Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Fapesp (和平与安全基金会), cnpq (prc. 454214/2014-6 和 42918m/2016-6)、capes、prpusp (próreitoria de pesquisa da o d sculo)、inct inaira (mct/cnpq/fndc-capese/capese/FEMIG/FAPERJ/FAPESP;Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (Fapsp/cnpqq/capes;Proc. 573530/2008-4), NAP 氧化还原瘤 (PRPUSP;Proc. 2011.1.9352.1.8) 和 CENID 氧化还原瘤 (FAPESP;方案 2012-0797-8)。T. f. Oliveira 和 A. A. F. Oliveira 获得了 FAPESP (Proc. 2012163-8、201-r8891比0、2012/08617-4) 和 CAPES (卫六-德苏格) 和 CAPES (卫六) 的奖学金。M. H. g. Medeiros、P. di Mascio、P. h. n. Saldiva 和 a. p. m. Loureiro 接受了 CNPq 的研究金。
这项工作中的一些数字和表格最初发表在奥利维拉 a. a. f. 等人身上, 对来自巴西圣保罗市的接触浓缩环境微粒物质的小鼠的遗传毒性和表观毒性作用 (PM2.5)。粒子和纤维毒理学.15、40 (2018年)。

从巴西里约热内卢 Oswaldo Cruz 基金会 (FIOCURZ) 实验动物繁育中心获得了四周大的无病原体的雄性阿布 j 小鼠, 并接受了大学医学院道德委员会的相应治疗(第113第十届议定书) 。
1. 收集小鼠组织
<ol><li>用木胺和氯胺酮对动物进行麻醉。对于体重为30克的小鼠, 注射含有2.63 毫克氯胺酮和0.38 毫克木胺的溶液 (不超过2毫升)。</li>
	<li>收集血液 (0.5-1.5 毫升) 进行补充分析 (例如...

采用高效液相色谱法进行的8-oxodguo 分析中发现的一个主要问题是, 在 dna 提取、dna 水解和 dna 水解物浓度 22,38的研究过程中, 可能会诱导其形成。为了最大限度地减少8-Oxodoguo 人工物形成的问题, 建议在所有 DNA 提取、储存和水解溶液中添加脱氧胺, 使用碘化钠碎屑法, 并避免 DNA 提取中的苯酚, 如并且脱氧核糖核酸的用途共计接近100μg 在水解做法, 以最大?...

