Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 e 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 e 429184/2016-6), Mantes, PRPUSP (PRÓ-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), into INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), Redoxoma INCT (FAPESP/CNPq/Mantes; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma di NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) e CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira e A. A. F. Oliveira hanno ricevuto borse di studio da FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) e CAPES (coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di mascio, P. H. N. Saldiva e A. P. M. Loureiro hanno ricevuto borse di stato da CNPq.
Alcune figure e tavole presenti in questo lavoro sono state originariamente pubblicate in Oliveira A.A.F. et al. effetti genotossici ed epigenotossici nei topi esposti a particolato fine ambiente concentrato (PM2,5) da San Paolo, Brasile. Tossicologia delle particelle e delle fibre. 15, 40 (2018).

Quattro settimana vecchio maschio A/J topi, patogeno specifico libero, sono stati ottenuti dal centro di allevamento di animali da laboratorio di Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasile, e sono stati trattati di conseguenza al comitato etico della facoltà di medicina, Università di San Paolo (protocollo no 1310/09).
1. raccolta dei tessuti dei topi
<ol><li>Anestetizzare l'animale con xylazina e chetamina. Per un topo con 30 g di peso corporeo, iniettare una so...

Un problema importante riscontrato nelle analisi 8-oxodGuo da HPLC Metodi è la possibile induzione della sua formazione durante le procedure di esame di estrazione del DNA, idrolisi del DNA, e la concentrazione di DNA idrolizzati22,38. Al fine di minimizzare il problema della formazione di 8-oxodGuo smontava, si raccomanda l'aggiunta di deferossamina a tutte le soluzioni di estrazione, stoccaggio e idrolisi del DNA, l'uso del metodo chaotropico ioduro di sodio e...

Alcune specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono in grado di ossidare doppi legami di carbonio di basi di DNA e alcuni carboni nella frazione desossribosio, generando basi ossidate e rottura del filamento del DNA1. Come una molecola carica negativamente ricca di atomi di azoto e ossigeno, il DNA è anche un bersaglio per i gruppi elettrofilici che covalentemente reagiscono con i siti nucleofili (azoto e ossigeno), dando prodotti che sono chiamati addotti del DNA2. Quindi, gli addotti del DNA e le basi del DNA ossidato sono esempi di lesioni del DNA che sono biomarcatori utili per la valutazione della tossicità di sostanze che sono elettrofiliche, generano elettrofili reattivi sulla biotrasformazione, o inducono lo stress ossidativo1, 2. il Anche se le basi di DNA modificate possono essere rimosse dal DNA per riparazione di escissione di base o nucleotide (BER o NER), l'induzione di uno squilibrio tra la generazione e la rimozione delle lesioni del DNA a favore della prima porta ad un aumento netto dei loro livelli nel lavoro straordinario del DNA3 < /C5 >. I risultati sono l'aumento dei tassi di mutazione del DNA, la riduzione dell'espressione genica e la diminuita attività proteica2,4,5,6,7, effetti che sono strettamente correlati alla sviluppo di malattie. Le mutazioni del DNA possono influenzare diverse funzioni cellulari, come la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare, l'integrità del genoma, la stabilità dei telomeri, l'epigenoma, la struttura della cromatina, lo splicing dell'RNA, l'omeostasi proteica, il metabolismo, l'apoptosi e la differenziazione cellulare8 ,9. Le strategie per rallentare i tassi di mutazione cellulare e lo sviluppo di malattie croniche (ad esempio, cancro, malattie neurodegenerative) passano attraverso la conoscenza delle fonti di mutazione, tra cui le lesioni del DNA e le loro cause.
