Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Proc. 2012/22190-3 und 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 und 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) und CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira und A. A. F. Oliveira erhielt Stipendien von FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) und CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. Di Mascio, P. H. N. Saldiva und A. P. M. Loureiro erhielten Stipendien von CNPq.
Einige Figuren und Tabellen, die in diesem Werk zu sehen sind, wurden ursprünglich in Oliveira A.A.F. et al.Genotoxische und epigenotoxische Wirkungen bei Mäusen veröffentlicht, die konzentrierten Feinstaub in der Umgebung ausgesetzt sind (PM 2.5) aus der Stadt São Paulo, Brasilien. Partikel-und Fasertoxikologie. 15, 40 (2018).

Vier Wochen alte männliche A/J-Mäuse, spezifische Erreger frei, wurden vom Zuchtzentrum für Labortiere der Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, erhalten und entsprechend dem Ethikkomitee der Medizinischen Fakultät der Universität behandelt São Paulo (Protokoll no 1310/09).
1. Sammlung von Mäzenen
<ol><li>Das Tier mit Xylazine und Ketamin betäuben. Für eine Maus mit 30 g Körpergewicht, injizieren Sie eine Lösung (nicht mehr als 2 mL) mit 2,63 mg ...

Ein großes Problem, das in den 8-oxodGuo-Analysen mit HPLC-Methoden gefunden wird, ist die mögliche Induktion ihrer Formation während der Aufarbeitungsprozesse der DNA-Extraktion,derDNA-Hydrolyseund der Konzentration von DNA-Hydrolysaten 22,38. Um das Problem der 8-oxodGuo-Kunstbildung zu minimieren, wird empfohlen, alle DNA-Extraktions-, Speicher-und Hydrolysee-Lösungen mit Deferoxamin zu ergänzen, die Natrium-Jod-Chaotropic-Methode zu verwenden und Phenol ...

Einige reaktive Sauerstoffarten (ROS) sind in der Lage, Kohlenstoff-Doppelbindungen von DNA-Basen zu oxidieren und einige Kohlenstoff in der Deoxyribose-Feuchtigkeit, wodurch oxidierte Basen und DNA-Strangbrüche 1 erzeugt werden. Als negativ geladenes, stickstoff-und Sauerstoffatome geladenes Molekül ist die DNA auch ein Ziel für elektrophile Gruppen, die mit den nukleophilen Standorten (Stickstoff und Sauerstoff) kovalent reagieren und Produkte liefern,die als DNA-Adduktoren bezeichnet werden. DNA-Addukte und oxidierte DNA-Basen sind also Beispiele für DNA-Läsionen, die nützliche Biomarker für die Toxizitätsbewertung von elektrophilen Substanzen sind, reaktive Elektrophilen bei Bioveränderung erzeugen oder oxidativen Stress erzeugen1, 2. Runde Obwohl die modifizierten DNA-Basen durch Basis-oder Nukleotid-Exzisionsreparatur (BER oder NER) aus der DNA entfernt werden können, führt die Induktion eines Ungleichgewichts zwischen der Erzeugung und Entfernung von DNA-Läsionen zu Gunsten der ersteren zu einer Nettoerhöhung ihrer DNA-Überstunden 3< /c5 >. Ergebnisse sind die Erhöhung der DNA-Mutationsraten, eine verminderte Genexpression und eineverminderte Proteinaktivität 2, 4,5, 6, 7,Effekte, die engmitder Entwicklung von Krankheiten. DNA-Mutationen können sich auf verschiedene zelluläre Funktionen auswirken, wie z. B. Zellsignalisierung, Zellzyklus, Genomintegrität, Telomerstabilität, Epigenom, Chromatin-Struktur, RNA-Splicing, Protein-Haffeestose, Stoffwechsel, Apoptose und Zelldifferenzierung8 ,9. Strategien zur Verlangsamung von Zellmutationsraten und chronischer Krankheitsentwicklung (z.B. Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) durchlaufen das Wissen um die Mutationsquellen, darunter DNA-Läsionen und deren Ursachen.
