Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de الحماية الدستورية 2012/22190-3 و 2012/08616-8) ، CNPq (Proc. 454214/2014-6 و 429184/2016-6) ، الرؤوس ، PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da جامعه de São Paulo) ، INCT INAIRA (MCT/CNPq/FAPESP/الرؤوس/ FAPEMIG/Fابيرج/FAPESP; 573813/2008-6) ، INCT ريدوكورم (FAPESP/CNPq/الرؤوس ؛ 573530/2008-4) ، برنامج العمل الوطني (PRPUSP; 2011.1.9352.1.8) و CEPID ريدوكوما (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). وتلقي ت. ف. اوليفيرا و ا. ا. و. اوليفيرا منحا دراسية من FAPESP (2012/21636-8 ، 2011/09891-0 ، 2012/08617-4) والرؤوس (Coordenação دي ابيرفيتشونتو دي بسال دي نيفل سوبيريور). وقد حصل علي زمالات من الشركة المذكورة ، وهي السيدة م. ح. ج. ميديروس ، وب. دي ماسسيو ، وب. ح. ن. سالديفا ، والسيد ا. م. لورييرو.
وقد نشرت في الأصل بعض الأرقام والجداول الموجودة في هذا العمل في اوليفيرا A.A.F. et al. السمية الجينية والآثار السمية الجينية في الفئران المعرضة لماده الجسيمات الدقيقة المحيطة المركزة (PM2.5) من مدينه ساو باولو ، البرازيل. الجسيمات وألياف السموم. 15, 40 (2018).

وقد تم الحصول علي أربعه أسابيع من العمر الذكور A/J الفئران ، والممرض محدده مجانا ، من مركز تربيه الماشية المختبرات من Fundação Oswaldo كروز (FIOCRUZ) ، ريو دي جانيرو ، البرازيل ، وتعامل وفقا لذلك إلى لجنه الأخلاق في كليه الطب ، جامعه ساو باولو (البروتوكول no 1310/09).
1. جمع الانسجه الفئرا...

مشكله كبيره وجدت في تحليلات 8-oxodguo من قبل أساليب hplc هو الاستقراء المحتمل لتشكيلها خلال إجراءات العمل من استخراج الحمض النووي ، التحلل الحمضي النووي ، وتركيز الحمض النووي والايزولات22،38. من أجل التقليل من مشكله التشكيل 8-oxodGuo المادية ، فمن المستحسن أضافه ديفيك...

بعض أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) قادره علي أكسده الروابط المزدوجة الكربون من قواعد الحمض النووي وبعض الكربونات في moiety ديوكسيريبوز ، وتوليد القواعد المؤكسدة وفواصل حبلا الحمض النووي1. كجزيء مشحونة سلبا الغنية في ذرات النيتروجين والأكسجين ، والحمض النووي هو أيضا هدف للمجموعات الكهربائية التي تتفاعل بشكل تساهميا مع المواقع النونويه (النيتروجين والأكسجين) ، وإعطاء المنتجات التي تسمي الحمض النووي القناات2. لذلك ، الحمض النووي الأنابيب والأحماض النووية المؤكسدة هي أمثله من آفات الحمض النووي التي هي مفيده العلامات الحيوية لتقييم السمية من المواد التي هي الكتروفيريك ، توليد الكهربائية رد الفعل علي التحول الإحيائي ، أو الحث علي الاكسده1، 2- علي الرغم من ان قواعد الحمض النووي المعدلة يمكن ازالتها من الحمض النووي عن طريق إصلاح الاستئصال القاعدي أو النوكليوتيد (BER أو NER) ، فان التحريض علي عدم التوازن بين توليد وأزاله آفات الحمض النووي لصالح السابق يؤدي إلى زيادة صافيه في مستوياتها في العمل الإضافي للحمض النووي3 < /c5 >. النتائج هي زيادة معدلات طفرة الحمض النووي ، وانخفاض التعبير الجيني ، وتقلص النشاط البروتين2،4،5،6،7، والآثار التي ترتبط ارتباطا وثيقا تطور الامراض. قد تؤثر طفرات الحمض النووي علي وظائف خلوية متنوعة ، مثل إشارات الخلايا ، ودوره الخلايا ، وسلامه الجينوم ، واستقرار التيتيمير ، والنعوت ، وهيكل الكروماتين ، والربط الريبي ، وتوازن البروتين ، والأيض ، والخلايا المبرمجة ، وتمايز الخلية8 ،9. استراتيجيات لإبطاء معدلات الطفرة الخلية وتطوير الامراض المزمنة (مثل السرطان, امراض الأعصاب) تمر من خلال معرفه مصادر الطفرة, من بينها, آفات الحمض النووي وأسبابها.
