Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 et 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 et 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) et CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira et A. A. F. Oliveira ont reçu des bourses de FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) et CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di mascio, P. H. N. Saldiva, et A. P. M. Loureiro ont reçu des bourses de CNPq.
Quelques figures et tableaux présents dans ce travail ont été publiés à l’origine dans Oliveira A.A.F. et coll. effets génotoxiques et épigenotoxiques chez des souris exposées à des particules fines ambiantes concentrées (PM2,5) de la ville de São Paulo, au Brésil. Toxicologie des particules et des fibres. 15, 40 (2018).

Des souris A/J mâles de quatre semaines, exemptes de pathogènes spécifiques, ont été obtenues du centre d’élevage des animaux de laboratoire de Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brésil, et ont été traitées en conséquence au Comité d’éthique de la faculté de médecine, Université de São Paulo (protocole no 1310/09).
1. ramassage des tissus de souris
<ol><li>Anesthésier l’animal avec la xylazine et la kétamine. Pour une souris de 30 g de poid...

Un problème majeur trouvé dans les analyses de 8-oxodguo par HPLC méthodes est l’induction possible de sa formation au cours des procédures de travail de l’extraction de l’ADN, l’hydrolyse de l’ADN, et la concentration des hydrolysats d’ADN22,38. Afin de minimiser le problème de la formation artifactuelle 8-oxodGuo, il est recommandé l’addition de la déféroxamine à toutes les solutions d’extraction, de stockage et d’hydrolyse de l’ADN...

Certaines espèces d’oxygène réactif (ROS) sont capables d’oxyder des liaisons doubles de carbone de bases d’ADN et de certains carbones dans la portion désoxyribose, générant des bases oxydées et des ruptures de brin d’ADN1. En tant que molécule chargée négativement riche en atomes d’azote et d’oxygène, l’ADN est aussi une cible pour les groupes électrophiles qui réagissent de façon covalente avec les sites nucléophiles (azote et oxygène), donnant des produits qui sont appelés adduits d’ADN2. Ainsi, les adduits d’ADN et les bases d’ADN oxydées sont des exemples de lésions de l’ADN qui sont des biomarqueurs utiles pour l’évaluation de la toxicité des substances qui sont électrophiliques, génèrent des électrophiles réactifs lors de la biotransformation, ou induisent un stress oxydatif1, 2. les deux. Bien que les bases modifiées de l’ADN puissent être retirées de l’ADN par réparation d’excision de base ou de nucléotide (BER ou NER), l’induction d’un déséquilibre entre la génération et l’élimination des lésions de l’ADN en faveur de l’ancien conduit à une augmentation nette de leurs niveaux dans les heures supplémentaires de l’ADN3 < /C5 >. Les résultats sont l’augmentation des taux de mutation de l’ADN, l’expression génique réduite et l’activité protéique diminuée2,4,5,6,7, effets qui sont étroitement liés à la développement des maladies. Les mutations de l’ADN peuvent affecter diverses fonctions cellulaires, telles que la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire, l’intégrité du génome, la stabilité du télomère, l’épigénome, la structure de la chromatine, l’épissage d’ARN, l’homéostasie protéique, le métabolisme, l’apoptose et la différenciation cellulaire8 ,9. Les stratégies visant à ralentir les taux de mutation cellulaire et le développement des maladies chroniques (p. ex. cancer, maladies neurodégénératives) traversent la connaissance des sources de mutation, parmi lesquelles les lésions de l’ADN et leurs causes.