ROS, die endogen im Übermaß erzeugt werden, aufgrund von Schadstoffexposition, hartnäckiger Entzündung, Krankheitspophysiologie (z.B. Diabetes), etc., sind wichtige Ursachen für Biomolekule-Schäden, einschließlichDNA und Fettschäden 1. Zum Beispiel oxidiert das hochreaktive Hydroxylradikal (OH), das sich aus der H2O 2-Reduktion durch Übergangs-Metallionen (Fe2 +, Cu+) gebildet hat, die DNA-Basen, die DNA-Zuckergerüchte und die mehrfach ungesättigten Fettsäuren bei diffusionsgesteuerten Fettsäuren. Sätze10. Unter den 80 bereits charakterisierten oxidierten Nukleobasen3, Die am meisten untersuchte ist 8-oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoGua) oder 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-Deoxyguanosin (8-oxodGuo , Abbildung1), eine Läsion, die in der Lage ist, GT-Transformatoren in induzieren Säugetierzellen10,11. Es wird durch die monoelektronische Oxidation von Guanin oder durch Hydroxylradikal oder Singlet-Sauerstoff-Attacke von Guanin in DNA1 gebildet. Polyungesättigte Fettsäuren sind weitere wichtige Ziele hochreaktiver Oxidantien, wie zum Beispiel • OH, die den Prozess der Fettperoxidation1,12inGang setzen. Es entstehen Fettsäure-Hydroperoxide, die zu elektrophilen Aldehyden und Epoxyaldehyden zersetzen können, Wie Malondialdehyd, 4-hydroxy-2-nonenal, 2,4-deadienal, 4,5 epoxy-(2E)-dezental, hexenal, Akrolein, Krotonaldehyd, die In der Lage, mutagene exozyklische DNA-Addukte wie Malondialdehyde-, Propano-oder Etheno-Addukte 1,12,13zu bilden. Das Etheno Addukte 1,N2-etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-DGuo , Abbildung 1) und 1,N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-madAdo, Abbildung 1 ) wurden als potenzielle Biomarker in der Pathophysiologie der Entzündung14,15vorgeschlagen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Bild 1. Chemische Strukturen der DNA-Läsionen, die in der vorliegenden Studie quantifiziert wurden. DR = 2 ́-deoxyribose. Diese Figur wurde von Oliveira et al. 34 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
Studien, die in den frühen 1980er Jahren durchgeführt wurden, ermöglichten die sensible Erkennung von 8-oxodGuo durch eine hochleistungsfähige Flüssigchromatographie in Verbindung mit elektrochemischer Erkennung (HPLC-ECD). Die Quantifizierung von 8-oxodGuo durch die HPLC-ECD in mehreren biologischen Systemen, die oxidierenden Bedingungen unterworfen waren, führte zur Erkennung von 8-oxodGuo als Biomarker oxidativ induzierter Grundschäden in DNA1,16. Obwohl robust und die Quantifizierung von 8-oxodGuo im niedrigen Fmol-Bereich 17 ermöglicht, setzen die HPLC-EKD-Messungen auf die Genauigkeit der Analyte-Retendesszeit zur Analyteerkennung und auf die Chromatographie-Auflösung, um Störungen von Andere Stichproben. Da die elektrochemische Erkennung den Einsatz von Salz (z.B. Kaliumphosphat, Natriumacetat) in der mobilen Phase erfordert, benötigt die Aufrechterhaltung adäquater Analysebedingungen eine routinemäßige Säulen-und Gerätereinigungszeit.
