Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 og 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 og 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) og CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira og A. A. F. Oliveira modtog stipendier fra FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) og CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva og A. P. M. Loureiro modtog stipendier fra CNPq.
Nogle tal og tabeller i dette arbejde blev oprindeligt offentliggjort i Oliveira A.A.F. et al. genotoksiske og epigeno toksiske virkninger hos mus eksponeret for koncentrerede omgivende fine partikler (PM2,5) fra São Paulo City, Brasilien. Partikel-og fiber toksikologi. 15af 40 (2018).

Fire uger gamle mandlige A/J-mus, specifikt patogenfrie, blev indhentet fra avls centret for laboratoriedyr i Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, og blev i overensstemmelse hermed behandlet i den etiske komité for det medicinske fakultet, universitetet af São Paulo (protokol no 1310/09).
1. indsamling af mus væv
<ol><li>Bedøvelses dyret med xylazin og ketamin. Til en mus med 30 g legemsvægt indsprøjtes en opløsning (højst 2 mL) indeholdende 2,63 m...

Et stort problem, der findes i 8-oxodguo-analyserne ved HPLC-metoder, er den mulige induktion af dets dannelse under arbejdsprocedurerne for DNA-ekstraktion, DNA-hydrolyse og koncentration af DNA-hydrolysater22,38. For at minimere problemet med 8-oxodGuo artifaktuel dannelse anbefales det at tilføje deferoxamin til alle DNA-ekstraktions-, opbevarings-og hydrolyse opløsninger, anvendelse af natriumiodide chaotrope metoden og undgåelse af phenol i DNA-ekstraktio...

Nogle reaktive oxygenarter (ROS) er i stand til at oxideres Carbon dobbeltbindinger af DNA-baser og nogle kulstofatomer i Deoxyribose-delen, genererer oxiderede baser og DNA-streng pauser1. Som et negativt ladet molekyle, der er rigt på nitrogen og oxygen atomer, er DNA også et mål for elektro File grupper, der kovalent reagerer med de nukleofile steder (nitrogen og ilt), hvilket giver produkter, der kaldes DNA-addukter2. Så, DNA addukter og oxiderede DNA-baser er eksempler på DNA-læsioner, der er nyttige biomarkører for toksicitets vurdering af stoffer, der er elektro File, generere reaktive elektro philes ved biotransformation, eller inducere oxidativ stress1, 2. i. Selv om de modificerede DNA baser kan fjernes fra DNA ved base eller nukleotid excision reparation (BER eller NER), induktion af en ubalance mellem generering og fjernelse af DNA-læsioner til fordel for førstnævnte fører til en nettostigning i deres niveauer i DNA overarbejde3 < /C5 >. Resultater er stigningen i DNA-Mutations rater, reduceret genekspression og formindsket protein aktivitet2,4,5,6,7, virkninger, der er tæt forbundet med udvikling af sygdomme. DNA-mutationer kan påvirke forskellige cellulære funktioner, såsom celle signalering, celle cyklus, genomintegritet, telomere stabilitet, epigenom, kromatin struktur, RNA splejsning, protein homøostase, metabolisme, apoptose og Celledifferentiering8 ,9. Strategier til at bremse celle Mutations rater og kronisk sygdomsudvikling (f. eks. kræft, neurodegenerative sygdomme) passerer gennem viden om Mutations kilderne, heriblandt DNA-læsioner og deres årsager.
