Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (המלון מבצע את הצ דה סאו פאולו, הליך 2012/22190-3 ו-2012/08616-8), CNPq (הליך 454214/2014-6 ו-429184/2016-6), שכמיות, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa האוניברסיטה דה סאו פאולו), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FAPESP/גלימות/ כפיר/פאפאג/FAPESP; הליך 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/שכמיות; שגרה. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; שגרה. 2011.1.9352.1.8) ו-CEPID Redoxoma (FAPESP; הליך. 2013/07937-8). ט. פ. אוליביירה ו-a. A. A. A. אוליביירה קיבל מלגות FAPESP (הליך. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) ו שכמיות (מפואר ביותר). מ. ה. ג. מדיירוס, פ. די Mascio, פ. נ. סאלדיווה, וא. פ. לוברו קיבל מלגות מ-CNPq.
חלק מהדמויות והטבלאות הקיימות בעבודה זו פורסמו במקור ב-אוליביירה A.A.F. et al. ההשפעות של הגנוזים ואפיגנוטוקסיונים בעכברים חשופים לחומר הסביבתי מרוכז חלקיקים עדינים (PM2.5) מסאו פאולו סיטי, ברזיל. חלקיקים וסיבי טוקסיקולוגיה 15, 40 (2018).

ארבעה שבועות גברים A/J עכברים, הפתוגן הספציפי חינם, התקבלו מן המרכז רבייה של בעלי חיים מעבדה של פונדסאו אוסמדו קרוז (FIOCRUZ ריו דה ז'ניירו, ברזיל, וטופלו בהתאם ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת של סאו פאולו (פרוטוקול no 1310/09).
1. אוסף של ממחטות עכברים
<ol><li>. החיה את בעל ?...

בעיה מרכזית הנמצאת בניתוח 8-oxodguo על-ידי שיטות הבדיקות היא האינדוקציה האפשרית של הקמתה במהלך הליכי בדיקות של חילוץ dna, dna הידרוליזה, וריכוז של ה-dna הידרוליטים22,38. כדי למזער את הבעיה של היווצרות העובדתי של 8-oxodguo, מומלץ התוספת של דפרוקסמין לכל הפקת DNA, אחסון והידרו?...

כמה מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מסוגלים החמצן איגרות חוב כפול של DNA בסיסים ו כמה פחמנים deoxyribose moiety, יצירת בסיסים חמצון ו-DNA שובר הגדיל1. כמולקולה טעונה שלילית עשיר חנקן ואטומי חמצן, DNA הוא גם יעד עבור קבוצות electrophilic כי מגיבים בעקשנות עם האתרים הנופילים (חנקן וחמצן), מתן מוצרים הנקראים adducts DNA2. כך, adducts DNA ו תחמוצת בסיסים DNA הם דוגמאות של נגעים DNA כי הם ביטויים שימושיים עבור הערכה רעילות של חומרים, כי הם electrophilic, ליצור אלקטרופילנים תגובתי על הטרנספורמציה ביולוגית, או לגרום למתח חמצוני1, 2. שתיים. למרות בסיסים DNA שונה ניתן להסיר דנ א על ידי בסיס או נוקלאוטיד תיקון כריתה (BER או NER), אינדוקציה של חוסר איזון בין הדור וההסרה של נגעים DNA לטובת מוביל לשעבר לעלייה נטו של רמות שלהם ב-DNA שעות נוספות ב-דנ א3 < /c5 >. תוצאות הן הגידול של שיעורי מוטציה DNA, מופחתת ביטוי גנים, ופעילות חלבון מופחת2,4,5,6,7, אפקטים הקשורים היטב ה פיתוח מחלות. מוטציות DNA עשוי להשפיע על פונקציות סלולריות מגוונות, כגון איתות התא, מחזור התא, שלמות הגנום, היציבות טלומר, epigenome, מבנה כרומטין, שחבור RNA, הומאוסטזיס חלבון, מטבוליזם, אפופטוזיס, ובידול התא8 ,9. אסטרטגיות להאט את קצב מוטציה התא ופיתוח מחלות כרוניות (למשל, סרטן, מחלות ניווניות) לעבור דרך הידע של מקורות מוטציה, ביניהם, נגעים DNA והגורמים שלהם.
