Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
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본 연구는 일본과학교부교부제 17K09869(오전), 일본과학교부교15K09418(TM)의 연구보조금인 가네하라 이치로의학재단의 연구보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 스즈켄 기념재단(TM)의 연구보조금.

1. 면역 침전
참고: 우리는 다음 섹션에 설명된 바와 같이 비 나트륨 도데실 황산염 (SDS) 용해 완충및 구연산염 용출을 사용했습니다. 그러나, 대안적인 사내 면역침전 기술의 사용은 LC-MS/MS 샘플을 준비하기 위해 또한 적용될 수 있다.
<ol><li>에피토프 태그 단독 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 가진 트랜스펙트 배양 세포. 대표적인 데이터를 획득하기 위해, G774 세포(1 x 10...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

우리는 이전에 온 막 소화 기술에 선행된 LC-MS/MS를 사용하여 산화된 저밀도 지단백에 있는 아폴리포단백질 B-100의 산화수정의 분석을 기술했습니다 6. 본 연구에서, 우리는 면역 침전과 이 기술을 결합하고 몇몇 calpain-6 관련 단백질을 확인했습니다. 이러한 신규 한 기술은 후보 관련 단백질에 대한 편리한 스크리닝 방법을 나타낸다. Calpain-6는 단백질-단백질 상호작용<sup class="xref"...

단백질은 살아있는 유기체에서 구성적인 역할을 하지만, 세포 내 환경에서 지속적으로 합성, 처리 및 저하됩니다. 더욱이, 세포내 단백질은 자주 물리적으로 그리고 생화학적으로 상호 작용하며, 이는 하나 또는 둘 다의 기능에 영향을 미치는 1,2,3. 예를 들어, 진핵 번역 개시 인자 4A3(eIF4A3)과 스플리케오솜 관련 단백질 상동체 CWC22의 직접 결합은 엑소온 접합 복합체4의조립에 필요하다. 이와 일치하여, CWC22에 대한 친화력이 결여된 eIF4A3 돌연변이체는 엑온 접합복합체 구동 mRNA 접합을 용이하게 하지 못한다 4. 따라서, 단백질 상호 작용의 연구는 세포 기능뿐만 아니라 생리학적 조절의 정확한 이해를 위해 중요합니다.
질량 분석법 (MS)에 있는 최근 어드밴스는 단백질 단백질 상호 작용의 포괄적인 분석에 적용되었습니다. 예를 들어, 내인성 단백질의 공동 침전 또는 외인성 으로 그들의 관련 단백질과 함께 태그가 부착된 단백질을 도입하고, MS 분석에 이어, 새로운 단백질 상호작용의 식별을 가능하게한다5. 그러나, MS/MS 분석의 한 주요 병목 현상은 단백질 샘플의 tryptic 소화에서 가난한 복구. 세포 용해제에 대한 단백질 분석을 수행하기 위해, 인젤 및 온 막 소화 기술은 일반적으로 MS / MS 샘플을 준비하기 위해 사용됩니다. 우리는 이전에 온 막 소화 기술 6와 인 젤 소화절차를 비교하고, 후자는 더 나은 서열 범위와 연관되었다는 것을 보여주었습니다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인은 유기 용제7,8의고농도에 기계적으로 견고하고 내성이 있기 때문에 이러한 목적에 적합할 수 있으며, 고정화의 효소 소화를 허용한다. 80 % 아세토니트릴 9의존재에 단백질 . 더욱이, 막에 고정화는 표적 단백질에 있는 형태 변경을 유도할 수 있고, 시도소화 효율에 있는 개선으로 이끌어 내는10. 따라서, 이 문서에서는, 우리는 온 막 소화 기술을 사용하여 단백질 상호 작용의 면역 침전-LC/MS/MS 분석의 사용을 기술했습니다. 이 간단한 방법은 비 전문 실험실에서도 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하게 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

수많은 세포내 단백질은 세포내 및 세포외 상황에 따라 물리적으로 상호 작용합니다. 실제로, 세포 기능은 주로 세포 내 단백질-단백질 상호 작용에 따라 달라 집니다. 따라서, 이러한 상호 작용에 관한 연구는 생리 적 프로세스의 이해를 촉진 하는 데 필수적이다. 질량 분석법 (MS) 분석에 선행된 관련 단백질의 공동 침전은, 새로운 단백질 상호 작용의 확인을 가능하게 합니다. 이 연구에서는, 우리는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위한 온 막 소화와 결합된 면역 침전 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 분석의 새로운 기술의 세부사항을 제공했습니다. 이 기술은 원유 면역 침전제에 적합하며 단백질 분석의 처리량을 향상시킬 수 있습니다. 태그가 지정된 재조합 단백질은 특이적 항체를 사용하여 침전되었고; 다음으로, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 조각에 블린된 면역침전제는 환원 알킬화를 행하였다. 트립시니화 후, 소화된 단백질 잔기를 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였고, 이 기술을 사용하여, 우리는 여러 후보 관련 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 이 방법은 새로운 단백질-단백질 상호작용의 특성화에 편리하고 유용하다.

전술한 절차에 의해, 면역침전제는 LC-MS/MS를 사용하여분석하였다(도 1). 외인성 유래 단백질(다른 종 및 IgGs의 단백질)을 배제한 후, 17개의 단백질이 칼파인-6-관련면역침전제(표 1)에서 확인되었고, 15개의 단백질은 GFP 관련 면역침전제에서 확인되었다. 표2). 칼파인-6 및 GFP 관련 단백질 중, 11개는 면역침전제</s...