ROS genereret endogent i overskud, på grund af forurening eksponering, vedvarende inflammation, sygdom Patofysiologi (f. eks diabetes), etc., er vigtige årsager til biomolekyle skade, herunder DNA og lipid skader1. Som et eksempel er den meget reaktive hydroxyl radikal (OH) dannet af H2O2 reduktion af Transition metalioner (fe2 +, cu+) oxiderer DNA baserne, DNA-sukker delen og flerumættede fedtsyrer ved diffusions kontrolleret priser10. Blandt de 80 allerede karakteriseret oxiderede nukleobaser3, den mest undersøgt ene er 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxogua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo, figur 1), en læsion, der er i stand til at inducere gt Trans versioner i pattedyrsceller10,11. Det dannes ved mono elektronisk oxidation af guanin eller ved hydroxyl radikal eller singlet oxygen angreb af guanin i DNA1. Flerumættede fedtsyrer er andre vigtige mål for meget reaktive oxidanter, såsom •Oh, som indleder processen med lipid peroxidering1,12. Det giver anledning til fedtsyre hydroperoxider, der kan nedbrydes til elektro File aldehyder og epoxyaldehyder, såsom malondialdehyd, 4-hydroxy-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4,5-epoxy-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyd, som er kunne danne mutagene exocycliske DNA-addukter, såsom malondialdehyd-, Propano-eller etheno-addukter1,12,13. Etheno adkanalerne 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosin (1,n2-εdguo, figur 1) og 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosin (1,n6-εdado, figur 1 ) er blevet foreslået som potentielle biomarkører i Patofysiologi af inflammation14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Figur 1. Kemiske strukturer af de DNA-læsioner, der er kvantificeret i nærværende undersøgelse. dR = 2 ́-Deoxyribose. Dette tal er blevet ændret fra Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Undersøgelser foretaget i begyndelsen af 1980 ' erne tillod følsom påvisning af 8-oxodGuo ved højtydende væskekromatografi koblet til elektrokemisk detektion (HPLC-ECD). Kvantificering af 8-oxodguo ved HPLC-ECD i flere biologiske systemer udsat for oxiderende betingelser førte til anerkendelse af 8-oxodguo som en biomarkør af oxidativt induceret base skade i DNA1,16. Selv om den er robust og giver mulighed for kvantificering af 8-oxodGuo i lavfmol-området17, afhænger HPLC-ECD-målingerne af nøjagtigheden af analysand-retentionstiden for analyt-identifikation og af kromatografi opløsningen for at undgå interferenser med andre prøve bestanddele. Da elektrokemisk detektion kræver brug af salt (f. eks. kaliumphosphat, natriumacetat) i den mobile fase, skal vedligeholdelse af passende analytiske betingelser rutine kolonne og rengøringstiden for udstyr.
Alternativt, brugen af bakteriel DNA reparation enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) og bagefter, humant 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), til påvisning og fjernelse af 8-oxoGua fra DNA, opstod som en måde for induktion af DNA alkali labile Websteder. De alkaliske labile steder omdannes til DNA-streng pauser og tillader en meget høj følsom indirekte kvantificering af 8-oxoGua ved alkalisk enkelt celle gel elektroforese ("Comet assay"). Den høje følsomhed og udførelsen af analyserne uden behov for cellulær DNA ekstraktion er de vigtigste fordele ved denne type analyse. Det giver de laveste Steady-State niveauer af 8-oxoGua i DNA, typisk 7-10 gange lavere end niveauerne opnået ved bioanalytiske metoder baseret på HPLC. Men det er en indirekte måling af 8-oxogua og nogle ulemper er manglen på specificitet eller den ukendte effektivitet af reparation enzymer brugt1,16,18.
Immunoassays er andre sæt metoder, der anvendes til påvisning af 8-oxoGua1 og exocyclic DNA addukter, såsom 1,n6-Dado og 1,n2-dguo12. På trods af følsomheden er en mangel ved brugen af antistoffer til påvisning af DNA-læsioner manglen på specificitet på grund af kryds reaktivitet til andre bestanddele af biologiske prøver, herunder de normale DNA baser1,12. De exocycliske DNA-addukter, herunder 1, n6-Dado og 1, n2-dguo, kan også påvises og kvantificeres af meget følsomme 32P-post mærknings-analyser12. Den høje følsomhed af 32P-post mærkning tillader brug af meget små mængder af DNA (f. eks 10 μg) til påvisning af omkring 1 adduct per 1010 normale baser19. Men brugen af radio-kemikalier, manglende kemisk specificitet og lav nøjagtighed er nogle ulemper19,20.