ROS שנוצר באופן שולי עודף, בשל חשיפה מזהמים, דלקת מתמשכת, פתופסולוגיה המחלה (למשל, סוכרת), וכו ', הם גורמים חשובים של נזק ביואואלי, כולל DNA ו נזק לשומנים1. כדוגמה, הידרוקסיל תגובתי מאוד רדיקלי (OH) נוצר מ2O2 הפחתה על ידי מעבר יונים מתכת (פה2 +, Cu+) מחמצן בסיסים dna, moiety סוכר dna ו חומצות שומן רב בלתי רווי ב דיפוזיה מבוקרת מחירים10. בקרב 80 מאופיין בנוקלאואוסים מחמצנים3, הנחקר ביותר הוא 8-אוקסו-7, 8-דיהידרוטסטוסטרון (8-oxogua) או 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxogua, איור 1), נגע כי הוא מסוגל לגרום ל-GT transversions ב תאים ממגלית10,11. הוא נוצר על ידי חמצון אלקטרונית מונו של גואנין, או על ידי רדיקלים הידרוקסיל או סינגרז התקפת חמצן של גואנין ב-DNA1. חומצות שומן רב בלתי רוויות הם מטרות חשובות אחרות של חמצון תגובתי מאוד, כגון •או, אשר ליזום את תהליך של השומנים peroxidation1,12. זה מעניק לחומצות שומן הידרופרתחמוצות שעלולות להתפרק לאלקטרופיפילית אלדדס ואפוקסידז, כגון malondialdehyde, 4-הידרוxy-2-nonenal, 2, 4-דאדיאנאל, 4, 5-אפוקסי-(2ה)-decenal, הקסאנאל, אקרונליין, קרוטונלדהיד, אשר הם מסוגל ליצור מוטאוציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציקציציציציציציציציציציציצילציקציקציציציציק האתאי adducts 1,N2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2-εdGuo, איור 1) ו-1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo, איור 1 ) הוצעו כסמנים פוטנציאליים ביוארגיולוגיה של הדלקת14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> איור 1. מבנים כימיים של נגעים DNA לכמת במחקר הנוכחי. . ד ר 2-דיאוקסיבוז דמות זו השתנתה מתוך אוליביירה ואח '.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מחקרים שבוצעו בתחילת שנות השמונים אפשרו זיהוי רגיש של 8-oxodGuo על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים לזיהוי אלקטרוכימי (כרומטוגרפיה-ECD). הכמת של 8-oxodguo על ידי כדיקות-ECD במספר מערכות ביולוגיות נתון התנאים אוקסיגון הובילו הכרה של 8-oxodguo כמו ביואריקר של oxidatively המושרה נזק DNA1,16. למרות שהוא חזק ומאפשר את הכמת של 8-oxodGuo בטווח הנמוך למול17, כרומטוגרפיה-מדידות ECD להסתמך על הדיוק של זמן השמירה של אנליטה לזיהוי וברזולוציה של כרומטוגרפיה כדי למנוע הפרעות של רכיבים אחרים לדוגמה. כפי שזיהוי אלקטרוכימי דורש שימוש במלח (למשל, אשלגן פוספט, סודיום אצטט) בשלב הנייד, התחזוקה של מצבים אנליטיים נאותים זקוקה לזמן שגרתי של טור וניקוי ציוד.
לחילופין, השימוש של ה-dna בקטריאלי תיקון אנזים מערכת ה-dna גליפסיקלז (fpg) ו, לאחר מכן, האדם 8-oxoguanine גליסיקלז 1 (hOGG1), לאיתור והסרה של 8-oxoגואה מ-dna, יצא כדרך האינדוקציה של dna אלקליות יציב משך אתרים. האתרים האלקליות מומרים למעברי השילוב של דנ א ומאפשרים לכמת את האופיקציה העקיפה הגבוהה ביותר של 8-oxoGua על ידי אלקטרופורזה ביחידה בודדת של ג'ל ("שביט שומר"). את הרגישות הגבוהה ואת ההישג של הניתוחים ללא צורך בחילוץ ה-DNA הסלולר הם היתרונות העיקריים של סוג זה של שיטת. זה נותן את הנמוך ביותר יציב המדינה רמות של 8-oxogua ב-DNA, בדרך כלל 7-10 פעמים נמוך יותר מאשר רמות המתקבלות על ידי שיטות יואנליטיים המבוסס על הבדיקות. עם זאת, היא מדידה עקיפה של 8-oxogua וכמה החסרונות הם חוסר ספציפיות או יעילות לא ידוע של אנזימים תיקון בשימוש1,16,18.