Les ROS générés de façon endogène en excès, en raison de l’exposition aux polluants, de l’inflammation persistante, de la pathophysiologie des maladies (p. ex. le diabète), etc., sont des causes importantes de dommages causés par la biomolécule, y compris l’ADN et les lésions lipidiques1. À titre d’exemple, le radical hydroxyle hautement réactif (OH) formé à partir de H2O2 réduction par des ions métalliques de transition (Fe2 +, Cu+) oxyde les bases de l’ADN, la portion de sucre d’ADN et les acides gras polyinsaturés à la diffusion contrôlée taux de change10. Parmi les 80 déjà caractérisés nucléobases oxydées3, la plus étudiée est la 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo, figure 1), une lésion qui est capable d’induire gt transversions dans cellules de mammifères10,11. Il est formé par l’oxydation mono-électronique de la guanine, ou par le radical hydroxyle ou l’attaque de l’oxygène sinéne de la guanine dans l’ADN1. Les acides gras polyinsaturés sont d’autres cibles importantes d’oxydants hautement réactifs, tels que •Oh, qui initie le processus de peroxydation lipidique1,12. Il donne lieu à des hydroperoxydes d’acides gras qui peuvent se décomposer en aldéhydes électrophiliques et en époxyaldéhydes, comme le malondialdéhyde, le 4-hydroxy-2-nonenal, le 2,4-décadienal, le 4,5-époxy-(2E)-décénal, l’Hexénal, l’acroléine, le crotonaldéhyde, qui sont capables de former des adduits d’ADN exocyclique mutagènes, tels que les adduits de malondialdéhyde-, Propano-ou étheno1,12,13. Les adduits d’étheno 1,n2-étheno-2'-désoxyguanosine (1,n2-εdguo, figure 1) et 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-εdado, figure 1 ) ont été suggérés comme biomarqueurs potentiels dans la pathophysiologie de l’inflammation14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> La figure 1. Les structures chimiques des lésions de l’ADN quantifiées dans la présente étude. dR = 2 ́-désoxyribose. Ce chiffre a été modifié à partir de Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Des études réalisées au début des années 1980 ont permis la détection sensible du 8-oxodGuo par chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection électrochimique (HPLC-ECD). La quantification du 8-oxodguo par HPLC-ECD dans plusieurs systèmes biologiques soumis à des conditions oxydantes a conduit à la reconnaissance du 8-oxodguo comme biomarqueur des lésions de base induites oxydativement dans l’ADN1,16. Bien que robustes et permettant la quantification du 8-oxodGuo dans la gamme faible de fmol17, les mesures HPLC-ECD reposent sur la précision du temps de rétention de l’analyte pour l’identification de l’analyte et sur la résolution de la chromatographie afin d’éviter les interférences de autres constituants de l’échantillon. Comme la détection électrochimique nécessite l’utilisation de sel (p. ex., phosphate de potassium, acétate de sodium) dans la phase mobile, le maintien de conditions analytiques adéquates nécessite un temps de nettoyage de la colonne et du matériel de routine.
Alternativement, l’utilisation de l’enzyme de réparation de l’ADN bactérien formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) et, par la suite, de l’humain 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), pour la détection et l’enlèvement de 8-oxoGua de l’ADN, est apparu comme un moyen pour l’induction de l’ADN labiles Sites. Les sites labiles alcalins sont convertis en ruptures de brin d’ADN et permettent la quantification indirecte très élevée sensible de la 8-oxoGua par électrophorèse alcaline de gel de cellule simple («dosage de comète»). La haute sensibilité et l’accomplissement des analyses sans besoin d’extraction d’ADN cellulaire sont les principaux avantages de ce type de dosage. Il donne les plus faibles niveaux stables de 8-oxoGua dans l’ADN, typiquement 7-10 fois plus bas que les niveaux obtenus par des méthodes bioanalytiques basées sur HPLC. Cependant, il s’agit d’une mesure indirecte de la 8-oxogua et certains inconvénients sont le manque de spécificité ou l’efficacité inconnue des enzymes de réparation utilisés1,16,18.
Les immunodosages sont d’autres méthodes utilisées pour la détection des adduits de l’ADN 8-oxoGua1 et exocyclique, tels que 1,n6-Dado et 1,n2-dguo12. Malgré la sensibilité, une lacune de l’utilisation des anticorps pour la détection des lésions de l’ADN est le manque de spécificité en raison de la réactivité croisée à d’autres composants d’échantillons biologiques, y compris les bases normales d’ADN1,12. Les adduits d’ADN exocycliques, y compris 1,n6-Dado et 1,n2-dguo, peuvent également être détectés et quantifiés par des essais de P-post-étiquetage 32hautement sensibles12. La sensibilité élevée de 32P-le post-étiquetage permet l’utilisation de très petites quantités d’ADN (par exemple, 10 μg) pour la détection d’environ 1 adduit par 1010 bases normales19. Cependant, l’utilisation de la radio-chimie, le manque de spécificité chimique et la faible précision sont quelques inconvénients19,20.