En fælles begrænsning af de ovenfor citerede metoder er den lave selektivitet eller specificitet for påvisning af de ønskede molekyler. I dette scenario er HPLC koblet til elektro spray ionisering tandem massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS og HPLC-MS3) udviklet som guld standard for kvantificering af modificerede Nukleosider i biologiske matricer, såsom DNA, urin, plasma og spyt 1 af , 19 ud af , 20. fordele ved HPLC-ESI-MS/MS metoder er følsomheden (typisk i den lave fmol Range) og den høje specificitet, som i) kromatografi separation, II) det karakteristiske og kendte mønster af molekyle fragmentering inde i massen spektrometer kollisions kammer og III) nøjagtig måling af den valgte masse til opladnings forhold (m/z) i flere reaktions overvågnings modus1,19. Brugen af isotopisk mærkede interne standarder tilføjer fordelen ved korrektioner for Molekylær tab under DNA-hydrolyse-og analyt-berignings trinnene samt for forskelle i analytioniseringen mellem prøverne. Det bidrager også til identifikationen af den korrekte kromatografi, når der er mere end én top til stede1,12,19,20.
Flere metoder baseret på HPLC-ESI-MS/MS er blevet anvendt til kvantificering af 8-oxodguo, 1, n6-Dado og 1,N2-dguo i dna ekstraheret fra forskellige biologiske prøver12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Fine partikler (PM2,5) transporterer organiske og uorganiske kemikalier, såsom polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH), nitro-PAH'er, aldehyder, ketoner, carboxylsyrer, quinoliner, metaller og vandopløselige ioner, som kan inducere betændelse og oxidativ stress, betingelser, der begunstiger forekomsten af biomolekyle skader og sygdom30,31,32,33. Vi præsenterer her validerede HPLC-ESI-MS/MS-metoder, der med succes blev anvendt til kvantificering af 8-oxodGuo, 1,n6-Dado og 1,N2-dguo i LUNGE-, lever-og nyre-DNA fra A/J-mus til vurdering af virkninger af omgivelsernes PM2,5 -eksponering34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA-addukter og oxiderede DNA-baser er eksempler på DNA-læsioner, der er nyttige biomarkører til toksicitets vurdering af stoffer, der er elektro File, genererer reaktive elektrophiler ved biotransformation eller inducerer oxidativ stress. Blandt de oxiderede nukleobaser, den mest undersøgt en er 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxoGua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo), en biomarkør af oxidativt induceret base skade i DNA. Aldehyder og epoxyaldehyder som følge af lipid-peroxiderings processen er elektro File molekyler, der kan danne mutagene exocycliske DNA-addukter, såsom etheno adkanalerne 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosin (1,n2- εdGuo) og 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosin (1,n6-εdado), som er blevet foreslået som potentielle biomarkører i Patofysiologi af inflammation. Selektive og følsomme metoder til kvantificering af DNA er nødvendige for udviklingen af forebyggende strategier til at bremse celle Mutations rater og kronisk sygdomsudvikling (f. eks. kræft, neurodegenerative sygdomme). Blandt de følsomme metoder til rådighed for deres påvisning (højtydende væskekromatografi koblet til elektrokemiske eller tandem massespektrometri detektorer, Comet assay, immunoassays, 32P-post mærkning), de mest selektive er dem baseret på højtydende væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS). Selektivitet er en væsentlig fordel ved analyse af komplekse biologiske prøver og HPLC-ESI-MS/MS udviklet som guld standard for kvantificering af modificerede Nukleosider i biologiske matricer, såsom DNA, urin, plasma og spyt. Brugen af isotopisk mærkede interne standarder tilføjer fordelen ved korrektioner for Molekylær tab under DNA-hydrolyse-og analyt-berignings trinnene samt for forskelle i analytioniseringen mellem prøverne. Det bidrager også til identifikationen af den korrekte kromatografi, når der er mere end et højdepunkt.
