Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do de São Paulo, proc. 2012/22190-3 en 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 en 429184/2016-6), Kaap, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPEs/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPEs; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) en CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira en A. A. F. Oliveira kregen beurzen van FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) en CAPEs (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva, en A. P. M. Loureiro ontvangen beurzen van CNPq.
Sommige figuren en tabellen in dit werk werden oorspronkelijk gepubliceerd in Oliveira A.A.F. et al. epigenotoxic effecten in muizen blootgesteld aan geconcentreerde fijn stofdeeltjes (PM2,5) uit São Paulo stad, Brazilië. Deeltjes-en vezel toxicologie. 15, 40 (2018).

Vier weken oude mannelijke A/J muizen, specifieke pathogeen vrij, werden verkregen uit het broed centrum van proefdieren van Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazilië, en werden dienovereenkomstig behandeld aan de ethische commissie van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van São Paulo (protocol no 1310/09).
1. verzameling van muizen weefsels
<ol><li>Verdoven het dier met xylazine en ketamine. Voor een muis met 30 g lichaamsgewicht, een oplossing injecte...

Een groot probleem dat in de 8-oxodGuo analyses door HPLC methodes wordt gevonden is de mogelijke inductie van zijn vorming tijdens de Workup procedures van de extractie van DNA, de hydrolyse van DNA, en concentratie van DNA eiwithydrolysaten22,38. Om het probleem van 8-oxodGuo artefactuele vorming te minimaliseren, wordt het aanbevolen de toevoeging van deferoxamine aan alle DNA-extractie, opslag en hydrolyse oplossingen, het gebruik van de Natriumjodide chaotro...

Sommige reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen koolstof dubbele banden van de basissen van DNA en sommige koolstof in deoxyribose moiety oxideren, die geoxideerde basissen en de bundel onderbrekingen van DNA produceert1. Als een negatief geladen molecuul rijk aan stikstof-en zuurstofatomen, DNA is ook een doelwit voor elektrofiele groepen die covalente reageren met de nucleofiele sites (stikstof en zuurstof), het geven van producten die worden genoemd DNA adducten2. Dus, DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress1, 2. Hoewel de gewijzigde DNA-bases kunnen worden verwijderd uit DNA door base of nucleotide accijns reparatie (BER of NER), de inductie van een onbalans tussen de generatie en verwijdering van DNA-laesies in het voordeel van de voormalige leidt tot een netto stijging van hun niveau in DNA overwerk3 < /C5 >. Resultaten zijn de toename van de DNA-mutatie, verminderde genexpressie, en verminderde eiwit activiteit2,4,5,6,7, effecten die nauw verwant zijn aan de ontwikkeling van ziekten. De veranderingen van DNA kunnen diverse cellulaire functies, zoals cel signalering, cel cyclus, de integriteit van het genoom, Telomere stabiliteit, de epigenome, chromatin structuur, het verbinden van RNA, eiwit homeostase, metabolisme, apoptosis, en de differentiatie van de cel beïnvloeden8 ,9. Strategieën om de mutatie tarieven van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten) te vertragen passeren de kennis van de mutatie bronnen, onder hen, DNA laesies en hun oorzaken.