Alternativ ist die Verwendung des bakteriellen DNA-Reparaturenzyms formamidopyrimidine DNA Glycosylase (FPG) und, Danach entstand menschliches 8-oxoguanin-Glykosylase 1 (hOGG1) zur Erkennung und Entfernung von 8-oxoGua aus der DNA als Mittel zur Induktion von DNA-Alkali labile Websites. Die Alkali-Labillierungsstellen werden in DNA-Strang-Breaks umgewandelt und ermöglichen die sehr hohe empfindliche indirekte Quantifizierung von 8-oxoGua durch alkalische Einzelzellen-Gel-Elektrophorese ("Kometenuntersuchen"). Die hohe Empfindlichkeit und die Durchführung der Analysen ohne zelluläre DNA-Extraktion sind die Hauptvorteile dieser Art von Test. Es gibt den niedrigsten Stand-Zustand-Wert von 8-oxoGua in der DNA, in der Regel 7-10 Mal niedriger als die, die durch bioanalytische Methoden auf der Basis von HPLC erhalten. Es handelt sich jedoch um eine indirekte Messung von 8-oxoGua und einige Nachteile sind die fehlende Spezifität oder die unbekannte Effizienz der verwendeten Reparaturenzyme1,16,18.
Immunoassays sind weitere Methoden, die zur Erkennung von 8-oxoGua1 und exozyklischen DNA-Addukten verwendet werden, wie1, N6-dAdo und 1,N2-dGuo12. Trotz der Empfindlichkeit ist ein Mangel an Antikörpern zur Erkennung von DNA-Läsionen der Mangel an Spezifität aufgrund von Kreuzreaktionen auf andere Bestandteile biologischer Proben, einschließlich der normalenDNA-Basen 1,12. Die exozyklischen DNA-Addukte, darunter 1,N6-dAdo und1, N2-dGuo, können auch durch hochsensible 32P-Postbeschriftungsuntersuchungen 12 erkanntund quantifiziert werden. Die hohe Empfindlichkeit von 32P-Postbeschriftung ermöglicht die Verwendung von sehr geringen Mengen an DNA(z.B. 10 μg) zur Erkennung von etwa 1 Addukt pro 1010 normalen Basen 19. Allerdings sind der Einsatz von Radio-Chemikalien, mangelnde chemische Spezifität und geringe Genauigkeit einige Nachteile 19,20.
Eine gemeinsame Einschränkung der oben genannten Methoden ist die geringe Selektivität oder Spezifität für die Erkennung der gewünschten Moleküle. In diesem Szenario entwickelte sich HPLC in Verbindung mit der Elektrospray-Ionisierung der Massenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS und HPLC-MS3) zu dem Goldstandard für die Quantifizierung von modifizierten Nukleoside in biologischen Matrizen, wie DNA, Urin, Plasma und Speichel. 1 , 19 , 20. Vorteile der HPLC-ESI-MS/MS-Methoden sind die Empfindlichkeit (typischerweise im niedrigen Fmol-Bereich) und die hohe Spezifität, die i zur Verfügung stellt, die chromatographische Trennung, ii) das charakteristische und bekannte Muster der Molekül-Fragmentierung innerhalb der Masse Spektrometer-Kollisionskammer, und iii) die genaue Messung des ausgewählten Massen-bis Ladungsverhältnisses (m/z) im Multitreaktionsüberwachungsmodus 1,19. Der Einsatz isotopisch beschrifteter interner Standards erhöht den Vorteil von Korrekturen für Molekülverluste während der DNA-Hydrolyse-und Analytenanreicherungsschritte sowie für Unterschiede bei der Analytitisierung zwischen Proben. Es hilft auch bei der Identifizierung der richtigen chromatographischen Spitze, wenn mehr als ein Peak ist1,12,19,20.