ومن الأسباب الهامه للضرر الجزيء ، بما في ذلك الحمض النووي وتلف الدهون ، الاصابه بالامراض المزمنة بسبب التعرض للتلوث ، والتهابالمستمر ، والمرض الباثولوجي المرضي (مثل مرض السكري) ، وما إلى ذلك. وعلي سبيل المثال ، فان الراديكالية الهيدروكسيل عاليه التفاعل (OH) شكلت من H2O2 الحد من خلال الانتقال أيونات المعادن (Fe2 +، Cu +) أكسده قواعد الحمض النووي ، والحمض النووي السكر شارده والأحماض الدهنية غير المشبعة في السيطرة علي انتشار معدلات10. من بين 80 التي تتميز بالفعل النيوبواسات المؤكسدة3، والأكثر دراسة واحد هو 8-oxo-7 ، 8-ديهيدروجوانيني (8-oxoGua) أو 8-oxo-7 ، 8-ديهيدرو-2'غوانوسين (8-oxodGuo ، الشكل 1) ، وهي آلافه التي هي قادره علي الحث GT transversions خلايا الثدييات10،11. يتم تشكيلها من قبل أحاديه الاكسده الكترونيه من الغوانين ، أو بواسطة الهيدروكسيل الراديكالية أو الهجوم الأكسجين قميص من الغوانين في الحمض النووي1. الأحماض الدهنية غير المشبعة هي الأهداف الهامه الأخرى للاكسده عاليه التفاعل, مثل •آوه, التي تبدا عمليه الاكسده الدهنية1,12. فانه يعطي ارتفاعا إلى أكاسيد الهيدروجين الأحماض الدهنية التي قد تتحلل لالالديهيدات الكهربائية و ابكسييلديهيديس, مثل مالونوديهايد, 4-هيدروكسي-2-نونينال, 2, 4-ديكادينال, 4, 5-الايبوكسي-(2ه)-ديسينال, hexenal, اكرولاين, كروتونالديهيد, وهي قادره علي تشكيل مغيرات الحمض النووي المبيدات الوراثية ، مثل مالونوديهايد-، propano-، أو etheno ادوكتس1،12،13. القناات etheno 1,n2-etheno-2 '-غوانوسين (1,n2-εdguo, الشكل 1) و 1,n6-ايثينو-2 '-ديوكسينونوسين (1,ن6-εdado, الشكل 1 ) وقد اقترح كالمؤشرات الحيوية المحتملة في الفيزيولوجيا المرضية للالتهاب14،15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> الشكل 1 الهياكل الكيميائية للآفات الحمض النووي الكمية في هذه الدراسة. الدكتور = 2 ' ديوكسيريبوز. وقد تم تعديل هذا الرقم من اوليفيرا وآخرون34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
سمحت الدراسات التي أجريت في أوائل الثمانينات بالكشف الحساس ل 8-oxodGuo بواسطة اللوني السائل عالي الأداء إلى جانب الكشف الكهروكيميائي (HPLC-نماء الطفولة المبكرة). القياس الكمي من 8-oxodguo بواسطة hplc-النماء في الطفولة الباكرة في العديد من النظم البيولوجية التي خضعت لظروف مؤكسده أدت إلى الاعتراف 8-oxodguo كمؤشر حيوي من الضرر قاعده المستحثة بالاكسده في الحمض النووي1,16. علي الرغم من ان قويه والسماح للقياس الكمي من 8-oxodGuo في نطاق fmol منخفضه17, قياسات hplc-النماء في مرحله الطفولة المتوسطة تعتمد علي دقه الوقت الاحتفاظ التحليلية لتحديد التحليل وعلي القرار اللوني لتجنب التدخلات من مكونات عينه أخرى. كما يتطلب الكشف الكهروكيميائية استخدام الملح (علي سبيل المثال ، فوسفات البوتاسيوم ، خلات الصوديوم) في المرحلة المتنقلة ، والحفاظ علي الظروف التحليلية المناسبة يحتاج العمود الروتيني والمعدات وقت التنظيف.