ROS gegenereerd endogene in overmaat, als gevolg van blootstelling aan verontreinigende stoffen, aanhoudende ontsteking, ziekte Pathofysiologie (bijv. diabetes), enz., zijn belangrijke oorzaken van Biomolecuul schade, met inbegrip van DNA en lipide schade1. Als voorbeeld, de zeer reactieve hydroxyl radicale (OH) gevormd uit H2O2 reductie door overgang metaalionen (FE2 +, Cu+) oxideert de DNA-bases, DNA-suiker moiety en meervoudig onverzadigde vetzuren bij diffusie-gecontroleerde tarieven10. Onder de 80 reeds gekenmerkt geoxideerd nucleobasen3, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-OxodGuo, Figuur 1), een laesie die in staat is om te induceren gt-transversies in zoogdiercellen10,11. Het wordt gevormd door de mono elektronische oxidatie van guanine, of door hydroxyl radicale of singlet zuurstof aanval van Guanine in DNA1. Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn andere belangrijke doelstellingen van zeer reactieve oxidanten, zoals •Oh, die het proces van lipide peroxidatie1,12te initiëren. Het geeft aanleiding tot vetzuur waterstof peroxiden die kunnen ontbinden aan elektrofiele aldehyden en epoxyaldehydes, zoals malondialdehyde, 4-hydroxy-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epoxy-(2E)-Decena, hexenal, acroleïne, Crotonaldehyde, die bekwaam om mutagene exocyclic te vormen DNA adducten, zoals malondialdehyde-, Propano-, of etheno adducten1,12,13. De etheno adducten 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2-εdGuo, Figuur 1) en 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo, Figuur 1 ) zijn voorgesteld als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Figuur 1. Chemische structuren van de DNA-laesies gekwantificeerd in de huidige studie. dR = 2 ´-deoxyribose. Dit cijfer is gewijzigd van Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De studies die in de vroege jaren ' 80 worden uitgevoerd lieten de gevoelige opsporing van 8-oxodGuo door hoge prestaties vloeibare chromatografie toe die aan elektrochemische opsporing wordt gekoppeld (HPLC-ECD). De kwantificering van 8-oxodGuo door HPLC-ECD in verscheidene biologische systemen die aan oxiderende voorwaarden worden onderworpen leidde tot de erkenning van 8-oxodGuo als biomarker van oxidatively veroorzaakte basis schade in DNA1,16. Hoewel robuust en waardoor de kwantificering van 8-oxodGuo in de lage fmol bereik17, HPLC-ECD metingen vertrouwen op de nauwkeurigheid van de analyt retentietijd voor de identificatie van de analyt en op de chromatografie resolutie om interferenties te voorkomen van andere monster bestanddelen. Aangezien de elektrochemische opsporing het gebruik van zout (b.v., kaliumfosfaat, natriumacetaat) in de mobiele fase vereist, vergt het behoud van adequate analytische voorwaarden routine kolom en materiaal het schoonmaken tijd.
Als alternatief, het gebruik van de bacteriële DNA-reparatie enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) en, daarna, menselijke 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), voor de opsporing en verwijdering van 8-oxoGua van DNA, ontstond als een manier voor de inductie van DNA-alkali labiele Sites. De alkali labiele plaatsen worden omgezet in de bundel onderbrekingen van DNA en laten de zeer hoge gevoelige indirecte kwantificering van 8-oxoGua door alkalische enige Elektroforese van het gel (de "komeet assay") toe. De hoge gevoeligheid en de verwezenlijking van de analyses zonder de behoefte aan cellulaire DNA-extractie zijn de belangrijkste voordelen van dit type van analyse. Het geeft de laagste steady-state niveaus van 8-oxoGua in DNA, meestal 7-10 keer lager dan de niveaus verkregen door bioanalytische methoden op basis van HPLC. Het is echter een indirecte meting van 8-oxoGua en sommige nadelen zijn het gebrek aan specificiteit of de onbekende efficiëntie van de reparatie-enzymen gebruikt1,16,18.
Immunoassays zijn andere set van methoden die worden gebruikt voor de detectie van 8-oxoGua1 en exocyclic DNA adducten, zoals 1,n6-dAdo en 1,n2-dGuo12. Ondanks de gevoeligheid, is een tekortkoming van het gebruik van antilichamen voor opsporing van de letsels van DNA het gebrek aan specificiteit toe te schrijven aan cross-reactiviteit aan andere componenten van biologische steekproeven, met inbegrip van de normale DNA-basissen1,12. De exocyclic DNA adducten, met inbegrip van 1,n6-Dado en 1,n2-dGuo, kan ook worden gedetecteerd en gekwantificeerd door zeer gevoelige 32P-postlabeling assays12. De hoge gevoeligheid van 32P-postlabeling staat het gebruik van zeer kleine hoeveelheden DNA toe (b.v., 10 µ g) voor opsporing van ongeveer 1 adduct per 1010 normale basissen19. Echter, het gebruik van radio-chemicaliën, gebrek aan chemische specificiteit en lage nauwkeurigheid zijn enkele nadelen19,20.
Een gemeenschappelijke beperking van de hierboven aangehaalde methoden is de geringe selectiviteit of specificiteit voor de detectie van de gewenste moleculen. In dit scenario, HPLC gekoppeld aan electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS en HPLC-MS3) geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel 1 , 19 , 20. voordelen van HPLC-ESI-MS/MS methoden zijn de gevoeligheid (meestal in de lage fmol bereik) en de hoge specificiteit die door i) de chromatografie scheiding, II) de karakteristieke en bekende patroon van molecule fragmentatie in de massa de botsings kamer van de spectrometer, en III) de nauwkeurige meting van de geselecteerde massa aan lasten verhouding (m/z) in veelvoudige reactie controle wijze1,19. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer meer dan een piek aanwezig is1,12,19,20.