Une limitation partagée des méthodes citées ci-dessus est la faible sélectivité ou spécificité pour la détection des molécules souhaitées. Dans ce scénario, la HPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem par ionisation par ÉLECTROPULVÉRISATION (HPLC-ESI-MS/MS et HPLC-MS3) a évolué comme étalon-or pour la quantification des nucléosides modifiés dans les matrices biologiques, comme l’ADN, l’urine, le plasma et la salive le premier , le 19 , 20. les avantages des méthodes HPLC-ESI-MS/MS sont la sensibilité (typiquement dans la plage de fmol faible) et la haute spécificité fournie par i) la séparation chromatographique, II) le schéma caractéristique et connu de la fragmentation des molécules à l’intérieur de la masse chambre de collision du spectromètre, et III) la mesure exacte du rapport masse/charge sélectionné (m/z) en mode de surveillance de réaction multiple1,19. L’utilisation de normes internes étiquetées isotopiquement ajoute l’avantage de corrections pour les pertes de molécules au cours de l’hydrolyse de l’ADN et des étapes d’enrichissement de l’analyte, ainsi que pour les différences de l’ionisation de l’analyte entre les échantillons. Il aide également à identifier le pic chromatographique correct lorsque plus d’un pic est présent1,12,19,20.
Plusieurs méthodes basées sur HPLC-ESI-MS/MS ont été utilisées pour la quantification de 8-oxodguo, 1, n6-Dado et 1,n2-dguo dans l’ADN extrait de différents échantillons biologiques12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Particules fines (PM2,5) portent des produits chimiques organiques et inorganiques, tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les nitro-HAP, les aldéhydes, les cétones, les acides carboxyliques, les quinolines, les métaux et les ions solubles dans l’eau, qui peuvent induire une inflammation et stress oxydatif, conditions qui favorisent l’apparition de dommages de biomolécule et de la maladie30,31,32,33. Nous présentons ici les méthodes validées HPLC-ESI-MS/MS qui ont été appliquées avec succès pour la quantification de 8-oxodGuo, 1,n6-Dado et 1,n2-dguo dans l’ADN pulmonaire, hépatique et rénale de souris A/J pour l’évaluation de la effets de l’exposition ambiante2,5 de PM34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

Les adduits d’ADN et les bases d’ADN oxydées sont des exemples de lésions de l’ADN qui sont des biomarqueurs utiles pour l’évaluation de la toxicité des substances qui sont électrophiliques, génèrent des électrophiles réactifs lors de la biotransformation, ou induisent un stress oxydatif. Parmi les nucléobases oxydées, la plus étudiée est la 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou la 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarqueur des lésions de base induites oxydativement dans l’ADN. Les aldéhydes et les époxyaldéhydes résultant du processus de peroxydation lipidique sont des molécules électrophiles capables de former des adduits d’ADN exocyclique mutagènes, tels que les adduits d’étheno 1,n2-étheno-2'-désoxyguanosine (1,n2- εdGuo) et 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-εdado), qui ont été suggérés comme biomarqueurs potentiels dans la pathophysiologie de l’inflammation. Des méthodes sélectives et sensibles pour leur quantification dans l’ADN sont nécessaires à l’élaboration de stratégies préventives pour ralentir les taux de mutation cellulaire et le développement des maladies chroniques (p. ex. cancer, maladies neurodégénératives). Parmi les méthodes sensibles disponibles pour leur détection (chromatographie liquide à haute performance couplée à des détecteurs de spectrométrie de masse électrochimique ou tandem, essai de comète, immunodosages, 32P-post-étiquetage), les plus sélectifs sont ceux basés sur chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-ESI-MS/MS). La sélectivité est un avantage essentiel lors de l’analyse d’échantillons biologiques complexes et de HPLC-ESI-MS/MS évolué comme étalon-or pour la quantification des nucléosides modifiés dans les matrices biologiques, comme l’ADN, l’urine, le plasma et la salive. L’utilisation de normes internes étiquetées isotopiquement ajoute l’avantage de corrections pour les pertes de molécules au cours de l’hydrolyse de l’ADN et des étapes d’enrichissement de l’analyte, ainsi que pour les différences de l’ionisation de l’analyte entre les échantillons. Il aide également à identifier le pic chromatographique correct lorsque plus d’un pic est présent.
