Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
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Questo studio è stato sostenuto in parte dalla Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (a TM), una sovvenzione di ricerca della Kanehara Ichiro Medical Science Foundation e una borsa di ricerca della Suzuken Memorial Foundation (tutte a TM).

1. Immunoprecipitazioni
NOTA: Abbiamo usato buffer di lisiesi e elusione di citrati non sodiaio (SDS), come descritto nelle sezioni seguenti. Tuttavia, l'uso di una tecnica alternativa di immunoprecipitazioni interna può essere applicabile anche per la preparazione di campioni LC-MS/MS.
<ol><li>Cellule coltivate transfect con vettori che codificano un tag dell'epitopo da solo o una proteina di fusione. Per l'acquisizione di dati rappresentativi, trasferire le celle J774 (1 x 106)...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

In precedenza abbiamo descritto un'analisi delle modifiche ossidative dell'apolipoproteina B-100 nella lipoproteina a bassa densità ossidata utilizzando LC-MS/MS preceduta da una tecnica di digestione su membrana6. Nel presente studio, abbiamo combinato questa tecnica con l'immunoprecipitazioni e abbiamo identificato diverse proteine associate al calpaino 6. Questa nuova tecnica rappresenta un metodo conveniente di screening per le proteine candidate candidate. Calpain-6 è un membro non proteoli...

Anche se le proteine svolgono ruoli di stitutive negli organismi viventi, vengono continuamente sintetizzate, elaborate e degradate nell'ambiente intracellulare. Inoltre, le proteine intracellulari interagiscono frequentemente fisicamente e biochimicamente, il che influisce sulla funzione di uno o entrambi1,2,3. Ad esempio, il legame diretto dell'omologa proteica associata allo spsome CWC22 con il fattore di avvio della traduzione eucacacale 4A3 (eIF4A3) è necessaria per l'assemblaggio del complesso di giunzione esonista4. Coerentemente con questo, un mutante eIF4A3 che manca di affinità per CWC22 non riesce a facilitare lo splicing4di mRNA di giunzione esone Pertanto, lo studio delle interazioni proteiche è fondamentale per la comprensione precisa della regolazione fisiologica e delle funzioni cellulari.
Recenti progressi nella spettrometria di massa (MS) sono stati applicati all'analisi completa delle interazioni proteina-proteina. Ad esempio, la co-precipitazione di proteine endogene o proteine esogeneamente introdotte con le proteine associate, seguite dall'analisi della SM, consente l'identificazione di nuove interazioni proteiche5. Tuttavia, uno dei principali colli di bottiglia dell'analisi MS/MS è la scarsa ripresa da digerimenti a prova di campioni di proteine. Per condurre analisi proteomiche su lismi cellulari, le tecniche di digestione in gel e on-membrana sono generalmente impiegate per preparare campioni MS/MS. In precedenza abbiamo confrontato una procedura di digestione in gel con una tecnica di digestione su membrana6e abbiamo dimostrato che quest'ultima era associata a una migliore copertura della sequenza. La membrana di polivinylidene difluoruro (PVDF) può essere adatta a questo scopo perché è meccanicamente robusta e resistente ad alte concentrazioni di solventi organici7,8, permettendo la digestione enzimatica di immobilizzati proteine in presenza dell'80% di acetonitrile9. Inoltre, l'immobilizzazione su una membrana può indurre cambiamenti conformazionali nelle proteine bersaglio, portando a miglioramenti nell'efficienza della digestione a setto10 . Di conseguenza, in questo articolo, abbiamo descritto l'uso dell'immunoprecipitazioni-LC/MS/MS analisi delle interazioni proteiche utilizzando una tecnica di digestione su membrana. Questo semplice metodo facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina anche in laboratori non specialistici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

Numerose proteine intracellulari interagiscono fisicamente in conformità con le loro circostanze intracellulari ed extracellulari. Infatti, le funzioni cellulari dipendono in gran parte dalle interazioni intracellulari proteina-proteina. Pertanto, la ricerca su queste interazioni è indispensabile per facilitare la comprensione dei processi fisiologici. La co-precipitazione delle proteine associate, seguita dall'analisi della spettrometria di massa (MS), consente l'identificazione di nuove interazioni proteiche. In questo studio, abbiamo fornito dettagli della nuova tecnica di immunoprecipitazioni-liquid a cromatografia (LC)-MS/MS analisi combinata con la digestione on-membrane per l'analisi delle interazioni proteina-proteina. Questa tecnica è adatta per immunoprecipitanti grezzi e può migliorare la produttività delle analisi proteomiche. Le proteine ricombinanti marcate sono state precipitate usando anticorpi specifici; successivamente, gli immunoprecipitanti ornati su pezzi di membrana difluoruro polivichine sono stati sottoposti a alchilazione riduttiva. Dopo la prova, i residui di proteine digerite sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di identificare diverse proteine associate candidate. Pertanto, questo metodo è conveniente e utile per la caratterizzazione di nuove interazioni proteina-proteina.

Tramite la procedura sopra descritta, gli immunoprecipitanti sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS (Figura 1). Dopo l'esclusione delle proteine di derivazione esogena (proteine di altre specie e IGA), 17 proteine sono state identificate negli immunoprecipitanti associati al calpain-6 (tabella1) e 15 proteine sono state identificate negli immunoprecipitanti associati alla GFP ( Tabella 2). Delle proteine associate al calp...