Verschillende methoden op basis van HPLC-ESI-MS/MS zijn gebruikt voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-dAdo en 1,n2-dGuo in DNA geëxtraheerd uit verschillende biologische monsters12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . De fijne deeltjes (PM2,5) dragen organische en anorganische chemische producten, zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (pak's), Nitro-pak's, aldehyden, ketonen, carbonzuren, quinolines, metalen, en in water oplosbare ionen, die ontsteking kunnen veroorzaken en oxidatieve stress, voorwaarden die het voorkomen van biomolecule schade en ziekte30,31,32,33gunst. We presenteren hier gevalideerd HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-Dado en 1,n2-dGuo in Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM2,5 exposure34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress. Onder de geoxideerde nucleobasen, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), een biomarker van oxidatively geïnduceerde basis schade in DNA. Aldehyden en epoxyaldehydes als gevolg van het lipiden peroxidatie proces zijn elektrofiele moleculen die in staat zijn mutagene exocyclic DNA adducten te vormen, zoals de etheno adducten 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) en 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo), die als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking zijn voorgesteld. Selectieve en gevoelige methoden voor de kwantificering ervan in DNA zijn noodzakelijk voor de ontwikkeling van preventieve strategieën om de mutaties van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten te vertragen (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten). Onder de gevoelige methoden die beschikbaar zijn voor hun detectie (hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan elektrochemische of tandem massaspectrometrie detectoren, Comet Assay, immunoassays, 32P-postlabeling), de meest selectieve zijn die op basis op hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Selectiviteit is een essentieel voordeel bij het analyseren van complexe biologische monsters en HPLC-ESI-MS/MS geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer er meer dan een piek aanwezig is.
We presenteren hier gevalideerd gevoelige, accurate en nauwkeurige HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-Dado en 1,N2-dGuo in de Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM2,5 blootstelling.

De gemiddelde concentraties van DNA (± BR) die van muizen lever (~ 1 g weefsel) worden verkregen, Long (~ 0,2 g weefsel) en nier (~ 0,4 g weefsel) waren, respectievelijk, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, en 3.223 ± 723 µ g/mL in het uiteindelijke volume van 200 µ L. Een vertegenwoordiger chromatogram verkregen door HPLC-papa van het gezuiverde DNA wordt getoond in Figuur 3. De aanwezigheid van de vier 2 '-deoxynucleosides, vrij van de RNA ribonucleosides, ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

De hier gepresenteerde methoden maken het mogelijk om DNA-laesies te kwantificeren die worden veroorzaakt door oxidatieve stress, wat bijdraagt aan het begrip van pathofysiologische mechanismen die gericht kunnen zijn op preventie en behandeling van ziekten. Selectiviteit en gevoeligheid zijn de belangrijkste voordelen. Selectiviteit is een essentieel voordeel bij het werken met complexe biologische monsters.HPLC in combinatie met tandemmassaspectrometrie evolueerde als de gouden standaard voor dit type kwantificering met biologische matrices. Oxidatieve stress is een veel voorkomende gebeurtenis voor verschillende pathofysiologische processen. Verhoogde niveaus van etheno adducten zijn gedetecteerd in weefsels of urine van patiënten met ontstekingsziekten.De DNA-laesies geven ook informatie over endogene gebeurtenissen veroorzaakt door blootstelling aan verontreinigende stoffen. Als de DNA-laesies worden verhoogd, kan de blootstelling op het niveau zijn dat bijvoorbeeld het risico op kankerontwikkeling verhoogt. De laesies kunnen worden gekwantificeerd in DNA van elk cellulair systeem en als alternatief in urine, plasma, speeksel cultuurmedium met aanpassingen in monstervoorbereiding.Om te beginnen, gebruik maken van