Nous présentons ici des méthodes de HPLC-ESI-MS/MS validées, précises et précises, qui ont été appliquées avec succès pour la quantification du 8-oxodGuo, 1,n6-Dado et 1,n2-dguo dans le poumon, le foie et l’ADN des reins des souris A/J pour l’évaluation des effets de l’exposition aux PM2,5 ambiantes.

Les concentrations moyennes d’ADN (± SD) obtenues à partir du foie de souris (~ 1 g de tissu), du poumon (~ 0,2 g de tissu) et du rein (~ 0,4 g de tissu) ont été respectivement 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 et 3 223 ± 723 μg/mL dans le volume final de 200 μL. Un chromatogramme représentatif obtenu par HPLC-DAD de l’ADN purifié est illustré à la figure 3. La présence des quatre 2 '-désoxynucléosides, exempts des ribonucléosides d’ARN, qui...

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Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Quantification de trois lésions de l’ADN par spectrométrie de masse et évaluation de leurs niveaux dans les tissus de souris exposés à des particules fines ambiantes

Nous décrivons ici les méthodes de quantification sensible et précise des lésions 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-Dado) et 1,n2- étheno-2 '-désoxyguanosine (1,N-2dguo) dans l’ADN. Les méthodes ont été appliquées à l’évaluation des effets des particules fines ambiantes (PM2,5) dans les tissus (poumons, foie et rein) des souris A/J exposées.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Les méthodes présentées ici permettent la quantification des lésions d’ADN induites par le stress oxydatif, contribuant à la compréhension des mécanismes pathophysiologiques qui peuvent être la cible pour la prévention et le traitement des maladies. La sélectivité et la sensibilité sont les principaux avantages. La sélectivité est un avantage essentiel lorsque vous travaillez avec des échantillons biologiques complexes.Hplc couplé à la spectrométrie de masse tandem a évolué comme l’étalon-or pour ce type de quantification avec des matrices biologiques. Le stress oxydatif est un événement commun à différents processus pathophysiologiques. Des niveaux accrus d’adducteurs d’etheno ont été détectés dans les tissus ou l’urine des patients présentant des maladies inflammatoires.Les lésions d’ADN fournissent également l’information sur des événements endogènes déclenchés par l’exposition aux polluants. Si les lésions d’ADN sont augmentées, l’exposition peut être au niveau qui augmente le risque de développement du cancer, par exemple. Les lésions peuvent être quantifiées dans l’ADN de n’importe quel système cellulaire et alternativement dans l’urine, le plasma, le milieu de culture de salive avec des adaptations dans la préparation d’échantillon.Pour commencer, utilisez une plaque de culture placée sur la glace comme base pour couper un morceau de tissu avec un scalpel. Pesez un gramme du tissu dans chaque tube plafonné de 50 millilitres pour une utilisation immédiate. Gardez le reste des tissus sur de la glace sèche avant de le stocker à moins 80 degrés Celsius.À chaque tube, ajouter 10 millilitres de la solution de lyse cellulaire commerciale contenant de la deferoxamine de 0,5 millimolaire et garder sur la glace. Réglez l’homogénéiseur tissulaire à basse vitesse, autour de 60 à 90 rpm. Homogénéiser les tissus sur la glace pendant quelques minutes jusqu’à ce que la solution soit sans fragments de tissu.Ajouter ensuite 150 microlitres de solution proteinase K à chaque échantillon homogénéisé. Secouez les tubes par inversion et gardez-les à température ambiante pendant la nuit. Le matin, ajouter 40 microlitres de ribonuclease Solution A, secouer par inversion, et garder les tubes à température ambiante pendant deux heures.Ajouter cinq millilitres de solution commerciale de précipitation