו באמצעות LC-MS/MS. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות מספר מועמדים משויכים חלבונים. כך, שיטה זו היא נוחה ושימושית לאפיון של החלבון הרומן – אינטראקציות חלבונים.

באמצעות ההליך הנ ל תיאר, immunoprecipitants נותחו באמצעות LC-MS/MS (איור 1). לאחר החרגה של חלבונים הנגזרים באופן שונה (חלבונים ממינים אחרים IgGs), 17 חלבונים זוהו calpain-6-הקשורים immunoprecipitants (שולחן 1) ו 15 חלבונים זוהו ב gfp הקשורים immunoprecipitants ( טבלה 2). של calpain-6 ו-GFP ?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of ProteinÃ¢â‚¬â€œProtein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique at JoVE.com

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

חקר האינטראקציה בין חלבון לחלבון הוא הכרחי להבנת תהליכים פיזיולוגיים במספר תחומים. בסרטון זה אנו מציגים טכניקת עיכול על הממברנה המאפשרת לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של חלבונים מחייבים על ידי טרשת נפוצה בצורה נוחה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לשפר את התפוקה של ניתוח פרוטומי עבור immunoprecipitants גולמי כי הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide אינו הכרחי.התחל באוב את הנוגדן אל חרוזים מגנטיים, על ידי ערבוב נוגדן נגד GFP עם חרוזים ב 500 microliters של חיץ ציטראט פוספט. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את חרוזים מצומדים שלוש פעמים עם חיץ פוספט ציטראט המכיל 1%polysorbate 20.ליס תפור תאים לפי הוראות כתב יד. מגרדים את המנה ומעבירים את הליטאזט למבחנה של 1.5 מיליליטר. ואז לנקות את lysate על ידי צנטריפוגה ב 15, 000 x g במשך חמש דקות ולאסוף את העל טבעי.הכינו חרוזים מגנטיים ללא חגורה על ידי שטיפתם שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטרים של חיץ ציטראט פוספט. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את המאגר ולהוסיף lysate תא חרוזים. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בצע הפרדה מגנטית על מעמד מגנטי ולאסוף את התא lysate. כדי לקשור את חלבוני המטרה לחרוזים המצומדים אימונוגלובולין, מניחים את חרוזים על מעמד מגנטי במשך חמש דקות. השלך את מאגר הציטראט והוסף את lysate התא אל חרוזים.מסובבים את התערובת במשך שעה ב-50 סל"ד. כדי להפריד חלבוני מטרה מחלבונים חופשיים שאינם יעד, לשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ פוספט ציטראט המכיל 1%polysorbate 20. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של חיץ ציטראט, ולתת את חרוזים לשבת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לחמק חלבוני היעד.כדי להכין את הממברנה, לחתוך קרום PVDF לתוך 3 מילימטר על ידי חתיכות 3 מילימטר באמצעות מספריים כירורגיים שנוקו מיד לפני השימוש. מניחים את חתיכות הממברנה על רדיד אלומיניום ומוסיפים שניים עד חמישה מיקרוליטרים של אתנול לכל חתיכה. לפני שהממברנות יבשות לחלוטין, מוסיפים שניים עד חמישה מיקרוליטרים של החלבון אלבנט לכל חתיכה ומייבשים אותם באוויר עד שמשטח הממברנה הופך מט.ואז להעביר ממברנות לתוך 1.5 צינורות מיליליטר ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס. אם משתמשים מיד, מוסיפים שניים עד 30 מיקרוליטרים של אתנול אשר יגרום להם הידרופילי. הסר את האתנול עם פיפטה, אבל לפני הממברנות להתייבש, להוסיף לחלוטין 200 microliters של פתרון תגובה מבוסס DTT לכל צינור, ו דגירה אותם ב 56 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, להחליף את פתרון התגובה עם 300 microliters של פתרון iodoacetamide, דגירה בחושך במשך 45 דקות. לאחר מכן לשטוף את הממברנות פעמיים עם מים מזוקקים ופעם אחת עם 2% אצטוניטריל על ידי מערבולת לפחות עשר שניות. עבודה עם אצטוניטריל הקשורות diaphanous יכול להיות מסוכן מאוד.מסכה, משקפיים וכפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך העיכול על קרום. הכינו טריפסין לפי הוראות כתב היד, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון תגובת טריפסין לכל קרום. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס לעיכול.למחרת, להעביר את פתרון התגובה לתוך צינור נקי 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 100 microliters של פתרונות לשטוף את הממברנה. דגירה הממברנה ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ולאחר מכן לאסוף את פתרון לשטוף ומערבבים אותו עם פתרון התגובה. מוסיפים עוד 100 מיקרוליטרים של פתרון כביסה לממברנה ומניקים אותו במשך 10 דקות.לאחר מכן לאסוף את פתרון לשטוף ולערבב אותו עם פתרון התגובה. מכסים את המבחנה עם פיסת סרט מעבדה ולעשות חורים קטנים בסרט עם מחט. יבש את הפתרון באמצעות רכז ואקום, ולהמיס את השאריות ב 10 microliters של 2% חומצה פורמית.צנטריפוגה הצינור ב 12, 000 x גרם במשך שלוש דקות, ולהעביר את supernatant לתוך צינור מדגם. נתח את הדגימה באמצעות ספקטרומטר מסה המקושר למערכת ננו LC/HPLC. באמצעות פרוטוקול זה, זוהו 17 חלבונים ב- Calpain-6 הקשורים immunoprecipitant, 15 ב immunoprecipitant הקשורים GFP, ו 11 זוהו בשניהם.חשוב לציין כי זיהוי של שבר פפטיד אחד לפחות בנאמנות גבוהה נדרש לזיהוי חיובי של חלבון מועמד. חלבונים שזירזו את ליסאט GFP המביע כמו גם היסטון, חלבונים אקסוגניים וריבוזומליים הושמטו מהרשימה. שטיפת הממברנות לפני עיכול טריפטי במים מזוקקים ו-2% אצטוניטריל היא הצעד החשוב ביותר בהליך העיכול על הממברנה על חלבונים.בעקבות שיטה זו, ניתן לאשר משקעים שותף של חלבון היעד על ידי ביצוע ניסויים אחרים, כגון immunoprecipitation וניתוח כתם מערבי. שיטה פשוטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את אינטראקציות החלבון-חלבון החדשות עם ניתוח נוח ורגיש.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...