חיסוני הם מערכת אחרים של שיטות המשמשות לזיהוי של 8-האוקגואה1 ו-DNA האקסוציציציציציציציציציציציציצינו1, כגון 1,N6-דאדו ו -1,N2-dguo12. למרות הרגישות, קיצור של השימוש בנוגדנים לאיתור נגעים DNA הוא חוסר ספציפיות בשל פעילות צולבת לרכיבים אחרים של דגימות ביולוגיות, כולל DNA נורמלי בסיסים1,12. כולל דנ א האקסוציטוציציציאלי, לרבות 1,N6-דאדו ו-1,n2-dguo, ניתן גם לזהות ולכמת על ידי רגיש מאוד 32P-postlabeling בחני12. רגישות גבוהה של 32P-התיוג מאפשר את השימוש של כמויות קטנות מאוד של DNA (g., 10 μg) לאיתור של כ 1 קרוב לכל 1010 בסיסים נורמליים19. עם זאת, השימוש בחומרים כימיים, חוסר ספציפיות כימית ודיוק נמוך הם כמה חסרונות19,20.
מגבלה משותפת של השיטות המצוטטות לעיל היא הסלקטיביות הנמוכה או הספציפיות לאיתור המולקולות הרצויות. בתרחיש זה, מצמידים מערכות המדידה לאלקטרו-מגנון מסוג ספקטרומטר המסה (בדיקות-ESI-MS/MS ו-בדיקות-MS3) התפתחו כסטנדרט הזהב לכמת של נוקלאוטידים ששונו בתוך מטריצות ביולוגיות, כגון דנ א, שתן, פלזמה ורוק מיכל בן , מיכל בן 19 , 20. היתרונות של כרומטוגרפיה-ESI-ms/ms הם רגישות (בדרך כלל בטווח fmol נמוך) ואת הספציפיות שסופקו על ידי i) את ההפרדה כרומטוגרפי, ii) תבנית מאפיין וידוע של פיצול מולקולה בתוך המסה תא התנגשות ספקטרומטר, ו iii) את המדידה המדויקת של המסה שנבחרה לחייב את היחס (m/z) במצב ניטור תגובה מרובה1,19. השימוש בתקנים פנימיים המסומנים בisotopically מוסיף את היתרון של תיקונים להפסדים של מולקולה במהלך ההידרוליזה DNA ושלבי העשרת האנליט, כמו גם להבדלים בין הדגימות. זה גם מסייע בזיהוי של שיא כרומואטוגרפי הנכון כאשר יותר משיא אחד קיים1,12,19,20.
מספר שיטות המבוססות על בדיקות – ESI-ms/ms שימשו עבור כימות של 8-oxodguo, 1,N6-דאדו ו 1,n2-dguo ב-DNA מופק דגימות ביולוגיות שונות12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . חלקיקים עדינים (PM2.5) לשאת כימיקלים אורגניים ובלתי אורגניים, כגון פחמימנים ארומטיים רב-מחזורי (pahs), ניטרו-pahs, אלדיודס, ketones, חומצות קרבוקסיליות, quinolines, מתכות, ויונים מסיסים במים, אשר עשויים לגרום לדלקת ו לחץ חמצוני, התנאים שעדיף על התרחשות של נזק ביואואלי ומחלה30,31,32,33. אנו מציגים כאן אימות מאומת-ESI-שיטות ms/ms אשר הוחלו בהצלחה עבור כימות של 8-oxodguo, 1,N6-דאדו ו-1,N2-dguo בריאות, כבד וכליות DNA של עכברים/J להערכת ה ההשפעות של הסביבה PM2.5 חשיפה34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA adducts ו תחמוצת בסיסים DNA הם דוגמאות של נגעים DNA כי הם ביטויים שימושיים עבור הערכה רעילות של חומרים אלקטרופיפילית, ליצור electrophilic גיבים על ביומרה, או לגרום ללחץ חמצוני. בין הנוקלאואובסים המזיקים, הנחקר ביותר הוא 8-אוקסו -7, 8-דיהידרוטסטוסטרון (8-oxoGua) או 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-Oxogua), ביואריקר של oxidatively נזק בסיסי ב-DNA. אלדהאדס והאפוקסי כתוצאה מתהליך פרחמצון השומנים הם מולקולות אלקטרופיאליות המסוגלים ליצור מוטטוציציציציציציציציציציציציציציליציציליציציציציציציציציציציציציציציציציציציצילליציק1, כגון האדנו adducts,n2 εdGuo) ו-1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,N6-εdAdo), אשר הועלו כסמנים פוטנציאליים בתוך הפתופסיולוגיה של דלקת. שיטות סלקטיבית ורגיש עבור כימות ה-DNA שלהם הם הכרחי לפיתוח אסטרטגיות מניעה להאט את שיעורי