Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Pros. 2012/22190-3 og 2012/08616-8), CNPq (Pros. 454214/2014-6 og 429184/2016-6), KAPPER, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/KAPPER/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Pros. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/KAPPER; Pros. 573530/2008-4), NAP-Redoxoma (PRPUSP; Pros. 2011.1.9352.1.8) og CEPID Redoxoma (FAPESP; 2013/07937-8). T. F. Oliveira og A. F. Oliveira mottatt stipend fra FAPESP (Pros. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) og KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva, og A. P. M. Loureiro mottatt stipend fra CNPq.
Noen figurer og tabeller til stede i dette arbeidet ble opprinnelig publisert i Oliveira A.A.F. et al. gentoksisk og epigenotoxic effekter hos mus eksponert for konsentrerte partikler med svevestøv (PM2,5) fra São Paulo City i Brasil. Partikkel og fiber toksikologiske. 15, 40 (2018).

Fire ukers gamle mannlige A/J mus, spesifikke patogen gratis, ble innhentet fra avl Center of Laboratory dyr av Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, og ble behandlet i henhold til etikk Committee of The Faculty of Medicine, Universitetet São Paulo (protokoll no 1310/09).
1. innsamling av mus vev
<ol><li>Bedøve dyret med xylazine og ketamin. Hvis du har en mus med 30 g kroppsvekt, injiserer du en løsning (ikke mer enn 2 mL) som inneholder 2,63 mg ketamin og...

Et stort problem funnet i 8-oxodGuo analyser av HPLC metoder er mulig induksjon av dannelsen under workup prosedyrene for DNA-ekstraksjon, DNA hydrolyse, og konsentrasjonen av DNA hydrolysater22,38. For å minimere problemet med 8-oxodGuo artifactual formasjon, anbefales det tilsetning av deferoxamine til alle DNA-ekstraksjon, lagring og hydrolyse løsninger, bruk av natrium iodide chaotropic metode og unngåelse av fenol i DNA-ekstraksjon, som samt bruk av DNA-b...