ROS ha generato in eccesso in modo endogeno, a causa di esposizione di inquinanti, infiammazione persistente, patofisiologia della malattia (ad esempio, diabete), ecc., sono cause importanti di danni biomolecola, tra cui il danno del DNA e del lipido1. Ad esempio, il radicale idrossile altamente reattivo (OH) formato da H2O2 riduzione degli ioni metallici di transizione (Fe2 +, cu+) ossida le basi del DNA, la porzione di zucchero del DNA e gli acidi grassi polinsaturi a diffusione controllata tassi di cambio10. Tra i 80 già caratterizzati nucleobasi ossidate3, l'uno più studiato è 8-oxo-7, 8-diidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo, Figura 1), una lesione che è in grado di indurre le trasversioni gt in cellule di mammifero10,11. È formata dall'ossidazione mono-elettronica della guanina, o da un attacco di ossigeno radicale idrossile o singollet di guanina nel DNA1. Gli acidi grassi polinsaturi sono altri importanti bersagli di ossidanti altamente reattivi, quali •Oh, che avviano il processo di perossidazione lipidica1,12. Dà origine a idroperossidi di acidi grassi che possono decomporre a aldeidi elettrofiliche ed epoxyaldeidi, come malondialdeide, 4-idrossi-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epossidico-(2E)-decenale, hexenal, Acrolein, crotonaldeide, che sono in grado di formare addotti mutageni del DNA esociclico, come malondialdeide-, propano-, o addotti di addotti1,12,13. L'addotti addotti 1,n2-addotti-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo, Figura 1) e 1,n6-addotti-2'-deossiadenosina (1,n6-εdado, Figura 1 ) sono stati suggeriti come potenziali biomarcatori nella patofisiologia dell'infiammazione14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Figura 1. Strutture chimiche delle lesioni del DNA quantificate nel presente studio. dR = 2 ́-desossribosio. Questa cifra è stata modificata da Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
Gli studi condotti nei primi anni ottanta hanno permesso la rilevazione sensibile di 8-oxodGuo mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata al rilevamento elettrochimico (HPLC-ECD). Quantificazione di 8-oxodGuo da HPLC-ECD in diversi sistemi biologici sottoposti a condizioni ossidanti ha portato al riconoscimento di 8-oxodGuo come un biomarcatore di danno base ossidativamente indotto in DNA1,16. Sebbene robusto e che consenta la quantificazione di 8-oxodGuo nella gamma bassa fmol17, le misurazioni HPLC-ECD si basano sull'accuratezza del tempo di ritenzione dell'analita per l'identificazione dell'analita e sulla risoluzione della cromatografia per evitare interferenze di altri costituenti campione. Poiché la rilevazione elettrochimica richiede l'uso di sale (ad esempio fosfato di potassio, acetato di sodio) nella fase mobile, il mantenimento di condizioni analitiche adeguate necessita di routine di pulizia delle colonne e delle attrezzature.
In alternativa, l'uso dell'enzima di riparazione del DNA batterico formamidopirimidina DNA glicosilasi (FPG) e, successivamente, umana 8-oxoguanina glicosilasi 1 (hOGG1), per il rilevamento e la rimozione di 8-oxoGua dal DNA, è emerso come un modo per l'induzione del DNA alcalino labile Siti. I siti alcalini labili vengono convertiti in rotture del filamento del DNA e consentono la quantificazione indiretta molto elevata sensibile di 8-oxoGua mediante elettroforesi di gel monocellulare alcalina ("saggio Comet"). L'alta sensibilità e la realizzazione delle analisi senza la necessità di estrazione del DNA cellulare sono i principali vantaggi di questo tipo di saggio. Fornisce i livelli più bassi di stato stazionario di 8-oxoGua nel DNA, tipicamente 7-10 volte inferiori ai livelli ottenuti dai metodi bioanalitici basati su HPLC. Tuttavia, è una misura indiretta di 8-oxogua e alcuni inconvenienti sono la mancanza di specificità o l'efficienza sconosciuta degli enzimi di riparazione utilizzati1,16,18.