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Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di digestione su membrana per la preparazione di campioni per la spettrometria di massa. Questa tecnica facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina.

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

La ricerca dell'interazione proteina-proteina è indispensabile per comprendere i processi fisiologici in diversi campi. In questo video introduciamo la tecnica di digestione su membrana che consente ai ricercatori di eseguire un'analisi completa delle proteine leganti da parte della SM in modo conveniente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che possiamo migliorare la produttività dell'analisi proteomica per gli immunoprecipitanti grezzi perché non è necessaria la separazione delle proteine per elettroforesi del gel di poliacrilammide.Inizia a coniugare l'anticorpo con le perline magnetiche, mescolando l'anticorpo anti-GFP con le perline in 500 microlitri di tampone fosfato di citrato. Ruotare la miscela a 50 giri/min per un'ora a temperatura ambiente. E poi lavare le perline coniugate tre volte con tampone di fosfato citrato contenente l'1%di polisorbato 20.Lisci celle trasfette secondo le indicazioni manoscritte. Raschiare il piatto e trasferire il lysate nella provetta da 1,5 millilitri. Quindi sgombrato il lisato centrifugando a 15.000 x g per cinque minuti e raccogliere il supernatante.Preparare perline magnetiche non etichettate lavandole tre volte con 500 microlitri di tampone fosfato di citrato. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il tampone e aggiungere il lysate cellulare alle perline. Ruotare la miscela a 50 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.Eseguire la separazione magnetica sul supporto magnetico e raccogliere il lisato cellulare. Per legare le proteine bersaglio alle perline coniugate con immunoglobulina, posizionare le perline sul supporto magnetico per cinque minuti. Scartare il buffer del citrato e aggiungere il lisato della cella alle perline.Ruotare la miscela per un'ora a 50 giri/min. Per separare le proteine bersaglio dalle proteine libere non bersaglio, lavare le perline tre volte con 500 microlitri di tampone di fosfato di citrato contenente l'1%di polisorbato 20. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 microlitri di tampone di citrato e lasciare riposare le perline per cinque minuti a temperatura ambiente per elutare le proteine bersaglio.Per preparare la membrana, tagliare le membrane PVDF in pezzi da 3 millimetri per 3 millimetri utilizzando forbici chirurgiche che sono state pulite immediatamente prima dell'uso. Posizionare i pezzi di membrana su un foglio di alluminio e aggiungere da due a cinque microlitri di etanolo a ciascun pezzo. Prima che le membrane siano completamente asciutte, aggiungere da due a cinque microlitri della proteina eluente a ciascun pezzo e asciugarli all'aria fino a quando la superficie della membrana diventa opaca.Quindi trasferire le membrane in tubi da 1,5 millilitri e conservarle a quattro gradi Celsius. Se si utilizza immediatamente, aggiungere da due a 30 microlitri di etanolo che li renderanno idrofili. Rimuovere l'etanolo con una pipetta, ma prima che le membrane si asciughi, aggiungere completamente 200 microlitri di soluzione di reazione a base di DTT a ciascun tubo e incubarli a 56 gradi Celsius per un'ora.Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di reazione con 300 microlitri di soluzione di iodoacetamide e incubare al buio per 45 minuti. Quindi lavare le membrane due volte con acqua distillata e una volta con il 2%acetonitrile con vortice per almeno dieci secondi. Lavorare con acetonitrile correlato al diafano può essere estremamente pericoloso.Una maschera, occhiali e guanti devono sempre essere indossati quando si esegue la procedura di digestione su membrana. Preparare la tripside secondo le indicazioni manoscritte e aggiungere 100 microlitri di soluzione di reazione alla tripina ad ogni membrana. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius per la digestione.Il giorno successivo, trasferire la soluzione di reazione in un tubo pulito da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di soluzioni di lavaggio alla membrana. Incubare la membrana a 60 gradi Celsius per due ore, quindi raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione. Aggiungere altri 100 microlitri di soluzione di lavaggio alla membrana e sonicarla per 10 minuti.Quindi raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione. Coprire la provetta con un pezzo di pellicola da laboratorio e fare piccoli fori nel film con un ago. Asciugare la soluzione utilizzando un concentratore sottovuoto e sciogliere il residuo in 10 microlitri di acido formico al 2%.Centrifugare il tubo a 12.000 x g per tre minuti e trasferire il supernatante in un tubo campione. Analizzare il campione utilizzando uno spettrometro di massa collegato a un sistema nano LC/HPLC. Utilizzando questo protocollo, 17 proteine sono state identificate nell'immunoprecitante associato Calpain-6, 15 nell'immunoprecipite associato alla GFP e 11 in entrambi.È importante notare che il rilevamento di almeno un frammento peptidico ad alta fedeltà è necessario per l'identificazione positiva di una proteina candidata. Le proteine che precipitarono nel lisato che esprimeva la GFP così come gli istoni, le proteine esogene e ribosomiali furono omesse dalla lista. Lavare le membrane prima della digestione triptica con acqua distillata e 2%acetonitrile è il passo più importante nella procedura di digestione su membrana sulle proteine.Seguendo questo metodo, è possibile confermare la co-precipitazione della proteina bersaglio conducendo altri esperimenti, come l'immunoprecipitazione e l'analisi western blot. Questo semplice metodo consente ai ricercatori di esplorare le nuove interazioni proteina-proteina con analisi convenienti e altamente sensibili.

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Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

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