een cultuur plaat geplaatst op ijs als basis om een stuk weefsel te snijden met een scalpel. Weeg een gram van het weefsel in elke 50-milliliter afgetopte buis voor onmiddellijk gebruik. Houd het resterende weefsel op droog ijs voordat u het opslaat bij min 80 graden Celsius.Voeg aan elke buis 10 milliliter van de commerciële cellyseoplossing toe die 0,5 millimolar deferoxamine bevat en houd in het ijs. Stel de weefselhomogenisator in op een lage snelheid, rond de 60 tot 90 tpm. Homogeniseer de weefsels op ijs gedurende een paar minuten totdat de oplossing is zonder weefselfragmenten.Voeg vervolgens 150 microliter proteinase K-oplossing toe aan elk gehomogeniseerd monster. Schud de buizen door inversie, en houd ze op kamertemperatuur 's nachts. Voeg 's ochtends 40 microliters ribonuclease Een oplossing toe, schud door inversie en houd de buizen twee uur op kamertemperatuur.Voeg vijf milliliter commerciële eiwitnecipitatieoplossing, vortex krachtig, en centrifuge op 2.000 keer g, vier graden Celsius, gedurende 10 minuten. Breng de supernatants over op 50 milliliter afgetopte buizen met 10 milliliter koude isopropanol. Draai de buizen voorzichtig meerdere malen tot observatie van neergeslagen DNA.Gebruik een Pasteur pipet gesloten aan het einde om de neergeslagen DNA te verzamelen. Breng het verzamelde DNA over aan buizen met vier milliliter trisbuffer van 10 millimolar en één millimolar deferoxamine bij pH zeven om op te lossen. Nadat het DNA volledig is opgelost in de buizen, voeg vier milliliter van een chloroforme oplossing met 4% isoamylalcohol aan elke buis.Keer de buizen 10 keer om voor homogenisatie, centrifuge op 2.000 keer g, vier graden Celsius, gedurende 10 minuten, en breng de bovenste fasen over op nieuwe buizen. Herhaal de wasbeurt van de bovenste fase met de chloroformoplossing nog twee keer. Voeg vervolgens acht milliliter absolute ethanol en 0,4 milliliter natriumchlorideoplossing van vijf kies toe om het DNA neer te hevelen.Nogmaals, verzamel de neergeslagen DNA, en breng het over naar drie milliliter van 70%ethanol. Herhaal de was met 70% ethanol nog een keer. Gooi de ethanoloplossing voorzichtig weg en omker de buizen met het neergeslagen DNA op absorberend papier om overtollige oplossing te verwijderen.Na het voorbereiden van DNA hydrolysemonsters met 15N5 isotopische standaard van 1, N6-etheno-deoxyadenosine en 15N5 isotoopnorm van 1, N2-etheno-deoxyguanosine volgens het manuscript, breng 10 microliter van elk monster over in buizen voor kwantificering van normale deoxynucleoseos door HPLC-UV. Onder voorbehoud van het resterende volume aan vaste fase extractie. Om HPLC uit te voeren, eerste elute een C18 kolom bevestigd aan een C18 SecurityGuard cartridge met een verloop van 0,1%mierenzuur en methanol.Stel het verloopprogramma in om van nul tot 25 minuten met nul tot 18%methanol te lopen, van 25 tot 27 minuten met 18 tot 0%methanol, dan van 27 tot 37 minuten met 0%methanol bij een stroomsnelheid van één milliliter per minuut en 30 graden Celsius. Injecteer daarna een volume tussen twee en zes microliter voor elk monster dat is gereserveerd voor normale kwantificering van deoxynucleosiden. Stel de DAD-detector in op 260 nanometer voor integratie van de deoxyguanosine- en deoxyadenosinepieken.Om vaste fase extractie uit te voeren voor analyses van 1, N6-etheno-deoxyadenosine en 1, N2-etheno-deoxyguanosine, laadt u eerst de cartridges met een reeks oplossingen met een volume van één milliliter. Voeg 100% methanol, gedeïzuuriseerd water, gehydrolyseerd DNA-monster, gedeïzuuriseerd water, 10% methanol, 15% methanol, en ten slotte 100% methanol voor de collectie. Ga dan verder volgens het manuscript.Na het voorbereiden van DNA hydrolysemonsters 15N5 isotopische standaard van 8-oxo-deoxyguanosine, breng 80 microliter van elk monster in flacons voor analyse in het HPLC-ESI-MS/MS-systeem. Reserveer de resterende 20 microliter voor kwantificering van deoxyguanosine op HPLC-UV, zoals eerder gedaan. Voor analyse van 8-oxo-deoxyguanosine op HPLC-ESI-MS/MS, elute de C18 kolom A gekoppeld aan een C18 SecurityGuard cartridge met een gradiënt van oplosmiddel A en B met een stroomsnelheid van 150 microliter per minuut en 25 graden