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Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

단백질 단백질 상호 작용을 연구하는 것은 몇몇 필드에 있는 생리적인 과정을 이해하기 위한 필수불가결합니다. 이 비디오에서는 연구원이 MS에 의한 결합 단백질에 대한 포괄적인 분석을 편리한 방식으로 수행할 수 있는 온멤브레인 소화 기법을 소개합니다. 이 기술의 주요 장점은 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의한 단백질의 분리가 필요하지 않기 때문에 조잡한 면역 침전제에 대한 프로테오믹 분석의 처리량을 향상시킬 수 있다는 것이다.항체를 자기 구슬에 결합하기 시작하여, 구연산 인산염 완충제의 500 마이크로리터에 구슬과 항GFP 항체를 혼합하여. 실온에서 1시간 동안 50 RPM에서 혼합물을 회전시합니다. 그리고 1%폴리소르바트(20)를 함유한 구연산염 완충액으로 공주구비드를 세 번 세척한다.Lyse 원고 지침에 따라 감염된 세포를 분리합니다. 접시를 긁어 1.5 밀리리터 테스트 튜브로 lysate을 옮킨다. 그런 다음 15, 000 x g에서 원심분리로 lysate를 5 분 동안 지우고 상체를 수집합니다.구연산인산염 완충제 500마이크로리터로 세 번 세척하여 라벨이 없는 자기 구슬을 준비합니다. 마지막 세척 후 버퍼를 제거하고 구슬에 셀 리세이트를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 50 RPM에서 혼합물을 회전시.자기 스탠드에서 자기 분리를 수행하고 세포 리세이트를 수집합니다. 대상 단백질을 면역글로불린컨쥬게이트 구슬에 결합하려면 구슬을 자기 스탠드에 5분간 놓습니다. 구연산 버퍼를 버리고 셀 리세이트를 구슬에 추가합니다.50 RPM에서 1 시간 동안 혼합물을 회전합니다. 대상 단백질을 무미 표적 단백질과 분리하려면 1%의 폴리소르바테 20을 함유한 구연산염 완충제 500마이크로리터로 구슬을 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, 30 마이크로리터의 구연산 버퍼를 추가하고, 구슬이 실온에서 5분 동안 앉아 대상 단백질을 엘로우하게 한다.멤브레인을 준비하기 위해 PVDF 멤브레인을 사용하기 직전에 세척한 수술 가위를 사용하여 3mm 단위로 절단하십시오. 멤브레인 조각을 알루미늄 호일에 놓고 각 조각에 2~5마이크로리터를 추가합니다. 멤브레인이 완전히 건조하기 전에 각 조각에 단백질 용출제의 2 ~5 마이크로 리터를 추가하고 멤브레인 표면이 매트 될 때까지 공기 건조.그런 다음 멤브레인을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에 보관하십시오. 즉시 사용하는 경우 2~30마이크로리터에 탄올을 첨가하여 친수성있게 만듭니다. 파이펫으로 에탄올을 제거하지만 멤브레인이 건조하기 전에 각 튜브에 DTT 기반 반응 용액 200 마이크로리터를 완전히 추가하고 1 시간 동안 섭씨 56도에서 배양하십시오.인큐베이션 후, 반응 용액을 300마이크로리터의 요오도아세아미드 용액으로 대체하고, 45분 동안 어둠 속에서 배양한다. 그런 다음 증류수로 멤브레인을 두 번 씻고 적어도 10 초 동안 소용돌이하여 2 %의 아세토나이트로 한 번 씻으십하십시오. 다이팔성 관련 아세토닐트리어로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있습니다.마스크, 안경 및 장갑은 온멤브레인 소화 절차를 수행할 때 항상 착용해야 합니다. 원고 방향에 따라 트립신을 준비하고 각 멤브레인에 트립신 반응 용액 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 소화를 위해 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 반응 용액을 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 100 마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가합니다. 멤브레인을 섭씨 60도에서 2시간 동안 배양한 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합합니다. 100 마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오.그런 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합합니다. 실험실 필름조각으로 테스트 튜브를 덮고 바늘로 필름에 작은 구멍을 만듭니다. 진공 농축기를 사용하여 용액을 건조시키고 잔류물을 2%의 마이크로리터 10마이크로리터로 용해하십시오.3 분 동안 12, 000 x g에서 튜브를 원심 분리하고 상체관을 샘플 튜브로 옮긴다. 나노 LC/HPLC 시스템에 연결된 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 17개의 단백질은 Calpain-6 관련 면역 절전제에서, 15GFP 관련 면역 절전제에서, 및 11둘 다에서 확인되었다.후보 단백질의 양성 식별을 위해 적어도 하나의 높은 충실도 펩티드 단편의 검출이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. GFP 발현 용해뿐만 아니라 히스톤, 외인성 및 리보솜 단백질에 침전된 단백질은 목록에서 생략되었다. 증류수와 2%아세토닐릴로 시도 소화 전에 멤브레인을 세척하는 것은 단백질에 대한 막 소화 절차에서 가장 중요한 단계입니다.이 방법에 따라, 면역 침전 및 서양 얼룩 분석과 같은 다른 실험을 수행함으로써 표적 단백질의 공동 침전을 확인할 수 있다. 이 간단한 방법은 연구원이 편리하고 고과민한 분석과 새로운 단백질 단백질 상호 작용을 탐구할 수 있게 합니다.

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Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

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