המוטציה התא ופיתוח מחלות כרוניות (למשל, סרטן, מחלות ניווניות). בין השיטות הרגישות הזמינות עבור האיתור שלהם (כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מצמידים אלקטרוכימי או משולב גלאי המסה המוניים, שביט שיטה, חיסוני, 32P-postlabeling), סלקטיבי ביותר הם אלה המבוססים על ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לטנדם ספקטרומטר מסה (בדיקות-ESI/MS). סלקטיביות היא יתרון חיוני בעת ניתוח דגימות ביולוגיות מורכבות ו-בדיקות-ESI-MS/MS התפתחו כתקן זהב עבור כימות נוקלאוטידים שונה בתוך מטריצות ביולוגיות, כגון DNA, שתן, פלזמה ורוק. השימוש בתקנים פנימיים המסומנים בisotopically מוסיף את היתרון של תיקונים להפסדים של מולקולה במהלך ההידרוליזה DNA ושלבי העשרת האנליט, כמו גם להבדלים בין הדגימות. זה גם מסייע בזיהוי של שיא כרומטוגרפי נכון כאשר יותר מאשר שיא אחד קיים.
אנו מציגים כאן שיטות רגישות, מדויקות ומדויקות במיוחד-ESI-MS/MS אשר הוחלו בהצלחה עבור כימות 8-oxodGuo, 1,N6-דאדו ו-1,N2-dguo בריאות, כבד וכליות DNA של עכבר/J עבור הערכה של ההשפעות של הסביבה PM2.5 חשיפה.

ריכוזי ה-DNA הממוצעים (± SD) שהתקבלו מהכבד של עכברים (~ 1 גרם רקמה), ריאה (~ 0.2 g רקמות) וכליות (~ 0.4 g רקמות) היו, בהתאמה, 5,068 ± 2,615, 4,369 ± 1,021, ו 3,223 ± 723 μg/mL בנפח הסופי של 200 μL. כרומאטוגרמה ייצוגית המתקבלת על ידי בדיקות-אבא של ה-DNA מטוהרים מוצג באיור 3. הנוכחות של ארבעת 2 '-deoxyn...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

השיטות המוצגות כאן מאפשרות כימות נגעי DNA הנגרמים על ידי סטרס חמצוני, ותורמים להבנת מנגנונים פתופיזיולוגיים שעשויים להיות יעד למניעה וטיפול במחלות. סלקטיביות ורגישות הם היתרונות העיקריים. סלקטיביות היא יתרון חיוני בעת עבודה עם דגימות ביולוגיות מורכבות.HPLC יחד עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית התפתחו כתקן הזהב לסוג זה של כימות עם מטריסות ביולוגיות. סטרס חמצוני הוא אירוע נפוץ לתהליכים פתופיזיולוגיים שונים. רמות גבוהות של אדיאדוקט אתנו זוהו ברקמות או בשתן של חולים עם מחלות דלקתיות.נגעי הדנ"א מספקים גם מידע על אירועים אנדוגניים המופעלים על ידי חשיפה למזהמים. אם נגעי ה- DNA גדלים, החשיפה עשויה להיות ברמה המגדילה את הסיכון להתפתחות סרטן, למשל. הנגעים ניתן לכמת ב- DNA מכל מערכת הסלולר ולחילופין בשתן, פלזמה, מדיום תרבות רוק עם התאמות בהכנת מדגם.כדי להתחיל, להשתמש צלחת תרבות להציב על הקרח כבסיס לחתוך חתיכת רקמה עם אזמל. לשקול גרם אחד של הרקמה בכל צינור כתרים 50 מיליליטר לשימוש מיידי. שמור את הרקמה הנותרת על קרח יבש לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.לכל צינור, להוסיף 10 מיליליטר של פתרון תריס התא המסחרי המכיל 0.5 מילימולר deferoxamine, ולשמור על קרח. הגדר את הומוגניזר הרקמה למהירות נמוכה, סביב 60 עד 90 סל"ד. הומוגניזציה של הרקמות על הקרח במשך כמה דקות עד הפתרון הוא ללא שברי רקמות.לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של פתרון proteinase K לכל מדגם הומוגני. לנער את הצינורות על ידי היפוך, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר לילה. בבוקר, להוסיף 40 microliters של ריבונוקלאז פתרון, לנער על ידי היפוך, ולשמור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.