Für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1,N6-dAdo und 1,N 2-dGuo in DNA, die aus verschiedenen biologischen Proben gewonnen wurde, wurden mehrere Methoden verwendet, die auf HPLC-ESI-MS/MSbasieren. ,21,22, 23,24, 25, 26, 27,28,29 . Feinstaub (PM 2.5) trägt organische und anorganische Chemikalien, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), Nitro-PAHs, Aldehyde,Ketone, Carboxylsäuren, Quinoline, Metalle und wasserlösliche Ionen, die Entzündungen verursachen können und Oxidativer Stress, Bedingungen, die das Auftreten von Biomolekule-Schäden und Krankheit30,31,32,33begünstigen. Wir stellen hier validierte HPLC-ESI-MS/MS-Methoden vor, die erfolgreich für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N6-dAdo und 1,N2-dGuo in Lungen-, Leber-und Nieren-DNA von A/J-Mäusen zur Beurteilung der Die Auswirkungen der UmgebungsbelastungPM2.5 34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA-Addukte und oxidierte DNA-Basen sind Beispiele für DNA-Läsionen, die nützliche Biomarker für die Toxizitätsbewertung von Substanzen sind, die elektrophil sind, reaktive Elektrophilen nach Bioveränderung erzeugen oder oxidativen Stress verursachen. Unter den oxidierten Nukleobasen ist die am meisten untersuchte 8-oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoGua) oder 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-Deoxyguanosin (8-oxodGuo), ein Biomarker von oxidativ induzierten Basisschäden in der DNA. Aldehyde und Epoxyaldehyde, die aus dem Lipidperoxidationsprozess resultieren, sind elektrophile Moleküle, die in der Lage sind, mutagene exozyklische DNA-Adduktezu bilden, wie zum Beispiel die Etheno-Addukte 1, N 2-etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2- Die "Guo" und "1, N6-etheno-2"-deoxyadenosine (1,N6-bobdAdo), die als potenzielle Biomarker in der Pathophysiologie der Entzündung vorgeschlagen wurden. Für die Entwicklung präventiver Strategien zur Verlangsamung von Zellmutationsraten und chronischer Krankheitsentwicklung (z.B. Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) sind selektive und sensible Methoden für ihre Quantifizierung in der DNA notwendig. Unter den für ihre Erkennung zur Verfügung stehenden sensiblen Methoden (Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit elektrochemischen oder Tandemmassenspektrometrie-Detektoren, Kometenuntersuchungen, Immunoassays, 32 P-Postbeschriftung) sind die selektivsten, die aufder Grundlage von Auf Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Die Selektivität ist ein wesentlicher Vorteil bei der Analyse komplexer biologischer Proben, und HPLC-ESI-MS/MS entwickelte sich als Goldstandard für die Quantifizierung von veränderten Nukleoside in biologischen Matrizen wie DNA, Urin, Plasma und Speichel. Der Einsatz isotopisch beschrifteter interner Standards erhöht den Vorteil von Korrekturen für Molekülverluste während der DNA-Hydrolyse-und Analytenanreicherungsschritte sowie für Unterschiede bei der Analytitisierung zwischen Proben. Es hilft auch bei der Identifizierung des korrekten chromatographischen Peaks, wenn mehr als ein Peak vorhanden ist.
Wir stellen hier validierte sensible, genaue und präzise HPLC-ESI-MS/MS-Methoden vor, die erfolgreich für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N6-dAdo und 1,N2-dGuo in Lungen-, Leber-und NierenDNA von A/J-Mäusen eingesetzt wurden. Die Bewertung der Auswirkungen der Umgebungsbelastung PM 2.5.

Die durchschnittlichen DNA-Konzentrationen (± SD), die von der Mäuselleber (~ 1 g Gewebe) gewonnen werden, Die Lunge (~ 0,2 g Gewebe) und die Niere (~ 0,4 g Gewebe) waren jeweils 5,068 ± 2,615, 4.369 ± 1,021 und 3,223 ± 723 μg/mL im Endvolumen von 200 μL. Ein repräsentatives Chromatogramm, das von HPLC-DAD der gereinigten DNA gewonnen wurde, ist in Abbildung3 dargestellt. Das Vorhandensein der vier 2 '-deoxynucleoside, frei von den RNA-Ribonucleo-Seit...