Vi præsenterer her validerede følsomme, præcise og præcise HPLC-ESI-MS/MS metoder, der blev anvendt med succes til kvantificering af 8-oxodGuo, 1,N6-Dado og 1,N2-DGUO i lunge, lever og nyre DNA af A/J-mus til vurdering af virkningerne af omgivelsernes PM2,5 -eksponering.

Den gennemsnitlige DNA-koncentration (± SD) opnået fra mus lever (~ 1 g væv), lunge (~ 0,2 g væv) og nyre (~ 0,4 g væv) var henholdsvis 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 og 3.223 ± 723 μg/mL i det endelige volumen af 200 μL. Et repræsentativt kromatogram fremstillet ved HPLC-DAD af det oprensede DNA er vist i figur 3. Tilstedeværelsen af de fire 2 '-deoxynukleosider, fri for RNA ribonucleosider, der elueres umiddelbart før de tilsvarende 2 '-deoxynucl...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Kvantificering af tre DNA-læsioner ved massespektrometri og vurdering af deres niveauer i væv af mus udsat for omgivende fine partikler

Her beskrives metoder til følsom og nøjagtig kvantificering af læsioner 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosin (1,n6-Dado) og 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosin (1,N2-DGUO) i DNA. Metoderne blev anvendt til vurdering af virkningerne af de omgivende fine partikler (PM2,5) i væv (lunge, lever og nyrer) af eksponerede A/J-mus.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

De metoder, der præsenteres her, gør det muligt at kvantificere DNA-læsioner forårsaget af oxidativt stress, hvilket bidrager til forståelsen af patofysiologiske mekanismer, der kan være mål for forebyggelse og behandling af sygdomme. Selektivitet og følsomhed er de vigtigste fordele. Selektivitet er en væsentlig fordel, når der arbejdes med komplekse biologiske prøver.HPLC koblet til tandem massespektrometri udviklet sig som guldstandarden for denne type kvantificering med biologiske matricer. Oxidativ stress er en fælles begivenhed til forskellige patofysiologiske processer. Forhøjede niveauer af etheno adducts er blevet påvist i væv eller urin hos patienter med inflammatoriske sygdomme.DNA-læsionerne giver også oplysninger om endogene hændelser, der udløses af eksponering for forurenende stoffer. Hvis DNA-læsionerne øges, kan eksponeringen være på det niveau, der øger risikoen for kræftudvikling, for eksempel. Læsionerne kan kvantificeres i DNA fra ethvert cellulært system og alternativt i urin, plasma, spytkulturmedium med tilpasninger i prøvepræparatet.Til at begynde, bruge en kultur plade placeret på is som en base for at skære et stykke væv med en skalpel. Et gram af vævet vejes i hvert 50 milliliter-capped-rør til øjeblikkelig brug. Hold det resterende væv på tøris, før opbevaring på minus 80 grader Celsius.Til hvert rør tilsættes 10 milliliter den kommercielle cellelysisopløsning, der indeholder 0,5 millimolardeferoxamin, og opbevares på is. Indstil vævshomogenisatoren til en lav hastighed, omkring 60 til 90 omdrejninger i minuttet. Homogeniser vævet på is i et par minutter, indtil opløsningen er uden vævsfragmenter.Derefter tilsættes 150 mikroliter proteinase K opløsning til hver homogeniseret prøve. Ryst rørene ved inversion, og hold dem ved stuetemperatur natten over. Om morgenen tilsættes 40 mikroliter ribonuclease En opløsning, ryst ved inversion, og hold rørene ved stuetemperatur i to timer.Tilføj fem milliliter kommerciel protein nedbør løsning, vortex kraftigt, og centrifuge ved 2, 000 gange g, fire grader Celsius, i 10 minutter. Supernatanterne overføres til 50 milliliterede rør, der indeholder 10 milliliter kold isopropanol. Inverter rørene forsigtigt flere gange, indtil observation af udfældet DNA.Brug en Pasteur pipette lukket i slutningen til at indsamle den udfældede DNA. Det indsamlede