Gli immunodosaggi sono altri metodi utilizzati per la rilevazione di addotti di 8-oxoGua1 e di DNA esociclico, come 1,n6-dAdo e 1,n2-dGuo12. Nonostante la sensibilità, una carenza dell'uso di anticorpi per il rilevamento delle lesioni del DNA è la mancanza di specificità a causa della reattività incrociata ad altri componenti di campioni biologici, comprese le normali basi di DNA1,12. Gli addotti del DNA exociclico, compresi 1, n6-dado e 1, n2-dGuo, possono essere rilevati e quantificati da 32P-saggi di postetichettatura12. L'elevata sensibilità di 32P-postetichettatura consente l'uso di piccolissime quantità di DNA (ad es. 10 μg) per il rilevamento di circa 1 addotto per 1010 basi normali19. Tuttavia, l'uso di radio-chimiche, mancanza di specificità chimica e bassa precisione sono alcuni svantaggi19,20.
Una limitazione condivisa dei metodi citati sopra è la bassa selettività o specificità per la rilevazione delle molecole desiderate. In questo scenario, l'HPLC accoppiato alla spettrometria di massa tandem a ionizzazione elettrospray (HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-MS3) si è evoluto come lo standard Gold per la quantificazione dei nucleosidi modificati nelle matrici biologiche, come il DNA, l'urina, il plasma e la saliva 1 il , 19 anni di , 20. i vantaggi dei metodi HPLC-ESI-MS/MS sono la sensibilità (tipicamente nella gamma bassa fmol) e l'elevata specificità fornita da i) la separazione cromatografica, II) il modello caratteristico e noto della frammentazione molecolare all'interno della massa Camera di collisione dello spettrometro, e III) la misurazione accurata del rapporto massa/carica selezionato (m/z) in modalità di monitoraggio a reazione multipla1,19. L'uso di standard interni con etichetta isotopica aggiunge il vantaggio delle correzioni per le perdite di molecola durante le fasi di arricchimento dell'idrolisi e dell'analita del DNA, nonché per le differenze di ionizzazione dell'analita tra i campioni. Aiuta anche a identificare il picco cromatografico corretto quando più di un picco è presente1,12,19,20.
Diversi metodi basati su HPLC-ESI-MS/MS sono stati utilizzati per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo e 1,n2-dGuo nel DNA Estratto da diversi campioni biologici12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Le particelle sottili (PM2,5) trasportano sostanze chimiche organiche e inorganiche, quali idrocarburi policiclici aromatici (IPA), Nitro-IPA, aldeidi, chetoni, acidi carbossilici, chinolini, metalli e ioni solubili in acqua, che possono indurre infiammazione e stress ossidativo, condizioni che favoriscono il verificarsi di biomolecola danni e malattia30,31,32,33. Qui presentiamo i metodi HPLC-ESI-MS/MS convalidati che sono stati applicati con successo per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,n6-dado e 1,n2-dGuo in polmone, fegato e DNA renale di un/J topi per la valutazione del effetti dell'esposizione ambientale PM 2,534.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

Gli addotti del DNA e le basi di DNA ossidato sono esempi di lesioni del DNA che sono biomarcatori utili per la valutazione della tossicità di sostanze che sono elettrofiliche, generano elettrofili reattivi sulla biotrasformazione o inducono lo stress ossidativo. Tra i nucleobasi ossidati, il più studiato è 8-oxo-7, 8-diidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), un biomarcatore di danno di base ossidativamente indotto nel DNA. Aldeidi ed epoxyaldeidi risultanti dal processo di perossidazione lipidica sono molecole elettrofiliche in grado di formare addotti mutageni del DNA esociclico, come gli addotti addotti 1,n2-addotti-2'-deoxyguanosina (1,n2- εdGuo) e 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-εdado), che sono stati suggeriti come potenziali biomarcatori nella fisiopatologia dell'infiammazione. Metodi selettivi e sensibili per la loro quantificazione nel DNA sono necessari per lo sviluppo di strategie preventive per rallentare i tassi di mutazione cellulare e lo sviluppo di malattie croniche (ad esempio, cancro, malattie neurodegenerative). Tra i metodi sensibili disponibili per la loro rilevazione (cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata ai rivelatori di spettrometria di massa elettrochimica o tandem, test Comet, immunodosaggi, 32P-postetichettatura), le più selettive sono quelle basate su cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-ESI-MS/MS). La selettività è un vantaggio essenziale nell'analisi di campioni biologici complessi e l'HPLC-ESI-MS/MS si è evoluto come lo standard Gold per la quantificazione dei nucleosidi modificati nelle matrici biologiche, come il DNA, l'urina, il plasma e la saliva. L'uso di standard interni con etichetta isotopica aggiunge il vantaggio delle correzioni per le perdite di molecola durante le fasi di arricchimento dell'idrolisi e dell'analita del DNA, nonché per le differenze di ionizzazione dell'analita tra i campioni. Aiuta anche a identificare il picco cromatografico corretto quando è presente più di un picco.