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Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen die Quantifizierung von DNA-Läsionen, die durch oxidativen Stress induziert werden, und tragen zum Verständnis pathophysiologischer Mechanismen bei, die zielartig für die Prävention und Behandlung von Krankheiten sein können. Selektivität und Empfindlichkeit sind die Hauptvorteile. Selektivität ist ein wesentlicher Vorteil bei der Arbeit mit komplexen biologischen Proben.HPLC gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie entwickelte sich als Goldstandard für diese Art der Quantifizierung mit biologischen Matrizen. Oxidativer Stress ist ein häufiges Ereignis für verschiedene pathophysiologische Prozesse. Erhöhte Etheno-Addukte wurden in Geweben oder Urin von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen nachgewiesen.Die DNA-Läsionen liefern auch Informationen über endogene Ereignisse, die durch die Exposition gegenüber Schadstoffen ausgelöst werden. Wenn die DNA-Läsionen erhöht werden, kann die Exposition auf dem Niveau sein, das das Risiko der Krebsentwicklung erhöht, zum Beispiel. Die Läsionen können in der DNA aus jedem zellulären System und alternativ in Urin, Plasma, Speichelkulturmedium mit Anpassungen in der Probenvorbereitung quantifiziert werden.Verwenden Sie zunächst eine Kulturplatte, die auf Eis als Basis gelegt wird, um ein Stück Gewebe mit einem Skalpell zu schneiden. Wiegen Sie ein Gramm des Gewebes in jedem 50-Milliliter-Rohr für den sofortigen Gebrauch. Bewahren Sie das restliche Gewebe auf Trockeneis auf, bevor Sie es bei minus 80 Grad Celsius lagern.In jede Röhre 10 Milliliter der kommerziellen Zelllyselösung mit 0,5 Millimolar Deferoxamin hinzufügen und auf Eis halten. Stellen Sie den Gewebehomogenisator auf eine niedrige Geschwindigkeit von etwa 60 bis 90 Umdrehungen pro Minute ein. Homogenisieren Sie die Gewebe auf Demeis für ein paar Minuten, bis die Lösung ohne Gewebefragmente ist.Dann fügen Sie 150 Mikroliter Proteinase-K-Lösung zu jeder homogenisierten Probe hinzu. Schütteln Sie die Rohre durch Umkehrung, und halten Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht. Am Morgen 40 Mikroliter Ribonuklease Eine Lösung hinzufügen, durch Inversion schütteln und die Rohre zwei Stunden bei Raumtemperatur halten.Fügen Sie fünf Milliliter kommerzielle Protein-Fälllösung, Wirbel kräftig, und Zentrifuge bei 2 000 mal g, vier Grad Celsius, für 10 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in 50-Milliliter-Behälter mit 10 Milliliter kaltem Isopropanol. Invertieren Sie die Röhren vorsichtig mehrmals bis zur Beobachtung der gefällten DNA.Verwenden Sie eine Pasteur Pipette am Ende geschlossen, um die gefällte DNA zu sammeln. Übertragen Sie die gesammelte DNA in Tuben, die vier Milliliter 10-Millimolar Tris-Puffer und ein Millimolar-Deferoxamin bei pH-Wert sieben enthalten, um sich aufzulösen. Nachdem die DNA vollständig in den Röhrchen gelöst ist, fügen Sie vier Milliliter einer Chloroformlösung, die 4% Isoamylalkohol enthält, in jede Röhre ein.Umkehren Sie die Rohre 10 Mal für die Homogenisierung, Zentrifuge bei 2.000 mal g, vier Grad Celsius, für 10 Minuten, und übertragen Sie die oberen Phasen auf neue Rohre. Wiederholen Sie die Wäsche der oberen Phase mit der Chloroformlösung zwei weitere Male. Dann fügen Sie acht Milliliter absolutes Ethanol und 0,4 Milliliter einer fünfmollaren Natriumchloridlösung hinzu, um die DNA auszufällen.Wieder sammeln Sie die gefällte DNA und übertragen Sie sie auf drei Milliliter 70% Ethanol. Wiederholen