DNA overføres til rør, der indeholder fire milliliter 10 millimolar Tris buffer og en millimolar deferoxamin ved pH-7, for at opløses. Når DNA'et er helt opløst i rørene, tilsættes der fire milliliter en chloroformopløsning, der indeholder 4% isoamylalkohol til hvert rør.Inverter rørene 10 gange for homogenisering, centrifuge ved 2, 000 gange g, fire grader Celsius, i 10 minutter, og overfør de øvre faser til nye rør. Vask af den øverste fase med kloroformopløsningen gentages to gange mere. Derefter tilsættes otte milliliter absolut ethanol og 0,4 milliliter af en fem-molar natriumchlorid opløsning til at udfælde DNA.Igen, indsamle udfældet DNA, og overføre det til tre milliliter 70% ethanol. Gentag vasken med 70% ethanol en gang til. Ethanolopløsningen kasseres med forsigtighed, og rør, der indeholder det udfældede DNA på absorberende papir, skal vendes for at fjerne overskydende opløsning.Efter fremstilling af DNA-hydrolyseprøver med 15N5 isotopstandard på 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 15N5 isotopstandard på 1, N2-etheno-deoxyguanosin i henhold til manuskriptet overføres 10 mikroliter af hver prøve til rør til kvantificering af normale deoxynucleosider ved HPLC-UVLC. Den resterende mængde underkastes fast faseekstraktion. For at udføre HPLC skal du først bruge en C18-kolonne, der er fastgjort til en C18 SecurityGuard-patron med en gradient på 0,1 % myresyre og methanol.Opsæt gradientprogrammet til at køre fra nul til 25 minutter med nul til 18% methanol, fra 25 til 27 minutter med 18 til 0% methanol, derefter fra 27 til 37 minutter med 0% methanol ved en strømningshastighed på en milliliter per minut og 30 grader Celsius. Derefter indsprøjtes et volumen mellem to og seks mikroliter for hver prøve, der er forbeholdt normal deoxynukleostider kvantificering. Indstil DAD detektoren til 260 nanometer til integration af deoxyguanosin og deoxyadenosin toppe.For at udføre fast fase ekstraktion til analyser af 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 1, N2-etheno-deoxyguanosine, første belastning patronerne med en række løsninger ved et volumen på en milliliter. Tilsæt 100% methanol, deioniseret vand, hydrolyseret DNA-prøve, deioniseret vand, 10% methanol, 15% methanol, og endelig 100% methanol til indsamling. Fortsæt derefter i henhold til manuskriptet.Efter fremstilling af DNA hydrolyseprøver 15N5 isotopstandard på 8-oxo-deoxyguanosin overføres 80 mikroliter af hver prøve til hætteglas til analyse i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Reserver de resterende 20 mikroliter til kvantificering af deoxyguanosin på HPLC-UV, som gjort tidligere. Til analyse af 8-oxo-deoxyguanosin på HPLC-ESI-MS/MS, eluterer C18 kolonne A koblet til en C18 SecurityGuard patron med en gradient af opløsningsmiddel A og B med en strømningshastighed på 150 mikroliter i minuttet og 25 grader Celsius.Kør den binære pumpe med nul til 15% opløsningsmiddel B i løbet af de første 25 minutter, 15 til 80% af opløsningsmiddel B fra 25 til 28 minutter, 80% af opløsningsmiddel B fra 28 til 31 minutter, 80 til 0% af opløsningsmiddel B fra 31 til 33 minutter, og 0% af opløsningsmiddel B fra 33 til 46 minutter. Direkte de første 16 minutter af kolonne A eluering til affald. Tilstandssøjle B ved den isokratiske pumpe med en opløsning på 15 % methanol i vand, der indeholder 0,1 % myresyre ved en strømningshastighed på 150 mikroliter pr. minut.Efter seks minutter skal kromatogrammet kontrolleres for at sikre, at standard elutes 8-oxo-deoxyguanosin standard elutes fra kolonne A.I løbet af intervallet på 16 til 32 minutter, skal ventilen skiftes til den position, der muliggør forbindelse mellem kolonne A og kolonne B.Luk ventilen 32 