بدلا من ذلك ، فان استخدام الحمض النووي البكتيرية إصلاح الانزيم الحمض النووي الجليكوسيلاسي (fpg) و ، بعد ذلك ، الإنسان 8-oxoguanine جليكوسيلاسي 1 (hOGG1) ، للكشف عن وأزاله 8-oxogua من الحمض النووي ، برزت كوسيلة لتحريض الحمض النووي القلوي عطوب مواقع. يتم تحويل المواقع القلوية عطوب إلى فواصل حبلا الحمض النووي والسماح للقياس الدقيق غير المباشر عاليه جدا من 8-oxogua القلوية خليه واحده هلام الكهربائي ("فحص المذنب"). الحساسية العالية وإنجاز التحاليل دون الحاجة إلى استخراج الحمض النووي الخلوي هي المزايا الرئيسية لهذا النوع من الفحص. فانه يعطي ادني مستويات الحالة الثابتة من 8-oxoGua في الحمض النووي ، عاده 7-10 مرات اقل من المستويات التي تم الحصول عليها من قبل الأساليب التحليلية الحيوية علي أساس HPLC. ومع ذلك ، فمن قياس غير مباشر من 8-oxogua وبعض العيوب هي عدم وجود خصوصية أو الكفاءة غير معروفه لانزيمات الإصلاح المستخدمة1،16،18.
اختبارات المناعية هي مجموعه أخرى من الأساليب المستخدمة للكشف عن 8-oxoGua1 و adducts الحمض النووي exocyclic, مثل 1,n6-dado و 1,n2-dado12. علي الرغم من الحساسية ، والقصور في استخدام الأجسام المضادة للكشف عن آفات الحمض النووي هو عدم وجود خصوصية بسبب التفاعل التبادلي إلى مكونات أخرى من العينات البيولوجية ، بما في ذلك قواعد الحمض النووي الطبيعي1،12. ويمكن أيضا الكشف عن الحمض النووي المبيدات ، بما في ذلك 1 ،n6-Dado و 1 ،n2-dado ، وتحديدها كميا من قبل 32حساسة للغاية المقايسات P-postlabeling12. حساسية عاليه من 32P-التسمية البريدية يسمح باستخدام كميات صغيره جدا من الحمض النووي (علي سبيل المثال ، 10 ميكروغرام) للكشف عن حوالي 1 معقد إضافي لكل 10 10 قواعد طبيعيه19. ومع ذلك ، فان استخدام المواد الكيميائية الراديويه ، وعدم وجود خصوصية كيميائية وانخفاض الدقة هي بعض العيوب19،20.
والتقييد المشترك للأساليب المذكورة أعلاه هو الانتقائية أو التحديد المنخفض للكشف عن الجزيئات المطلوبة. في هذا السيناريو ، HPLC بالاضافه إلى التاين بالكهرباء بالتوازي الطيف الكتلي (HPLC-ESI-MS/MS و HPLC-MS3) تطورت كمعيار الذهب للقياس الكمي من النيونوسيدس المعدلة في المصفوفات البيولوجية ، مثل الحمض النووي والبول والبلازما واللعاب 1 , 19 , 20. مزايا HPLC-ESI-MS/ms طرق هي حساسية (عاده في نطاق fmol منخفضه) والخصوصية العالية التي قدمتها ط) الانفصال الكروماتوغرافي ، الثاني) السمة والمعروفة نمط من تجزئه جزيء داخل كتله مطياف الاصطدام الغرفة ، والثالث) القياس الدقيق للكتلة المحددة لتهمه نسبه (m/z) في رد فعل متعددة وضع الرصد1،19. ويضيف استخدام المعايير الداخلية المسمية بالنظائر ميزه التصحيحات المتعلقة بخسائر الجزيئات اثناء التحلل بالحمض النووي والخطوات التحليلية للتحليل ، فضلا عن الاختلافات في التاين التحليلي بين العينات. هو أيضا [ايدس] في التحديد من ال يصح [كروغرفيك] قمة عندما أكثر من واحده قمة يكون حاضره1,12,19,20.