הוסיפו חמישה מיליליטר של תוסף משקעים מסחריים לחלבון, מערבולת במרץ וצנטריפוגה במהירות של 2,000 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינורות מכוסים 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של isopropanol קר. היפוך הצינורות בעדינות מספר פעמים עד להתבוננות בדנ"א מזרז.השתמש פיפטה פסטר סגור בסוף כדי לאסוף את ה-DNA זירז. העבר את הדנ"א שנאסף לצינורות המכילים ארבעה מיליליטר של חיץ טריס 10 מילימולאר ודפרוקסאמין מילימולר אחד ב- pH שבע כדי להתמוסס. לאחר הדנ"א מומס לחלוטין בצינורות, להוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון כלורופורם המכיל 4% אלכוהול isoamyl לכל צינור.להפוך את הצינורות 10 פעמים עבור הומוגניזציה, צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות, ולהעביר את השלבים העליונים צינורות חדשים. חזור על שטיפה של השלב העליון עם פתרון כלורופורם פעמיים נוספות. לאחר מכן, להוסיף שמונה מיליליטר של אתנול מוחלט ו 0.4 מיליליטר של פתרון נתרן כלורי חמש טוחן כדי לזרז את ה-DNA.שוב, לאסוף את ה-DNA זירז, ולהעביר אותו לשלושה מיליליטר של 70% אתנול. חזור על הכביסה עם 70% אתנול עוד פעם אחת. להשליך את פתרון האתנול בזהירות, ולהפוך את הצינורות המכילים את ה-DNA זירז על נייר סופג כדי להסיר פתרון עודף.לאחר הכנת דגימות הידרוליזה DNA עם תקן isotopic 15N5 של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 15N5 תקן isotopic של 1, N2-אתנו-deoxyguanosine על פי כתב היד, להעביר 10 microliters של כל דגימה לתוך צינורות לכימות של deoxynucleosides נורמלי על ידי HPLC-UV. נושא נפח שיורית מיצוי בשלב מוצק. כדי לבצע HPLC, יש לסולק תחילה עמודת C18 המחוברת למחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של 0.1% עבור חומצה מתנול.הגדר את התוכנית שיפוע לרוץ מאפס ל 25 דקות עם אפס עד 18% מתנול, מ 25 עד 27 דקות עם 18 עד 0% מתנול, אז מ 27 עד 37 דקות עם 0% מתנול בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה ו 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להזריק נפח בין שניים לשישה microliters עבור כל מדגם שמורות לכמית deoxynucleosides נורמלי. הגדר את גלאי אבא ב 260 ננומטר לשילוב של פסגות deoxyguanosine ו deoxyadenosine.כדי לבצע מיצוי בשלב מוצק עבור ניתוחים של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, תחילה לטעון את המחסניות עם סדרה של פתרונות בנפח של מיליליטר אחד. הוסיפו 100% מתנול, מים שעברו דה-מיונז, דגימת דנ"א שעבר הידרוליז, מים שעברו דה-מיונז, 10% מתנול, 15% מתנול, ולאחרונה 100% מתנול לאיסוף. לאחר מכן, המשך בהתאם לכתב היד.לאחר הכנת דגימות הידרוליזה DNA 15N5 תקן isotopic של 8-oxo-deoxyguanosine, להעביר 80 microliters של כל מדגם לתוך בקבוקונים לניתוח במערכת HPLC-ESI-MS/MS. שמור את 20 המיקרוליטרים הנותרים לכימות של deoxyguanosine ב- HPLC-UV, כפי שנעשה בעבר. לניתוח של 8-oxo-deoxyguanosine על HPLC-ESI-MS/MS, ללטף את עמודת C18 A יחד עם מחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של ממס A ו- B בקצב זרימה של 150 microliters לדקה ו 25 מעלות צלזיוס.הפעל את המשאבה הבינארית עם אפס עד 15% של ממס B במהלך 25 הדקות הראשונות, 15 עד 80% של ממס B מ 25 עד 28 דקות, 80% של ממס B מ 28 עד 31 דקות, 80 עד 0% של ממס B מ 31 עד 33 דקות, ו 0% של ממס B מ 33 עד 46 דקות. כוון את 16 הדקות הראשונות של עמוד A אלבנט לבזבוז. טור מצב B על ידי משאבה isocratic עם פתרון של 15% מתנול במים המכילים 0.1% חומצה פורמית בקצב זרימה של 150 microliters לדקה.