minutter for at elute 8-oxo-deoxyguanosine fra den anden kolonne og få en skarp kromatografisk top. Til analyse af 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 1, N2-etheno-deoxyguanosine, eluter en C18 kolonne koblet til en C18 SecurityGuard patron med en gradient af opløsningsmiddel A og B med en strømningshastighed på 130 mikroliter per minut og 25 grader Celsius. Kør den binære pumpe med 0% af opløsningsmiddel B i de første 10 minutter, nul til 20 % af opløsningsmiddel B i 10 til 39 minutter, 20 til 75 % af opløsningsmiddel B fra 39 til 41 minutter, 75 % opløsningsmiddel B fra 41 til 46 minutter, 75 til 0 % opløsningsmiddel B fra 46 til 47 minutter og 0 % opløsningsmiddel B fra 47 til 60 minutter.Brug koblingsventilen til at dirigere de første 35 minutters elluent til affald og 35 til 42 minutters fraktionen til ESI-kilden. Sørg for, at adduct-standarderne eluterer fra kolonnen i det indstillede interval. Integrer toppene af 8-oxo-deoxyguanosin 15N5 isotopstandarden 8-oxo-deoxyguanosin 1, N6-etheno-deoxyadenosin, 15N5 isotopstandard på 1, N6-etheno-deoxyadenosin, 1, N2-etheno-deoxyguanosine og 15N5 isotopstandard på 1, N2-etheno-deoxyguanosin fra HPLC-ESI-MS/MS-analyserne.Arealforholdet for kalibreringskurverne og prøverne beregnes. Der skal fastlægges kalibreringskurver, og mængden af læsioner i hver indsprøjtet prøve beregnes. Integrer toppene af deoxyguanosin og deoxyadenosin fra HPLC-UV-analyserne.Brug områderne til at fastlægge kalibreringskurverne, og beregne mængden af deoxyguanosin og deoxyadenosin hos dyr i hver indsprøjtet prøve. Kindtandfraktionerne beregnes for 8-oxo-deoxyguanosin over deoxyguanosin, 1, N6-etheno-deoxyadenosin over deoxyadenosin og 1, N2-etheno-deoxyguanosine over deoxyguanosin, som giver antallet af læsioner pr. million normal deoxyguanosin eller deoxyadenosin. Et repræsentativt kromatogram af det rensede DNA, der er fremstillet af HPLC-UV, viser tilstedeværelsen af de fire normale deoxynukleosider, fri for RNA ribonucleosiderne, og som viser DNA-renheden.Repræsentative kromatogrammer fra HPLC-ESI-MS/MS af 8-oxo-deoxyguanosin, 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 1, N2-etheno-deoxyguanosin i mus vævs DNA-prøver vises. Kromatogrammet opnået med UV-påvisning viser de fire normale deoxynukleosides eluting fra den første kolonne indtil ca 10 minutter, med en god adskillelse fra 8-oxo-deoxyguanosine, fjerne uønsket interferens. En vigtig ting at huske for nøjagtige kvantificeringer er altid at have de samme mængder af interne standarder i injektionsvolumen i kalibreringskurver og prøver.De metoder, der præsenteres her, kan tilpasses til kvantificering af andre modificerede deoxynukleosider. Udvidelse af båndet af modificerede deoxynukleosider giver en bedre forståelse af de underliggende patofysiologiske mekanismer. Vi kan undersøge den rolle, oxidative skader i forskellige situationer såsom eksponering for xenobiotika, diabetes, og celle ondartede transformation, derfor medvirken til udviklingen af forebyggende og behandling strategier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Transformation af Probiotic Gær og deres Recovery fra Mave Immune væv efter oral sonde i mus

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøveudtagning af slimhindebelægning væske til kvantificering af In Vivo øvre luftveje immun-mægler niveauer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Ved hjælp af Fylogenetisk analyse at undersøge eukaryote gen oprindelse

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Berigelse af bakteriel lipoproteiner og forberedelse af N-terminale Lipopeptides for Strukturbestemmelse af massespektrometri

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...