Sie die Wäsche mit 70%Ethanol noch einmal. Entsorgen Sie die Ethanollösung mit Vorsicht und kehren Sie die Rohre um, die die gefällte DNA auf saugfähigem Papier enthalten, um überschüssige Lösung zu entfernen.Nach der Herstellung von DNA-Hydrolyseproben mit 15N5 Isotopenstandard von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 15N5-Isotopenstandard von 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin gemäß Manuskript, übertragen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in Tuben zur Quantifizierung normaler Desoxynukleoside durch HPLC-UV. Unterwerfen Sie das Restvolumen der Festphasenextraktion. Um HPLC durchzuführen, wird zunächst eine C18-Säule an einer C18 SecurityGuard-Patrone mit einem Gradienten von 0,1% Ameisensäure und Methanol befestigt.Richten Sie das Gradientenprogramm ein, um von null bis 25 Minuten mit null bis 18 % Methanol, von 25 bis 27 Minuten mit 18 bis 0% Methanol, dann von 27 bis 37 Minuten mit 0% Methanol bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute und 30 Grad Celsius zu laufen. Danach wird für jede Probe ein Volumen zwischen zwei und sechs Mikrolitern injiziert, das für die normale Quantifizierung von Desoxynukleosiden reserviert ist. Stellen Sie den DAD-Detektor auf 260 Nanometer für die Integration der Desoxyguanosin- und Desoxyadenosinspitzen.Um die Festphasenextraktion für Analysen von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin durchzuführen, laden Sie die Patronen zunächst mit einer Reihe von Lösungen mit einem Volumen von einem Milliliter. 100% Methanol, entionisiertes Wasser, hydrolysierte DNA-Probe, entionisiertes Wasser, 10%Methanol, 15%Methanol und schließlich 100% Methanol zur Sammlung hinzufügen. Gehen Sie dann nach dem Manuskript vor.Nach der Herstellung von DNA-Hydrolyseproben 15N5 Isotop-Standard von 8-Oxo-Deoxyguanosin, übertragen Sie 80 Mikroliter jeder Probe in Fläschchen zur Analyse im HPLC-ESI-MS/MS-System. Reservieren Sie die restlichen 20 Mikroliter für die Quantifizierung von Desoxyguanosin auf HPLC-UV, wie zuvor getan. Zur Analyse von 8-Oxo-Deoxyguanosin auf HPLC-ESI-MS/MS wird die C18-Säule A mit einer C18 SecurityGuard-Patrone mit einem Gradienten von Lösungsmittel A und B bei einer Durchflussrate von 150 Mikrolitern pro Minute und 25 Grad Celsius gekoppelt.Führen Sie die binäre Pumpe mit null bis 15 % des Lösungsmittels B in den ersten 25 Minuten, 15 bis 80 % des Lösungsmittels B von 25 bis 28 Minuten, 80 % des Lösungsmittels B von 28 bis 31 Minuten, 80 bis 0 % des Lösungsmittels B von 31 bis 33 Minuten und 0 % des Lösungsmittels B von 33 bis 46 Minuten. Richten Sie die ersten 16 Minuten der Spalte A eluent auf Abfall. Zustandssäule B durch die isotratische Pumpe mit einer Lösung von 15%Methanol in Wasser, das 0,1%Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 150 Mikrolitern pro Minute enthält.Überprüfen Sie nach sechs Minuten das Chromatogramm, um sicherzustellen, dass die 8-Oxo-Deoxyguanosin-Standardelutes aus Der Spalte A. Während des Intervalls von 16 bis 32 Minuten das Ventil auf die Position schalten, die eine Verbindung zwischen Spalte A und Spalte B ermöglicht. Schließen Sie das Ventil bei 32 Minuten, um 8-Oxo-Deoxyguanosin aus der zweiten Kolonne zu elute und erhalten Sie eine scharfe chromatographische Spitze. Zur Analyse von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin, eine C18-Säule gekoppelt mit einer C18 SecurityGuard-Patrone mit einem Gradienten von Lösungsmittel A und B bei einer Durchflussrate von 130 Mikroliter pro Minute und 25 Grad Celsius. Führen