一些活性氧物种 (ROS) 能够氧化 DNA 碱基的碳双键和脱氧核糖中的一些碳键, 产生氧化碱基和 DNA 链断裂1。作为一种富含氮和氧原子的负电荷分子, DNA 也是与亲核位点 (氮和氧) 共价反应的亲电基团的靶标, 其产物被称为 DNA 加合物2。因此, DNA 加合物和氧化 DNA 碱基是 DNA 病变的例子, 这些病变是对亲电物质的毒性评估、生物转化时产生活性电泳或诱导氧化应激1的有用生物标志物, 2。虽然修改后的 DNA 碱基可以通过碱基或核苷酸切除修复 (BER 或 NER) 从 DNA 中去除, 但诱导 DNA 病变的产生和去除之间的不平衡有利于前者导致他们的 DNA 加班水平净增加 3 </c5 >。结果是 dna 突变率的增加, 基因表达的减少, 蛋白质活性降低2,4,5,6, 7,与疾病的发展。DNA 突变可能会影响多种细胞功能, 如细胞信号转导、细胞周期、基因组完整性、端粒稳定性、表观基因组、染色质结构、RNA 拼接、蛋白质稳态、代谢、凋亡和细胞分化 8 ,9。减缓细胞突变率和慢性病发展 (如癌症、神经退行性疾病) 的策略通过突变来源的知识, 其中包括 DNA 病变及其原因。
由于接触污染物、持续炎症、疾病病理生理学 (如糖尿病) 等原因, 内生异常过度, 是生物分子损伤的重要原因, 包括 DNA 和脂质损伤1。例如, 由过渡金属离子 (Fe2 +, cu+) 还原的 h2o2 形成的高反应羟基自由基 (oh) 氧化扩散控制下的 DNA 碱基、dna 糖层和多不饱和脂肪酸率10。在已经有特征的80种氧化核酸酶3中, 研究最多的是 8-oxo-7, 8-二氢鸟嘌呤 (8-oxoGua) 或 8-oxo-7-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-奥科德戈戈,图 1), 这种病变能够诱导 gt 转化。哺乳动物细胞10,11。它是由鸟嘌呤的单电子氧化或 dna 1 中的羟基自由基或鸟嘌呤的单氧攻击而形成的。多不饱和脂肪酸是高活性氧化剂的其他重要靶点, 如·oh , 它启动了脂质过氧化1,12的过程。它产生脂肪酸过氧化氢, 可能分解为亲电醛和环氧醛, 如丙二醛, 4-羟基-2-非烯, 2, 4-十二烷基, 4, 5-py-(2e)-十二烯, 六烯, 阿克罗林, 氯酮醛, 这些能够形成诱变的外环 dna 加合物, 如丙二醛、丙醇或乙二醇加合物1,12,13。乙二醇加合物 1,n2-乙二 '-脱氧鸟苷 (1,n2-dguo,图 1) 和 1,n6-乙二-2 '-脱氧腺苷 (1,n6-dado,图1) 已被认为是炎症病理生理学中潜在的生物标志物 14,15。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> 图 1.本研究量化的 DNA 病变的化学结构.dR = 2 脱氧核糖。奥利维拉等人对这一数字作了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
20世纪80年代初进行的研究使其能够通过高效液相色谱结合电化学检测 (HPLC-ECD) 对 8-氧郭进行灵敏检测。在氧化条件下, hplc-ecd 对 8-氧果进行定量, 使人们认识到, 8-氧果是 dna1,16中氧化诱导碱基损伤的生物标志物。虽然在低 fmol 范围17中, Hplc-ecd 测量具有鲁棒性, 并允许对 8-氧郭进行量化, 但它依赖于分析物保留时间的准确性进行分析物的识别, 并依靠色谱分辨率来避免干扰。其他样品成分。由于电化学检测需要在流动阶段使用盐 (例如, 磷酸钾、醋酸钠), 因此维持适当的分析条件需要常规的柱和设备清洗时间。
或者, 使用细菌 DNA 修复酶甲胺吡啶 dna 糖基酶 (FPG) 和人类8-oxoguanine 糖基酶 1 (Gggg1), 从 DNA 中检测和去除 8-Xooga, 作为诱导 DNA 碱的一种方法网站。碱基不稳定位点转化为 DNA 链断裂, 并允许非常敏感的间接定量 8-奥克瓜通过碱性单细胞凝胶电泳 ("彗星检测")。高灵敏度和完成的分析, 而不需要细胞 DNA 提取是这种类型的检测的主要优点。它给出了 DNA 中 8-氧瓜的最低稳态水平, 通常比基于高效液相色谱的生物分析方法获得的水平低7-10 倍。然而, 它是一个间接测量的8-oxoGua 和一些缺点是缺乏特异性或未知的效率, 使用的修复酶 1,16,18。