وقد استخدمت عده طرق علي أساس hplc-ESI-ms/ms للقياس الكمي من 8-oxodguo, 1,n6-dado و 1,n2-dado في الحمض النووي المستخرج من عينات بيولوجية مختلفه12,15,20 ،21،22،23،24،25،26،27،28،29 . الجسيمات الدقيقة (PM2.5) تحمل المواد الكيميائية العضوية وغير العضوية ، مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الدوريات ، نيترو-pahs ، الديهيديس ، كيتون ، والأحماض الكربوكسيليه ، الكينولين ، والمعادن ، والأيونات القابلة للذوبان في الماء ، والتي قد تحفز التهاب الاكسده ، والظروف التي تحبذ حدوث الضرر جزيء والمرض30،31،32،33. نقدم هنا التحقق من صحة HPLC-ESI-MS/MS الأساليب التي تم تطبيقها بنجاح للقياس الكمي من 8-oxodGuo ، 1 ،n6-Dado و 1 ،n2-dado في الرئة والكبد والكلي الحمض النووي من الفئران A/J لتقييم اثار المحيطة PM2.5 التعرض34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

الحمض النووي والأحماض النووية المؤكسدة هي أمثله من آفات الحمض النووي التي هي مفيده العلامات الحيوية لتقييم السمية من المواد التي هي الكتروفيريك ، توليد الكهربائية رد الفعل علي التحول الإحيائي ، أو الحث علي الاكسده. من بين النيوبيواسات المؤكسدة ، والأكثر دراسة واحد هو 8-oxo-7 ، 8-ديهيدروجوانيني (8-oxoGua) أو 8-اوكسو-7 ، 8-ديهيدرو-2 '-غوانوسين (8-oxodGuo) ، وهو البيولوجية من الضرر قاعده المستحثة بشكل مؤكسد في الحمض النووي. الديهيديس و ابكسييلديهيديس الناتجة عن عمليه الاكسده الدهنية هي جزيئات كهربية قادره علي تشكيل أنابيب الحمض النووي المتحولة وراثيا ، مثل القناات etheno 1 ،n2-etheno-2'-غوانوسين (1 ،n2- εdGuo) و 1,n6-ايثينو-2 '-ديوكسينونوسين (1,ن6-εdado), التي تم اقتراحها كمؤشرات الحيوية المحتملة في الفيزيولوجيا المرضية للالتهاب. والأساليب الانتقائية والحساسة لقياسها في الحمض النووي ضرورية لوضع استراتيجيات وقائية لإبطاء معدلات طفرة الخلايا وتطور الامراض المزمنة (مثل السرطان والامراض التنكسية العصبية). ومن بين الطرق الحساسة المتاحة للكشف عنها (اللوني السائل عاليه الأداء إلى جانب كاشفات الطيف الكهروكيميائية أو ترادفية ، فحص المذنب ، اختبارات المناعة ، 32P-التسميات البريدية) ، والأكثر انتقائية هي تلك التي تستند علي اللوني السائل عالي الأداء إلى جانب الطيف الكتلي الترادفي (HPLC-ESI-MS/MS). الانتقائية هي ميزه أساسيه عند تحليل العينات البيولوجية المعقدة و HPLC-ESI-MS/MS تطورت كمعيار الذهب للقياس الكمي من النيونوسيدس المعدلة في المصفوفات البيولوجية ، مثل الحمض النووي والبول والبلازما واللعاب. ويضيف استخدام المعايير الداخلية المسمية بالنظائر ميزه التصحيحات المتعلقة بخسائر الجزيئات اثناء التحلل بالحمض النووي والخطوات التحليلية للتحليل ، فضلا عن الاختلافات في التاين التحليلي بين العينات. كما انه يساعد في تحديد ذروه الكروماتوغرافي الصحيحة عند وجود أكثر من ذروه واحده.
نقدم هنا التحقق من صحة حساسة ودقيقه ودقيقه HPLC-ESI-MS/MS الأساليب التي تم تطبيقها بنجاح لتحديد الكمية من 8-oxodGuo ، 1 ،ن6-dado و 1 ،n2-dado في الرئة والكبد والكلي الحمض النووي للفئران A/J تقييم اثار التعرض المحيطة PM2.5 .