Celsius.Voer de binaire pomp met nul tot 15% van oplosmiddel B gedurende de eerste 25 minuten, 15 tot 80% van oplosmiddel B van 25 tot 28 minuten, 80% van oplosmiddel B van 28 tot 31 minuten, 80 tot 0% van oplosmiddel B van 31 tot 33 minuten, en 0% van oplosmiddel B van 33 tot 46 minuten. Direct de eerste 16 minuten van kolom A eluent te verspillen. Toestand kolom B door de isocratische pomp met een oplossing van 15% methanol in water dat 0,1% mierenzuur bevat met een stroomsnelheid van 150 microliters per minuut.Controleer na zes minuten het chromatogram om de 8-oxo-deoxyguanosine standaard elutes van kolom A te garanderen.Schakel tijdens het interval van 16 tot 32 minuten de klep op de positie zodat de verbinding tussen kolom A en kolom B.Sluit de klep op 32 minuten om 8-oxo-deoxyguanosine uit de tweede kolom te eluteen en een scherpe chromatografische piek te krijgen. Voor analyse van 1, N6-etheno-deoxyadenosine en 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute een C18 kolom gekoppeld aan een C18 SecurityGuard cartridge met een gradiënt van oplosmiddel A en B met een stroomsnelheid van 130 microliter per minuut en 25 graden Celsius. Voer de binaire pomp met 0% van oplosmiddel B gedurende de eerste 10 minuten, nul tot 20% van oplosmiddel B gedurende 10 tot 39 minuten, 20 tot 75% van oplosmiddel B van 39 tot 41 minuten, 75% van oplosmiddel B van 41 tot 46 minuten, 75 tot 0% van oplosmiddel B van 46 tot 47 minuten en 0% van oplosmiddel B van 47 tot 60 minuten.Gebruik de schakelklep om de eerste 35 minuten van eluent te verspillen en de 35 tot 42 minuten fractie naar de ESI bron. Zorg ervoor dat de adduct-normen uit de kolom in het ingestelde interval komen. Integreer de pieken van 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 isotopennorm van 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 15N5 isotopische norm van 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine en 15N5 isotopennorm van 1, N2-etheno-deoxyguanosine uit de HPLC-ESI-MS/MS-analyses.Bereken de gebiedsverhoudingen voor de kalibratiecurven en de monsters. Stel de kalibratiecurven vast en bereken de hoeveelheden laesies in elk geïnjecteerd monster. Integreer de pieken van deoxyguanosine en deoxyadenosine uit de HPLC-UV-analyses.Gebruik de gebieden om de kalibratiecurven vast te stellen en bereken de hoeveelheden deoxyguanosine en deoxyadenosine bij dieren in elk geïnjecteerd monster. Bereken de molaire fracties voor 8-oxo-deoxyguanosine over deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine over deoxyadenosine, en 1, N2-etheno-deoxyguanosine over deoxyguanosine, die het aantal laesies per een miljoen normale deoxynoguasine of deoxyadenosine geven. Een representatief chromatogram van het gezuiverde DNA verkregen door HPLC-UV toont de aanwezigheid van de vier normale deoxynucleosiden, vrij van de RNA ribonucleose, die de DNA-zuiverheid aantonen.Representatieve chromatogrammen van HPLC-ESI-MS/MS van 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine en 1, N2-etheno-deoxyguanosine in dna-monsters van muizenweefsel. Het chromatogram verkregen met UV-detectie toont de vier normale deoxynucleosides die van de eerste kolom tot ongeveer 10 minuten eluteren, met een goede scheiding van 8-oxo-deoxyguanosine, waardoor ongewenste interferenties worden geëlimineerd. Een belangrijk ding om te onthouden voor exacte kwantificeringen is om altijd dezelfde hoeveelheden interne normen in het injectievolume in de kalibratiecurven en monsters.De hier gepresenteerde methoden kunnen worden aangepast voor de kwantificering van andere gemodificeerde deoxynucleosiden. Het uitbreiden van de band van gemodificeerde deoxynucleosides maakt een beter begrip van de onderliggende pathofysiologische mechanismen mogelijk. We kunnen de rol van oxidatieve schade onderzoeken in verschillende situaties, zoals blootstelling aan xenobiotica, diabetes en cel kwaadwillende transformatie, waardoor de ontwikkeling van preventieve en behandelingsstrategieën wordt ondersteund.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Met behulp van fylogenetische analyse te onderzoeken van eukaryotische Gene oorsprong

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...