protéique, vortex vigoureusement, et centrifugeuse à 2000 fois g, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes. Transférer les supernatants dans des tubes plafonnés de 50 millilitres contenant 10 millilitres d’isopropanol froid. Inverser délicatement les tubes plusieurs fois jusqu’à l’observation de l’ADN précipité.Utilisez une pipette Pasteur fermée à la fin pour recueillir l’ADN précipité. Transférer l’ADN recueilli dans des tubes contenant quatre millilitres de tampon Tris de 10 milli molaires et un millimolaire deferoxamine au pH sept pour dissoudre. Après la dissolution complète de l’ADN dans les tubes, ajouter quatre millilitres d’une solution chloroforme contenant 4% d’alcool d’isoamyle à chaque tube.Inverser les tubes 10 fois pour l’homogénéisation, centrifugeuse à 2000 fois g, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes, et transférer les phases supérieures vers de nouveaux tubes. Répétez le lavage de la phase supérieure avec la solution chloroforme deux fois de plus. Ajoutez ensuite huit millilitres d’éthanol absolu et 0,4 millilitres d’une solution de chlorure de sodium cinq molaires pour précipiter l’ADN.Encore une fois, recueillir l’ADN précipité, et le transférer à trois millilitres de 70% d’éthanol. Répétez le lavage avec 70% d’éthanol une fois de plus. Jetez la solution d’éthanol avec prudence et inversez les tubes contenant l’ADN précipité sur du papier absorbant pour éliminer l’excès de solution.Après avoir préparé des échantillons d’hydrolyse d’ADN avec la norme isotopique 15N5 de 1, N6-etheno-deoxyadenosine et 15N5 norme isotopique de 1, N2-etheno-deoxyguanosine selon le manuscrit, transférer 10 microlitres de chaque échantillon dans des tubes pour la quantification des désoxynucléosides normaux par HPLC-UV. Soumettre le volume résiduel à l’extraction en phase solide. Pour effectuer HPLC, élisez d’abord une colonne C18 attachée à une cartouche C18 SecurityGuard avec un gradient de 0,1% d’acide formic et de méthanol.Configurer le programme de gradient pour fonctionner de zéro à 25 minutes avec zéro à 18% de méthanol, de 25 à 27 minutes avec 18 à 0% de méthanol, puis de 27 à 37 minutes avec 0% de méthanol à un débit d’un millilitre par minute et 30 degrés Celsius. Par la suite, injecter un volume entre deux et six microlitres pour chaque échantillon réservé à la quantification normale des désoxynucléosides. Réglez le détecteur DAD à 260 nanomètres pour l’intégration des pics de désoxyguanosine et de désoxyadenosine.Pour effectuer l’extraction en phase solide pour les analyses de 1, N6-etheno-deoxyadenosine et 1, N2-etheno-deoxyguanosine, chargez d’abord les cartouches avec une série de solutions à un volume d’un millilitre. Ajouter 100% de méthanol, d’eau déionisée, d’échantillon d’ADN hydrolysé, d’eau déionisée, 10% de méthanol, 15% de méthanol, et enfin 100% de méthanol pour la collecte. Ensuite, procédez selon le manuscrit.Après avoir préparé des échantillons d’hydrolyse d’ADN 15N5 norme isotopique de 8-oxo-deoxyguanosine, transférer 80 microlitres de chaque échantillon dans des flacons pour analyse dans le système HPLC-ESI-MS/MS. Réservez les 20 microlitres restants pour la quantification de la désoxyguanosine sur HPLC-UV, comme cela a été fait précédemment. Pour l’analyse de la 8-oxo-deoxyguanosine sur HPLC-ESI-MS/MS, étiez la colonne C18 A couplée à une cartouche C18 SecurityGuard avec un gradient de solvant A et B à un débit de 150 microlitres par minute et 25 degrés Celsius.Faire fonctionner la pompe binaire avec zéro à 15% du solvant B pendant les 25 premières minutes, 15 à 80% du solvant B de 25 à 28 minutes, 80% du solvant B de 28 à 31 minutes, 80 à 0% du solvant B de 31 à 33 minutes, et 0% du solvant B de 33 à 46 minutes. Dirigez les 16 premières minutes de la colonne A