לאחר שש דקות, לבדוק את הכרומטוגרמה כדי להבטיח את 8-oxo-deoxyguanosine תקן elutes מעמודה A.במהלך מרווח 16-32 דקות, לעבור את השסתום למצב המאפשר חיבור בין עמודה A ועמודה B.סגור את השסתום ב 32 דקות כדי לחמק 8-oxo-deoxyguanosine מהעמודה השנייה ולקבל שיא כרומטוגרפי חד. לניתוח של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, elute עמוד C18 יחד עם מחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של ממס A ו- B בקצב זרימה של 130 microliters לדקה ו 25 מעלות צלזיוס. הפעל את המשאבה הבינארית עם 0% ממס B במשך 10 הדקות הראשונות, אפס עד 20% מהממס B למשך 10 עד 39 דקות, 20 עד 75% מהממס B מ-39 עד 41 דקות, 75% מהממס ב' מ-41 עד 46 דקות, 75 עד 0% מהממס ב' מ-46 עד 47 דקות ו-0% ממס ב' מ-47 עד 60 דקות.השתמש שסתום מיתוג כדי לכוון את 35 הדקות הראשונות של eluent לפסולת ואת שבר 35 עד 42 דקות למקור ESI. ודא שתקני המודעות חמקו מהעמודה במרווח הזמן שנקבע. לשלב את הפסגות של 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 תקן isotopic של 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, 15N5 תקן isotopic של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, ו 15N5 תקן isotopic של 1, N2-אתנו-deoxyguanosine מ HPLC-ESI-MS/ MSSחשב את יחסי השטח עבור עקומות הכיול והדגימות. להקים את עקומות הכיול, ולחשב את כמויות הנגעים בכל מדגם מוזרק. שלב את הפסגות של deoxyguanosine ו deoxyadenosine מניתוח HPLC-UV.השתמש באזורים כדי להקים את עקומות הכיול, ולחשב את כמויות deoxyguanosine ו deoxyadenosine בבעלי חיים בכל מדגם מוזרק. לחשב את שברי טוחנות עבור 8-oxo-deoxyguanosine מעל deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine מעל deoxyadenosine, ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine מעל deoxyguanosine, אשר נותנים את מספר נגעים לכל מיליון deoxyguanosine נורמלי או deyaoxdenosine. כרומטוגרמה מייצגת של הדנ"א המטוהר המתקבל על ידי HPLC-UV מראה את נוכחותם של ארבעת deoxynucleosides נורמלי, ללא ריבונוקלוזידים RNA, המדגים את טוהר ה- DNA.כרומטוגרמות מייצגות מ- HPLC-ESI-MS/MS של 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine בדגימות DNA רקמת עכברים מוצגים. הכרומטוגרמה המתקבלת עם זיהוי UV מראה את ארבעת deoxynucleosides נורמלי eluting מהטור הראשון עד כ 10 דקות, עם הפרדה טובה מ 8-oxo-deoxyguanosine, ביטול הפרעות לא רצויות. דבר חשוב לזכור עבור כימות מדויק הוא תמיד את אותן כמויות של סטנדרטים פנימיים בנפח ההזרקה עקומות כיול ודגימות.השיטות המוצגות כאן עשויות להיות מותאמות לכמות של deoxynucleosides שונה אחרים. הרחבת הרצועה של deoxynucleosides שונה מאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים. אנו יכולים לחקור את תפקידו של נזק חמצוני במצבים שונים כגון חשיפה לשנאת קסנוביוטיקה, סוכרת וטרנספורמציה ממאירית של התא, ולכן לסייע בפיתוח אסטרטגיות מניעה וטיפול.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

באמצעות ניתוח פילוגנטי לחקור האיקריוטים מקור גנטי

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

העשרה של Lipoproteins חיידקי והכנה של N-מסוף Lipopeptides לקביעת מבנה באמצעות ספקטרומטר מסה

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...