Sie die binäre Pumpe mit 0% Lösemittel B für die ersten 10 Minuten, null bis 20% des Lösungsmittels B für 10 bis 39 Minuten, 20 bis 75% des Lösungsmittels B von 39 bis 41 Minuten, 75% des Lösungsmittels B von 41 bis 46 Minuten, 75 bis 0% des Lösungsmittels B von 46 bis 47 Minuten und 0% des Lösungsmittels B von 47 bis 60 Minuten.Verwenden Sie das Schaltventil, um die ersten 35 Minuten des Eluents auf Abfall und den Anteil von 35 bis 42 Minuten an die ESI-Quelle zu leiten. Stellen Sie sicher, dass die Adduktorenstandards aus der Spalte im festgelegten Intervall entfernt sind. Integrieren Sie die Spitzen des 8-Oxo-Deoxyguanosin 15N5-Isotopenstandards von 8-Oxo-Deoxyguanosin, 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin, 15N5 Isotop-Standard von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin, 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin und 15N5 Isotop-Standard von 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin aus den HPLC-ESI-MS/MS-Analysen.Berechnen Sie die Flächenverhältnisse für die Kalibrierkurven und die Proben. Legen Sie die Kalibrierkurven fest, und berechnen Sie die Arten von Läsionen in jeder injizierten Probe. Integrieren Sie die Spitzen von Desoxyguanosin und Desoxyadenosin aus den HPLC-UV-Analysen.Verwenden Sie die Bereiche, um die Kalibrierkurven zu bestimmen, und berechnen Sie die Mengen an Desoxyguanosin und Desoxyadenosin bei Tieren in jeder injizierten Probe. Berechnen Sie die Molfraktionen für 8-Oxo-Deoxyguanosin über Desoxyguanosin, 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin über Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin über Desoxyguanosin, die die Anzahl der Läsionen pro eine Million normaler Desoxyguanosin oder Deoxyadenosin ergeben. Ein repräsentatives Chromatogramm der von HPLC-UV erhaltenen gereinigten DNA zeigt das Vorhandensein der vier normalen Desoxynukleoside, frei von den RNA-Ribonukleosiden, die die DNA-Reinheit demonstrieren.Repräsentative Chromatogramme von HPLC-ESI-MS/MS aus 8-Oxo-Deoxyguanosin, 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin in Mäusegewebe-DNA-Proben werden gezeigt. Das mit UV-Detektion erhaltene Chromatogramm zeigt die vier normalen Desoxynukleosideen, die von der ersten Kolonne bis etwa 10 Minuten eluieren, mit einer guten Trennung von 8-Oxo-Deoxyguanosin, wodurch unerwünschte Interferenzen vermieden werden. Für exakte Quantifizierungen ist es wichtig, in den Kalibrierkurven und Proben immer die gleichen Mengen an internen Standards im Injektionsvolumen zu haben.Die hier vorgestellten Methoden können für die Quantifizierung anderer modifizierter Desoxynukleoside angepasst werden. Die Erweiterung des Bandes modifizierter Desoxynukleoside ermöglicht ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen. Wir können die Rolle oxidativer Schäden in verschiedenen Situationen wie der Exposition gegenüber Xenobiotika, Diabetes und bösartigen Zelltransformationen untersuchen und so die Entwicklung von Präventions- und Behandlungsstrategien unterstützen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrowelle Assisted Schnelle Diagnose von Plant Virus Erkrankungen durch Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Mit der phylogenetischen Analyse zu eukaryotischen Gens Herkunft untersuchen

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

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Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

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Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...