متوسط تركيزات الحمض النووي (± SD) التي تم الحصول عليها من الفئران الكبد (~ 1 ز الانسجه), الرئة (~ 0.2 g الانسجه) والكلي (~ 0.4 g الانسجه) كانت, علي التوالي, 5,068 ± 2,615, 4,369 ± 1,021, و 3,223 ± 723 ميكروغرام/مل في الحجم النهائي من 200 μL. ويظهر كروماتوجرام الممثل الذي تم الحصول عليه من قبل HPLC-أب من الح?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

القياس الكمي لثلاثه آفات الحمض النووي عن طريق قياس الطيف الكتلي وتقييم مستوياتها في انسجه الفئران المعرضة للجسيمات الدقيقة المحيطة

ونحن هنا وصف طرق لتحديد الكمية الحساسة ودقيقه من آلافات 8-oxo-7 ، 8-ديهيدرو-2'غوانوسين (8-oxodGuo) ، 1 ،ن6-ايثينو-2 '-ديوكسينونونوسين (1 ،ن6-dado) و 1 ،n- غوانوسين (1,N2-DGUO) في الحمض النووي. وقد طبقت الطرق علي تقييم اثار الجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5) في الانسجه (الرئة والكبد والكلي) من الفئران المكشوفة A/J.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

تسمح الطرق المعروضة هنا بالتقدّم الكمي لآفات الحمض النووي المستحثة بالتأكسد، مما يساهم في فهم الآليات الفيزيولوجية المرضية التي قد تكون مستهدفة للوقاية من الأمراض وعلاجها. الانتقائية والحساسية هي المزايا الرئيسية. الانتقائية هي ميزة أساسية عند العمل مع العينات البيولوجية المعقدة.HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب تطورت كمعيار الذهب لهذا النوع من الكم مع المصفوفات البيولوجية. الإجهاد التأاكسى هو حدث شائع لمختلف العمليات الفيزيولوجية. وقد تم الكشف عن زيادة مستويات الإدينو أدويتو في الأنسجة أو البول من المرضى الذين يعانون من أمراض التهابية.كما توفر آفات الحمض النووي معلومات عن الأحداث المحلية الناجمة عن التعرض للملوثات. إذا تم زيادة آفات الحمض النووي، قد يكون التعرض على المستوى الذي يزيد من خطر الإصابة بالسرطان، على سبيل المثال. الآفات يمكن أن تكون كمية في الحمض النووي من أي نظام الخلوية وبدلا من ذلك في البول والبلازما، واللعاب ثقافة المتوسطة مع التكيف في إعداد العينة.للبدء، استخدم لوحة الثقافة وضعت على الجليد كقاعدة لقطع قطعة من الأنسجة مع مشرط. تزن غرام واحد من الأنسجة في كل 50 ملليلتر توج أنبوب للاستخدام الفوري. الحفاظ على الأنسجة المتبقية على الجليد الجاف قبل تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.إلى كل أنبوب، إضافة 10 ملليلتر من حل تحلل الخلايا التجارية التي تحتوي على 0.5 ميلمولار deferoxamine، والحفاظ على الجليد. تعيين التجانس الأنسجة إلى سرعة منخفضة، حوالي 60 إلى 90 دورة في الدقيقة. التجانس الأنسجة على الجليد لبضع دقائق حتى الحل هو من دون شظايا الأنسجة.ثم، إضافة 150 ميكرولترات من محلول البروتينات K لكل عينة متجانسة. يهز الأنابيب عن طريق الانعكاس، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في الصباح، إضافة 40 ميكرولترات من محلول ريبونوكليس A، يهز من قبل عكس، والحفاظ على الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.إضافة خمسة ملليلتر من محلول الترسيب البروتين التجاري، دوامة بقوة، والطرد المركزي في 2،000 مرات ز، أربع درجات مئوية، لمدة 10 دقائق. نقل supernatants إلى أنابيب توج 50 ملليلتر التي تحتوي على 10 ملليلتر من isopropanol الباردة. عكس الأنابيب بلطف عدة مرات حتى الملاحظة من الحمض النووي المترسب.