免疫检测是用于检测 8-oxoGua 1 和外环 DNA 加合物的其他方法, 如 1,n6-Dado 和 1,n2-dowo12。尽管灵敏度很高, 但使用抗体检测 dna 病变的一个缺点是, 由于与生物样本的其他成分 (包括正常 dna 碱基1,12)的交叉反应, 缺乏特异性。外环 DNA 加合物, 包括 1,n-dAdo 和 1,n2-dguo, 也可以检测和量化高度敏感的32p 后标记检测12。32p 后贴标的高灵敏度允许使用极少量的 dna (例如, 10 微克) 来检测每10个正常碱基中大约1个加合物 19.然而, 放射性化学品的使用、缺乏化学特异性和精度低是一些缺点 19、20。
上述方法的一个共同局限性是检测所需分子的选择性或特异性较低。在这种情况下, HPLC 与电喷雾电离串联质谱 (HPLC-ESI-MSMS 和 HPLC-MS3) 相结合, 发展成为在 dna、尿液、血浆和唾液等生物基质中定量修饰核苷的黄金标准1,19,20. hplc-esi-mmsms 方法的优点是灵敏度 (通常在低 fmol 范围内) 和高特异性提供的 i) 色谱分离, ii) 在质量内分子分裂的特征和已知模式分光计碰撞室, 以及 iii) 在多反应监测模式1,19中准确测量所选质量电荷比 (m/z)。使用同位素标记的内部标准增加了在 DNA 水解和分析物富集步骤中更正分子损失的优势, 以及样品之间分析物电离的差异。当一个峰出现 1、12、19、20时, 它还有助于识别正确的色谱峰。
在从不同生物样本 12、15、20中提取的 dna 中, 采用了几种基于 hplc-esi-mmsms 的方法对其进行了定量. , 21,22,23,24,25, 26,27, 28,29.细颗粒 (PM2.5) 携带有机和无机化学物质, 如多环芳烃 (pahs)、硝基多环芳烃、醛、酮、羧酸、奎诺、金属和水溶性离子, 这些化学物质可能会引起炎症和氧化应激, 有利于生物分子损伤发生的条件和疾病30,31,32,33。我们在这里验证了 HPLC-ESI-MMSMS 方法, 成功地应用于定量的 8-oxodGuo, 1,n6-do和 1,n2-dguo 在肺, 肝脏和肾脏 do对阿美鼠的评估环境 PM2.5曝光的影响34。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA 加合物和氧化 DNA 碱基是 DNA 病变的例子, 是对亲电物质的毒性评估、生物转化后产生活性电极或诱发氧化应激的有用生物标志物。在氧化核酸酶中, 研究最多的是 8-氧-7-8-二氢鸟嘌呤 (8-Xocogua) 或 8-oxo-7-8-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-氧果), 这是氧化诱导的 DNA 碱基损伤的生物标志物。脂质过氧化过程产生的醛和环氧醛是能够形成诱变外环 DNA 加合物的亲电分子, 如乙二烯加合物 1,n2-乙二-2 '-脱氧鸟苷 (1,n2-1,n6-乙二-2 '-脱氧腺苷 (1,n 6-dado), 已被认为是炎症病理生理学中潜在的生物标志物。选择和敏感的方法, 他们在 DNA 中量化是必要的制定预防战略, 以减缓细胞突变率和慢性病的发展 (例如, 癌症, 神经退行性疾病)。在可用于检测它们的敏感方法 (与电化学或串联质谱检测器耦合的高效液相色谱 (彗星分析、免疫检测、 32p 后标记) 中, 最具选择性的是基于这些方法。在高效液相色谱联接到串联质谱 (HPLC-ESI-MSMS)。在分析复杂的生物样本时, 选择性是一个重要优势, HPLC-ESI-MMSY 演变为 DNA、尿液、血浆和唾液等生物基质中修饰核苷的黄金标准。使用同位素标记的内部标准增加了在 DNA 水解和分析物富集步骤中更正分子损失的优势, 以及样品之间分析物电离的差异。当存在多个峰时, 它还有助于识别正确的色谱峰。
我们在这里提出了验证敏感, 准确的 HPLC-ESIC-MMSMS 方法, 成功地应用于定量的 8-oxodGuo, 1,n-dAdo和1,n-dAdo 在肺, 肝脏和肾脏 do在肺, 肝脏和肾脏 do环境 PM2.5暴露的影响的评估。