Qui vi presentiamo i metodi HPLC-ESI-MS/MS, sensibili, accurati e precisi, che sono stati applicati con successo per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,n6-dado e 1,n2-DGUO nel polmone, nel fegato e nel DNA dei reni dei topi a/J per valutazione degli effetti dell'esposizione ambientale PM2,5 .

Le concentrazioni medie di DNA (± DS) ottenute da topi epatici (~ 1 g di tessuto), polmone (~ 0,2 g di tessuto) e rene (~ 0,4 g di tessuto) erano, rispettivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, e 3.223 ± 723 μg/mL nel volume finale di 200 μL. Un cromatogramma rappresentativo ottenuto da HPLC-DAD del DNA purificato è mostrato in Figura 3. La presenza dei quattro 2'-deossinucleosidi, esenti dai ribonucleosidi dell'RNA, che eluto immediatamente prima dei ...

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Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

Descriviamo qui metodi per la quantificazione sensibile e accurata delle lesioni 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2a '-deossiguanosina (1,N2-DGUO) nel DNA. I metodi sono stati applicati alla valutazione degli effetti del particolato fine ambientale (PM2,5) nei tessuti (polmone, fegato e rene) dei topi a/J esposti.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

I metodi qui presentati consentono la quantificazione delle lesioni del DNA indotte dallo stress ossidativo, contribuendo alla comprensione dei meccanismi fisiopatologici che possono essere bersaglio della prevenzione e del trattamento delle malattie. Selettività e sensibilità sono i principali vantaggi. La selettività è un vantaggio essenziale quando si lavora con campioni biologici complessi.L'HPLC accoppiato alla spettrometria di massa tandem si è evoluto come gold standard per questo tipo di quantificazione con matrici biologiche. Lo stress ossidativo è un evento comune a diversi processi fisiopatologici. Sono stati rilevati livelli aumentati di addotti di eteno nei tessuti o nelle urine di pazienti con malattie infiammatorie.Le lesioni del DNA forniscono anche informazioni su eventi endogeni innescati dall'esposizione agli inquinanti. Se le lesioni del DNA aumentano, l'esposizione può essere al livello che aumenta il rischio di sviluppo del cancro, ad esempio. Le lesioni possono essere quantificate nel DNA da qualsiasi sistema cellulare e in alternativa nelle urine, plasma, mezzo di coltura della saliva con adattamenti nella preparazione del campione.Per iniziare, usa una piastra di coltura posta sul ghiaccio come base per tagliare un pezzo di tessuto con un bisturi. Pesare un grammo del tessuto in ogni tubo chiuso da 50 millilitri per un uso immediato. Conservare il tessuto rimanente sul ghiaccio secco prima di conservarlo a meno 80 gradi Celsius.Ad ogni tubo, aggiungere 10 millilitri della soluzione di lisi cellulare commerciale contenente 0,5-millimolare deferoxamina e tenere sul ghiaccio. Impostare l'omogeneizzatore tissutale a bassa velocità, intorno ai 60-90 giri/min. Omogeneizzare i tessuti sul ghiaccio per alcuni minuti fino a quando la soluzione non è priva di frammenti di tessuto.Quindi, aggiungere 150 microlitri di soluzione di proteinasi K ad ogni campione omogeneizzato. Agitare i tubi per inversione e tenerli a temperatura ambiente durante la notte. Al mattino, aggiungere 40 microlitri di ribonucleasi Una soluzione, agitare per inversione e mantenere i tubi a temperatura ambiente per due ore.Aggiungere cinque millilitri di soluzione commerciale di precipitazione proteica, vortice vigorosamente e centrifuga a 2.000 volte g, quattro gradi Celsius, per 10 minuti. Trasferire i supernaganti in tubi con