استخدام ماصة باستور مغلقة في نهاية لجمع الحمض النووي المترسب. نقل الحمض النووي التي تم جمعها إلى أنابيب تحتوي على أربعة ملليلترات من 10 ملليمولار تريس العازلة وd deferoxamine واحد ملليمولار في رقم هيدروكلوري سبعة إلى حل. بعد أن يذوب الحمض النووي تماما في الأنابيب، إضافة أربعة ملليلتر من محلول الكلوروفورم التي تحتوي على 4٪ من الكحول isoamyl إلى كل أنبوب.عكس الأنابيب 10 مرات لتجانس, الطرد المركزي في 2,000 مرات ز, أربع درجات مئوية, لمدة 10 دقائق, ونقل المراحل العليا إلى أنابيب جديدة. كرر غسل المرحلة العليا مع محلول الكلوروفورم مرتين ازيد من ذلك. ثم، إضافة ثمانية ملليلتر من الإيثانول المطلق و 0.4 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم خمسة المولر لتسريع الحمض النووي.مرة أخرى، وجمع الحمض النووي المُعجل، ونقله إلى ثلاثة ملليلترات من الإيثانول 70٪. كرر غسل مع 70٪ الإيثانول مرة أخرى. تخلص من محلول الإيثانول بحذر، وعكس الأنابيب التي تحتوي على الحمض النووي المترسب على الورق الماص لإزالة محلول الفائض.بعد إعداد عينات التحلل المائي للحمض النووي بمعيار 15N5 النظائري 1، N6-etheno-deoxyadenosine و15N5 النظائرية من 1، N2-etheno-deoxyguanosine وفقا للمخطوطة، نقل 10 ميكرومترات من كل عينة إلى أنابيب لتحديد كمي من deoxynucleides العادية من قبل HPLC-UV. يخضع وحدة التخزين المتبقية لاستخراج المرحلة الصلبة. لتنفيذ HPLC، أول إلوت عمود C18 تعلق على خرطوشة C18 SecurityGuard مع تدرج من 0.1٪ حمض الفينيك والميثانول.إعداد برنامج التدرج لتشغيل من صفر إلى 25 دقيقة مع صفر إلى 18٪ الميثانول، من 25 إلى 27 دقيقة مع 18 إلى 0٪ الميثانول، ثم من 27 إلى 37 دقيقة مع 0٪ الميثانول بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة و 30 درجة مئوية. بعد ذلك، حقن حجم بين اثنين وستة ميكرولتردات لكل عينة محفوظة للكمية ديوكسينويوليوسيدات العادية. تعيين كاشف أبي في 260 نانومتر للتكامل من قمم ديوكسيغوانوسين وديوكسيادينوسين.لأداء استخراج المرحلة الصلبة لتحليل 1، N6-etheno-deoxyadenosine و 1، N2-etheno-deoxyguanosine، تحميل الخراطيش أولا مع سلسلة من الحلول في حجم ملليلتر واحد. إضافة 100٪ الميثانول، والمياه ديون، وعينة الحمض النووي هيدروزيد، والمياه ديوند، 10٪ الميثانول، 15٪ الميثانول، وأخيرا 100٪ الميثانول لجمع. ثم، المضي قدما وفقا للمخطوطة.بعد إعداد عينات التحلل المائي للحمض النووي 15N5 معيار نظائرية من 8-oxo-deoxyguanosine, نقل 80 ميكرولترات من كل عينة إلى قوارير لتحليلها في نظام HPLC-ESI-MS/MS. حجز 20 ميكرولترات المتبقية من أجل تحديد كمية ديوكسيغوانوسين على HPLC-UV، كما فعلت سابقا. لتحليل 8-oxo-deoxyguanosine على HPLC-ESI-MS/MS، elute العمود C18 A مقرونة بخراطيش الأمن C18 مع التدرج من المذيبات A و B بمعدل تدفق 150 ميكرولترتر في الدقيقة و 25 درجة مئوية.تشغيل مضخة ثنائي مع صفر إلى 15٪ من المذيبات B خلال أول 25 دقيقة, 15 إلى 80٪ من المذيب B من 25 إلى 28 دقيقة, 80٪ من المذيب B من 28 إلى 31 دقيقة, 80 إلى 0٪ من المذيب B من 31 إلى 33 دقيقة, و 0٪ من المذيب B من 33 إلى 46 دقيقة. مباشرة أول 16 دقيقة من العمود A مُمدد إلى النفايات. العمود الشرط B من مضخة متساوي الراس مع محلول من 15٪ الميثانول في الماء التي تحتوي على 0.1٪ حمض فورميك بمعدل تدفق 150 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة.بعد ست دقائق، تحقق من الكروماتوغرافية لضمان elutes القياسية 8-oxo-deoxyguanosine من العمود A.