eluent à gaspiller. Condition colonne B par la pompe isocratique avec une solution de 15% de méthanol dans l’eau contenant 0,1% d’acide formique à un débit de 150 microlitres par minute.Après six minutes, vérifiez le chromatogramme pour vous assurer que la norme de 8 oxo-deoxyguanosine s’échappe de la colonne A.Pendant l’intervalle de 16 à 32 minutes, passez la valve à la position permettant la connexion entre la colonne A et la colonne B.Fermez la valve à 32 minutes pour épuuter la 8-oxo-désoxyguanosine de la deuxième colonne et obtenir un pic chromatographique aigu. Pour l’analyse de 1, N6-etheno-deoxyadenosine et 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute une colonne C18 couplée à une cartouche C18 SecurityGuard avec un gradient de solvant A et B à un débit de 130 microlitres par minute et 25 degrés Celsius. Exécutez la pompe binaire avec 0% du solvant B pendant les 10 premières minutes, zéro à 20 % du solvant B pendant 10 à 39 minutes, 20 à 75 % du solvant B de 39 à 41 minutes, 75 % du solvant B de 41 à 46 minutes, 75 à 0 % du solvant B de 46 à 47 minutes et 0 % du solvant B de 47 à 60 minutes.Utilisez la vanne de commutation pour diriger les 35 premières minutes d’étiente à gaspiller et la fraction de 35 à 42 minutes vers la source ESI. Assurez-vous que les normes d’adducteur s’échappent de la colonne dans l’intervalle défini. Intégrer les pics de 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 norme isotopique de 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, norme isotopique 15N5 de 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, et 15N5 norme isotopique de 1, N2-etheno-deoxyguanosine des analyses HPLC-ESI-MS/MS.Calculer les ratios de surface pour les courbes d’étalonnage et les échantillons. Établissez les courbes d’étalonnage et calculez les quantités de lésions dans chaque échantillon injecté. Intégrer les pics de désoxyguanosine et de désoxyadenosine des analyses HPLC-UV.Utilisez les zones pour établir les courbes d’étalonnage et calculer les quantités de désoxyguanosine et de désoxyadenosine chez les animaux de chaque échantillon injecté. Calculer les fractions molaire pour 8-oxo-deoxyguanosine sur la désoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine sur la désoxyadenosine, et 1, N2-etheno-deoxyguanosine sur la désoxyguanosine, qui donnent le nombre de lésions par million de désoxyguanosine normale ou deoxyadenosine. Un chromatogramme représentatif de l’ADN purifié obtenu par HPLC-UV montre la présence des quatre désoxynucléosides normaux, exempts des ribonucleosides d’ARN, démontrant la pureté d’ADN.Des chromatogrammes représentatifs de HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, et 1, N2-etheno-deoxyguanosine dans des échantillons d’ADN de tissu de souris sont montrés. Le chromatogramme obtenu avec détection UV montre les quatre désoxynucléosides normaux s’échappant de la première colonne jusqu’à environ 10 minutes, avec une bonne séparation de 8-oxo-deoxyguanosine, éliminant les interférences non désirées. Une chose importante à retenir pour les quantifications exactes est d’avoir toujours les mêmes quantités de normes internes dans le volume d’injection dans les courbes d’étalonnage et les échantillons.Les méthodes présentées ici peuvent être adaptées pour la quantification d’autres désoxynucléosides modifiés. L’expansion de la bande de désoxynucléosides modifiés permet une meilleure compréhension des mécanismes pathophysiologiques sous-jacents. Nous pouvons étudier le rôle des dommages oxydants dans différentes situations telles que l’exposition aux xénobiotiques, le diabète, et la transformation maligne de cellules, aidant ainsi le développement des stratégies préventives et de traitement.

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