小鼠肝脏 (约1克组织)、肺 (约0.2 克组织) 和肾脏 (约0.4 克组织) 的平均 DNA 浓度 (±sd) 分别为 5, 068±665、4, 369±0200和 3, 223±723μml, 最终体积为200微米。图 3显示了由 HPLC-DAD 获得的纯化 dna 的代表性色谱图。从 RNA 核糖核酸中释放的四种 2 '-脱氧核苷的存在, 在相应的 2 '-脱氧核苷之前立即发出, 显示了 DNA 的纯度。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

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Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA 损伤的质谱定量及水平评价

我们在这里描述的方法敏感和准确定量的病变 8-氧-7-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-氧 ',1, n6-乙基 2 '-脱氧腺苷 (1,n6-do)和 1,n2-在 DNA 中的乙二-2 '-脱氧鸟苷 (1,n2-dguo)。应用该方法对暴露的阿可姆小鼠组织 (肺、肝、肾) 环境细颗粒物 (PM2.5) 的影响进行了评价。

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

这里介绍的方法允许对氧化应激引起的DNA病变进行定量，有助于理解病理生理机制，这些机制可能是预防和治疗疾病的目标。选择性和灵敏度是主要优势。选择性是处理复杂生物样品时的基本优势。HPLC 与串联质谱法相结合，演变为此类生物基质定量的黄金标准。氧化应激是不同病理生理过程的一个常见事件。在炎症性疾病患者的组织或尿液中检测到乙三分泌水平增加。DNA病变还提供有关接触污染物引发的内源性事件的信息。例如，如果DNA病变增加，暴露可能达到增加癌症发展风险的水平。病变可以从任何细胞系统的DNA中量化，也可以在尿液、血浆、唾液培养基中进行量化，并适应样本制备。首先，使用放在冰上的培养板作为底座，用手术刀切割一块组织。每个 50 毫升封顶管中称一克组织，供立即使用。将剩余组织放在干冰上，然后储存在零下80摄氏度。在每个管上，加入10毫升含有0.5毫升二恶高金的商业细胞解解溶液，并留在冰上。将组织均质器设置为低速，大约 60 到 90 rpm。使冰上组织均质几分钟，直到溶液没有组织碎片。然后，在每个均质样品中加入150微升蛋白酶K溶液。通过反转摇动管子，并在室温下过夜。早晨，加入40微升核糖酶A溶液，通过反转摇动，并将管子保持室温两小时。加入5毫升商业蛋白沉淀溶液，大力旋转，在2000倍g，4摄氏度的离心机，持续10分钟。将超钠转移到含有 10 毫升冷异丙醇的 50 毫升封顶管中。轻轻反转管子几次，直到观察沉淀的DNA。使用末端关闭的巴斯德移液器收集沉淀的 DNA。将收集的DNA转移到含有四毫升10毫升三叶草缓冲液和pH7分之一毫升二恶八千胺的管子中溶解。DNA完全溶解在管子中后，将含有4%异丙醇的氯仿溶液加入四毫升。倒置管10次进行均质化，在2000次g，4摄氏度的离心机，10分钟，并转移上相到新的管。使用氯仿溶液重复上相的洗涤两次。然后，加入8毫升绝对乙醇和0.4毫升的五摩尔氯化钠溶液，沉淀DNA。再次，收集沉淀的DNA，并转移到三毫升的70%乙醇。用70%乙醇重复洗涤一次。请小心丢弃乙醇溶液，并反转吸收纸上含有沉淀DNA的管子，以去除多余的溶液。在根据手稿制备具有15N5同位素标准的DNA水解样品后，将HPLC-UV对正常脱氧核苷酸进行定量化。将剩余体积进行固相提取。要执行 HPLC，请首先将 C18 列连接到 C18 安全卫士墨盒上，其梯度为 0.1% 甲酸和甲醇。设置梯度程序，从零到25分钟，甲醇为零至18%，从25到27分钟，用18至0%甲醇运行，然后从27分钟运行到37分钟，以每分钟1毫升和30摄氏度的流量运行0%甲醇。之后，为保留用于正常脱氧核苷酸定量的每个样品注射2至6微升的体积。将 DAD 探测器设置为 260 纳米，用于整合脱氧瓜诺辛和脱氧二甲苯二辛峰。要对分析 1、N6-乙苯甲酸酯和 1、N2-乙氧-脱氧瓜诺辛进行固相提取，首先在一千升的体积下用一系列溶液加载墨盒。加入100%甲醇、去维水、水解DNA样品、去维水、10%甲醇、15%甲醇，最后100%甲醇进行收集。然后，按照手稿进行。在制备了8-牛-脱氧瓜诺辛的DNA水解样品15N5同位素标准后，将每个样品的80微升转移到小瓶中，在HPLC-ESI-MS/MS系统中进行分析。保留剩余的 20 微升，用于在 HPLC-UV 上定量除氧瓜诺辛，如前所述。