خلال الفاصل الزمني 16 إلى 32 دقيقة، والتبديل صمام إلى موقف السماح اتصال بين العمود A والعمود B.إغلاق صمام في 32 دقيقة إلى elute 8-oxo-deoxyguanosine من العمود الثاني والحصول على ذروة حادة الكروموغرافية. لتحليل 1، N6-etheno-deoxyadenosine و 1، N2-etheno-deoxyguanosine، elute عمود C18 مقرونة بخراطيش C18 SecurityGuard مع تدرج من المذيبات A و B بمعدل تدفق 130 ميكرولترز في الدقيقة و 25 درجة مئوية. تشغيل مضخة ثنائية مع 0٪ من المذيب B لأول 10 دقائق، صفر إلى 20٪ من المذيب B لمدة 10 إلى 39 دقيقة، 20 إلى 75٪ من المذيب B من 39 إلى 41 دقيقة، 75٪ من المذيب B من 41 إلى 46 دقيقة، 75 إلى 0٪ من المذيب B من 46 إلى 47 دقيقة، و 0٪ من المذيبات من 47 إلى 60 دقيقة.استخدم صمام التبديل لتوجيه أول 35 دقيقة من الرمز إلى النفايات وكسر 35 إلى 42 دقيقة إلى مصدر ESI. تأكد من أن معايير adduct من العمود في الفاصل الزمني المحدد. دمج قمم 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 النظائرية القياسية من 8-oxo-deoxyguanosine، 1، N6-etheno-deoxydenosine، 15N5 معيار النظائرية من 1، N6-etheno-deoxyadenosine، 1، N2-etheno-deoxyguanosine، و 15N5 النظائرية القياسية من 1، N2-etheno-deoxyguanosine من تحليلات HPLC-ESI-MS/MS.حساب نسب المساحة لمناحن المعايرة والعينات. إنشاء منحنيات المعايرة، وحساب كميات الآفات في كل عينة حقن. دمج قمم ديوكسيغونوسين وديوكسيادينوسين من تحليلات HPLC-UV.استخدام المناطق لإنشاء منحنيات المعايرة، وحساب كميات من ديوكسيغونوسين وديوكسيادينوزين في الحيوانات في كل عينة حقن. حساب الكسور الضروس ل8-oxo-deoxyguanosine على ديوكسيغونوسين، 1، N6-etheno-deoxyadenosine على ديوكسيادينوسين، و 1، N2-etheno-deoxyguanosine على ديوكسيغونوسين، والتي تعطي عدد الآفات لكل مليون ديوكسيغونوسين العادي أو deoxyadenine. يُظهر كروماتوغرام تمثيلي للحمض النووي المنقى الذي تم الحصول عليه من HPLC-UV وجود أربعة ديوكسينويوليسيدات طبيعية، خالية من ريبونوكليوسيدات الحمض النووي الريبي الريبي الريبي، مما يدل على نقاء الحمض النووي.تظهر الكروماتوغرام التمثيلية من HPLC-ESI-MS/MS من 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, و 1, N2-etheno-deoxyguanosine في عينات الحمض النووي للأنسجة الفئران. الكروماتوغرام التي تم الحصول عليها مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية يظهر أربعة ديوكسينويوليوسيدات العادية يائل من العمود الأول حتى حوالي 10 دقيقة، مع فصل جيد من 8-أوكسو-deoxyguanosine، والقضاء على التداخلات غير المرغوب فيها. شيء مهم أن نتذكر لكمية دقيقة هو أن يكون دائما نفس الكميات من المعايير الداخلية في حجم الحقن في منحنيات المعايرة والعينات.ويمكن تكييف الأساليب المعروضة هنا لأغراض القياس الكمي للنويدات الأخرى المعدلة. توسيع نطاق ديوكسينويوليسيدات المعدلة يسمح بفهم أفضل للآليات الفسيولوجية المرضية الكامنة. يمكننا التحقيق في دور الضرر التأسدي في حالات مختلفة مثل التعرض لxenobiotics ، والسكري ، والتحول الخبيث الخلية ، وبالتالي المساعدة على تطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

باستخدام تحليل النشوء والتطور للتحقيق التوكسينات الجينات الأصل

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

الإثراء من البروتينات الدهنية البكتيرية وإعداد ليبوبيبتيديس الطرفي ن للتصميم الهيكلي بالطيف الكتلي

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...