limitato da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di isopropanolo freddo. Invertire delicatamente i tubi più volte fino all'osservazione del DNA precipitato.Usa una pipetta Pasteur chiusa alla fine per raccogliere il DNA precipitato. Trasferire il DNA raccolto in tubi contenenti quattro millilitri di tampone Tris da 10 millimolare e deferoxamina millimolare a pH sette da sciogliere. Dopo che il DNA è stato completamente sciolto nei tubi, aggiungere quattro millilitri di una soluzione cloroformio contenente il 4% di alcol isoammil a ciascun tubo.Invertire i tubi 10 volte per l'omogeneizzazione, centrifugare a 2.000 volte g, quattro gradi Celsius, per 10 minuti, e trasferire le fasi superiori a nuovi tubi. Ripetere il lavaggio della fase superiore con la soluzione cloroformio altre due volte. Quindi, aggiungere otto millilitri di etanolo assoluto e 0,4 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio a cinque molari per far precipitare il DNA.Ancora una volta, raccogliere il DNA precipitato e trasferirlo in tre millilitri di 70% di etanolo. Ripetere il lavaggio con il 70% di etanolo ancora una volta. Scartare la soluzione di etanolo con cautela e invertire i tubi contenenti il DNA precipitato su carta assorbente per rimuovere la soluzione in eccesso.Dopo aver preparato campioni di idrolisi del DNA con standard isotopico 15N5 di 1, N6-eteno-deossiadenosina e standard isotopico 15N5 di 1, N2-eteno-deossiguanosina secondo il manoscritto, trasferire 10 microlitri di ciascun campione in tubi per la quantificazione dei normali deossinucleosides da HPLC-UV. Sottosezione del volume residuo all'estrazione in fase solida. Per eseguire HPLC, elute prima una colonna C18 collegata a una cartuccia C18 SecurityGuard con una pendenza dello 0,1% di acido formico e metanolo.Impostare il programma di gradiente da zero a 25 minuti con zero al 18%metanolo, da 25 a 27 minuti con 18-0%metanolo, quindi da 27 a 37 minuti con 0%metanolo a una portata di un millilitro al minuto e 30 gradi Celsius. Successivamente, iniettare un volume compreso tra due e sei microlitri per ciascun campione riservato alla quantificazione normale dei deossinucleosides. Impostare il rivelatore DAD a 260 nanometri per l'integrazione dei picchi di deossiguanosina e deossiadenosina.Per eseguire l'estrazione in fase solida per analisi di 1, N6-eteno-deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina, caricare prima le cartucce con una serie di soluzioni ad un volume di un millilitro. Aggiungere 100% metanolo, acqua deionizzata, campione di DNA idrolizzato, acqua deionizzata, 10%metanolo, 15% metanolo e infine 100%metanolo per la raccolta. Quindi, procedere secondo il manoscritto.Dopo aver preparato campioni di idrolisi del DNA 15N5 standard isotopico di 8-osso-deossiguanosina, trasferire 80 microlitri di ciascun campione in fiale per l'analisi nel sistema HPLC-ESI-MS/MS. Riservare i restanti 20 microlitri per la quantificazione della deossiguanosina su HPLC-UV, come fatto in precedenza. Per l'analisi dell'8-osso-deossiguanosina su HPLC-ESI-MS/MS, elutare la colonna C18 A accoppiata a una cartuccia SecurityGuard C18 con un gradiente di solvente A e B ad una portata di 150 microlitri al minuto e 25 gradi Celsius.Eseguire la pompa binaria con zero-15% del solvente B durante i primi 25 minuti, dal 15 all'80% del solvente B da 25 a 28 minuti, dall'80% del solvente B da 28 a 31 minuti, dall'80 allo 0% del solvente B da 31 a 33 minuti e dallo 0% del solvente B da 33 a 46 minuti. Dirigere i primi 16 minuti della colonna A eluente allo spreco. Condizione colonna B dalla pompa isocratica con una soluzione di 15%metanolo