为了分析HPLC-ESI-MS/MS上的8-氧化脱氧瓜诺辛，将C18列 A耦合到具有溶剂 A 和 B 梯度的 C18 安全卫士墨盒中，流速为每分钟 150 微升，温度为 25 摄氏度。在25分钟内用溶剂B的零至15%运行二元泵，25至28分钟用溶剂B运行15至80%，28至31分钟用80%的溶剂B运行，31至33分钟用80%至0%的溶剂B运行，33至46分钟用80%至0%的溶剂B运行。溶剂B的80%至0%在33至46分钟之间。引导 A 列前 16 分钟浪费。条件列B由等电位泵与溶液15%甲醇在水中含有0.1%甲酸，流量为每分钟150微升。6 分钟后，检查色谱，确保从 A 柱到 32 分钟间隔内从 A 列分离出 8-oxo-脱氧瓜诺辛标准阀，将阀门切换到允许 A 柱和 B 柱之间连接的位置。在 32 分钟内关闭阀，从第二列中分离出 8-oxo-脱氧瓜诺辛，并获得一个锐利的色谱峰值。为了分析 1、N6-乙氧乙酯和 1、N2-etheno-脱氧瓜诺辛，将一个 C18 柱耦合到具有溶剂 A 和 B 梯度的 C18 安全卫士盒中，流速为每分钟 130 微升，温度为 25 摄氏度。使用 0% 的溶剂 B 运行二进制泵前 10 分钟， 10至39分钟为溶剂B的零至20%，溶剂B的20至75%为39至41分钟，75%的溶剂B为41至46分钟，75至0%的溶剂B为46至47分钟，47至60分钟为溶剂B的0%。47至60分钟为溶剂B。使用开关阀将前 35 分钟的 Eluent 废物和 35 到 42 分钟的分数引导到 ESI 源。确保指定标准在设定的间隔内从列中分出。集成8-牛-脱氧瓜诺辛15N5同位素标准的8-牛-脱氧瓜诺辛的峰值， 1、N6-乙氧乙酸酯、15N5同位素标准1、N6-乙三-脱氧二甲酸、1、N2-乙氧二氧氨酸、15N5同位素标准1、N2-乙氧二氧氨酸（HPLC-ESI-MS/MS）分析。计算校准曲线和样本的面积比率。建立校准曲线，并计算每个注射样本的病变量。从 HPLC-UV 分析中集成脱氧瓜诺辛和脱氧二甲苯丙氨酸的峰值。使用区域建立校准曲线，并计算每个注射样本中动物中的脱氧瓜诺辛和脱氧二甲苯二氨酸的量。计算8-牛-脱氧瓜诺辛对脱氧瓜诺辛，1，N6-乙氧-脱氧二甲氨酸在脱氧二氧氨酸，和1，N2-乙氧-脱氧瓜诺辛超过脱氧瓜诺辛，这提供病变数每百万正常脱氧瓜诺辛或脱氧二氧二氧诺辛。HPLC-UV 获得的纯化 DNA 的代表性色谱图显示存在四种正常脱氧核苷，不含RNA核糖苷，表明 DNA 纯度。显示了来自HPLC-ESI-MS/MS的代表性色谱图，包括8-氧化-脱氧瓜诺辛、1、N6-乙氧-脱氧-脱氧二氧合成素和小鼠组织DNA样本中的1、N2-etheno-脱氧瓜诺辛。通过紫外线检测获得的色谱图显示，从第一列到约10分钟，4个正常的脱氧核苷酸从8-牛-脱氧冠氨酸良好分离，消除了不必要的干扰。对于精确定量，要记住的一个重要事情是，在校准曲线和样品中，注射量中始终具有相同的内部标准。此处介绍的方法可适用于其他改性脱氧核苷酸的定量。扩大改性脱氧核苷酸的带子，可以更好地了解潜在的病理生理机制。我们可以研究氧化损伤在不同情况下的作用，如接触异种生物、糖尿病和细胞恶性转化，从而帮助制定预防和治疗策略。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

微波辅助植物病毒病的快速诊断用透射电子显微镜

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

科研

免疫与感染

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

革兰从血培养液使用MALDI-TOF质谱阴性细菌快速鉴定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

益生菌酵母的转型及其胃肠道粘膜免疫组织恢复继小鼠口服灌胃

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

黏膜衬里流体为体内上呼吸道免疫介质水平量化的无创性取样

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

应用系统进化分析研究真核基因的起源

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

一种新型大鼠自然杀伤细胞无饲养系统的研究体外

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

质谱法富集细菌脂蛋白及 n-端脂肽的制备结构测定

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...