in acqua contenente lo 0,1% di acido formico ad una portata di 150 microlitri al minuto.Dopo sei minuti, controllare il cromatogramma per assicurarsi che la norma 8-osso-deossiguanosina eluisca dalla colonna A.Durante l'intervallo da 16 a 32 minuti, passare la valvola nella posizione che consente il collegamento tra la colonna A e la colonna B.Chiudere la valvola a 32 minuti per eludere l'8-osso-deossiguanosina dalla seconda colonna e ottenere un forte picco cromatografico. Per l'analisi di 1, N6-eteno-deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina, elutare una colonna C18 accoppiata a una cartuccia C18 SecurityGuard con un gradiente di solvente A e B ad una portata di 130 microlitri al minuto e 25 gradi Celsius. Eseguire la pompa binaria con lo 0% del solvente B per i primi 10 minuti, da zero al 20% del solvente B per 10-39 minuti, dal 20 al 75% del solvente B da 39 a 41 minuti, 75% del solvente B da 41 a 46 minuti, dal 75 allo 0% del solvente B da 46 a 47 minuti e 0% del solvente B da 47 a 60 minuti.Utilizzare la valvola di commutazione per dirigere i primi 35 minuti di eluente agli sprechi e la frazione da 35 a 42 minuti alla fonte ESI. Assicurarsi che gli standard dell'addotto elute dalla colonna nell'intervallo impostato. Integrare i picchi dello standard isotopico 8-osso-deossiguanosina 15N5 di 8-osso-deossiguanosina, 1, N6-eteno-deossiadenosina, standard isotopico 15N5 di 1, N6-eteno-deossiadenosina, 1, N2-eteno-deossiguanosina e standard isotopico 15N5 di 1, N2-etheno-deossiguanosina dalle analisi HPLC-ESI-MS/MS.Calcolare i rapporti di area per le curve di calibrazione e i campioni. Stabilire le curve di calibrazione e calcolare le quantità di lesioni in ogni campione iniettato. Integrare i picchi di deossiguanosina e deossiadenosina dalle analisi HPLC-UV.Utilizzare le aree per stabilire le curve di taratura e calcolare le quantità di deossiguanosina e deossiadenosina negli animali in ogni campione iniettato. Calcolare le frazioni molare per 8-osso-deossiguanosina sulla deossiguanosina, 1, N6-eteno-deossiadenosina sulla deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina sulla deossiguanosina, che danno il numero di lesioni per un milione di deossiguanosina normale o deossiadenosina. Un cromatogramma rappresentativo del DNA purificato ottenuto dall'HPLC-UV mostra la presenza dei quattro normali deossinucleosides, liberi dai ribonucleosides dell'RNA, dimostrando la purezza del DNA.Sono mostrati cromatogrammi rappresentativi dell'HPLC-ESI-MS/MS di 8-osso-deossiguanosina, 1, N6-eteno-deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina nei campioni di DNA dei tessuti topi. Il cromatogramma ottenuto con il rilevamento UV mostra i quattro normali deossinucleosides che eluivano dalla prima colonna fino a circa 10 minuti, con una buona separazione dall'8-osso-deossiguanosina, eliminando le interferenze indesiderate. Una cosa importante da ricordare per la quantificazione esatta è avere sempre le stesse quantità di standard interni nel volume di iniezione nelle curve di calibrazione e nei campioni.I metodi qui presentati possono essere adattati per la quantificazione di altri deossinucleosides modificati. L'espansione della banda di deossinucleosides modificati consente una migliore comprensione dei meccanismi fisiopatologici sottostanti. Possiamo indagare il ruolo del danno ossidativo in diverse situazioni come l'esposizione a xenobiotici, diabete e trasformazione maligna cellulare, favorendo così lo sviluppo di strategie preventive e terapeutiche.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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