Noen reaktive oksygen arter (ROS) er i stand til å oksidere karbon doble bånd av DNA baser og noen karbonatomer i deoxyribose moiety, genererer oksidert baser og DNA strand pauser1. Som et negativt ladet molekyl rik på nitrogen og oksygen atomer, er DNA også et mål for Elektrofil grupper som covalently reagerer med nukleofil nettsteder (nitrogen og oksygen), noe som gir produkter som kalles DNA addukter2. Så, DNA addukter og oksidert DNA baser er eksempler på DNA lesjoner som er nyttige biomarkører for toksisitet vurdering av stoffer som er Elektrofil, generere reaktive elektrofiler ved biotransformasjon, eller indusere oksidativt stress1, 2i det. Selv om de modifiserte DNA baser kan fjernes fra DNA ved basen eller nukleotid forbrukeravgift reparasjon (BER eller NER), induksjon av en ubalanse mellom generering og fjerning av DNA lesjoner i favør av den tidligere fører til en netto økning på sine nivåer i DNA over tid3 < /c5>. Resultatene er økningen av DNA mutasjon priser, redusert genuttrykk, og redusert protein aktivitet2,4, 5,6,7, effekter som er nært knyttet til utvikling av sykdommer. DNA mutasjoner kan påvirke ulike cellulære funksjoner, slik som celle signalering, celle syklus, Genova integritet, telomere stabilitet, epigenome, kromatin struktur, RNA skjøting, protein homeostase, metabolisme, apoptose, og celle differensiering8 ,9. Strategier for å forsinke celle mutasjon priser og kronisk sykdom utvikling (f. eks, kreft, nevrodegenerative sykdommer) passere gjennom kunnskap om mutasjon kilder, blant dem, DNA lesjoner og deres årsaker.
ROS generert endogenously i overkant, på grunn av forurensende eksponering, vedvarende betennelse, sykdom patofysiologi (f. eks, diabetes), etc., er viktige årsaker til biomolekyler Kader, inkludert DNA og lipid skade1. Som et eksempel, den svært reaktive hydroksyl radikale (OH) dannet fra H2O2 reduksjon av overgangen metall ioner (Fe2 +, Cu+) oksiderer DNA baser, DNA sukker moiety og flerumettede fettsyrer ved diffusjon-kontrollerte priser10. Blant 80 allerede karakterisert oksidert nucleobases3, den mest studerte en er 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) eller 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-OxodGuo, figur 1), en lesjon som er i stand til å indusere gt transversions i pattedyrceller10,11. Det er dannet av mono elektronisk oksidasjon av Guanin, eller ved hydroksyl radikale eller singlet oksygen angrep av Guanin i DNA1. Flerumettede fettsyrer er andre viktige mål for svært reaktive oksidanter, for eksempel •Oh, som starter prosessen med lipid peroxidation1,12. Det gir opphav til fatty acid hydroperoxides som kan brytes ned til Elektrofil aldehyder og epoxyaldehydes, som malondialdehyde, 4-AHA-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4, 5-epoxy-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyde, som er stand til å danne mutagent exocyclic DNA addukter, slik som malondialdehyde-, propano-, eller etheno addukter1,12,13. Den etheno addukter 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2-ΕdGuo, figur 1) og 1,n6-etheno-2'-deoksyadenosinregionen (1,n6-εdAdo, figur 1 ) har blitt foreslått som potensielle biomarkører i patofysiologi av betennelse14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Figur 1. Kjemiske strukturer av DNA lesjoner kvantifisert i denne studien. dR = 2 ́-deoxyribose. Dette tallet er modifisert fra Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Studier utført tidlig på 1980-tallet tillot sensitiv påvisning av 8-oxodGuo av høy ytelse flytende kromatografi koplet til elektrokjemiske deteksjon (HPLC-ECD). Kvantifisering av 8-oxodGuo av HPLC-ECD i flere biologiske systemer utsatt for oksiderende forhold førte til anerkjennelse av 8-oxodGuo som en biomarkør av oxidatively indusert base skade i DNA1,16. Selv om den er robust og tillater kvantifisering av 8-oxodGuo i det lave fmol området17, er HPLC-ECD-målinger avhengig av nøyaktigheten av analytt oppbevaringstid for analytt identifisering og kromatografi oppløsning for å unngå forstyrrelser i andre utvalgs bestanddeler. Som elektrokjemiske deteksjon krever bruk av salt (f. eks, kalium fosfat, natrium acetate) i den mobile fasen, vedlikehold av tilstrekkelig analytiske forhold behov rutine kolonne og utstyr rengjøring tid.
Alternativt, bruk av bakteriell DNA reparasjon enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) og, etterpå, menneskelige 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), for påvisning og fjerning av 8-oxoGua fra DNA, dukket opp som en måte for induksjon av DNA alkali labilt Nettsteder. Den alkali labilt nettsteder er konvertert til DNA strand pauser og la svært høysensitiv indirekte kvantifisering av 8-oxoGua av alkalisk enkelt celle gel elektroforese ("komet analysen"). Den høye følsomheten og gjennomføringen av analysene uten behov for mobilnettet DNA utvinning er de viktigste fordelene med denne typen analysen. Det gir lavest steady-state nivåer av 8-oxoGua i DNA, typisk 7-10 ganger lavere enn nivåene innhentet av bioanalytical metoder basert på HPLC. Men det er en indirekte måling av 8-oxoGua og noen ulemper er mangelen på spesifisitet eller ukjent effektiviteten av reparasjon enzymer som brukes1,16,18.
Immunanalyser er andre sett av metoder som brukes for påvisning av 8-oxoGua1 og exocyclic DNA addukter, for eksempel 1,N6-dAdo og 1,n2-dGuo12. Til tross for følsomheten, en brist av bruk av antistoffer for påvisning av DNA lesjoner er mangelen på spesifisitet på grunn av kryss-reaktivitet til andre komponenter av biologiske prøver, inkludert normal DNA baser1,12. Exocyclic DNA addukter, inkludert 1,n6-DAdo og 1,n2-dGuo, kan også oppdages og kvantifisert av svært følsomme 32P-postlabeling analyser12. Den høye følsomheten til 32P-postlabeling tillater bruk av svært små mengder DNA (f. eks 10 μg) for påvisning av ca 1 epoxyaddukt per 1010 normal baser19. Men bruken av radio-kjemikalier, mangel på kjemisk spesifisitet og lav nøyaktighet er noen ulemper19,20.
En felles begrensning av metodene sitert ovenfor er den lave selektivitet eller spesifisitet for påvisning av de ønskede molekyler. I dette scenariet, HPLC koblet til electrospray ionisering tandem masse massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS og HPLC-MS3) utviklet seg som gullstandarden for kvantifisering av modifisert nucleosides i biologiske matriser, som DNA, urin, plasma og spytt 1 den andre , 19 andre priser , 20. fordeler med HPLC-ESI-MS/MS metoder er følsomheten (vanligvis i lav fmol rekkevidde) og den høye spesifisitet levert av i) den kromatografiske separasjon, II) den karakteristiske og kjente mønster av molekyl fragmentering inne i massen spektrometer kollisjons kammer, og III) nøyaktig måling av den valgte massen til lade ratio (m/z) i flere reaksjons overvåkingsmodus1,19. Bruken av isotopically merket interne standarder legger til fordel for rettelser for molekylet tap under DNA hydrolyse og analytt berikelse skritt, samt for forskjeller i analytt ionisering mellom prøvene. Den likeledes hjelpemidler inne identifikasjonen av det korrekt kromatografiske fjellpigg når mer enn ettall fjellpigg er gave1,12,19,20.
Adskillige metoder basert på HPLC-ESI-MULTIPLE SCLEROSIS/MULTIPLE SCLEROSIS ha blitt anvendt for kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo og 1,N2-dGuo inne DNA utdraget fra annerledes Biological prøvene12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Fine partikler (PM2,5) bærer organiske og uorganiske kjemikalier som Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), Nitro-PAH, aldehyder, ketoner, kar bok syls syrer, quinolines, metaller og vannløselige ioner, som kan indusere betennelser og oksidativt stress, forhold som favoriserer forekomsten av biomolekyler Kader og sykdom30,31,32,33. Vi presenterer her validert HPLC-ESI-MS/MS metoder som ble med hell søkt om kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo og 1,N2-dGuo i lunge, lever og nyre DNA av A/J mus for vurderingen av effekter av ambient PM2,5 eksponering34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA-addukter og oksidert DNA-baser er eksempler på DNA-lesjoner som er nyttige biomarkører for toksisitet vurdering av stoffer som er Elektrofil, generere reaktive elektrofiler ved biotransformasjon, eller indusere oksidativt stress. Blant oksidert nucleobases, den mest studerte en er 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) eller 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), en biomarkør av oxidatively indusert base skade i DNA. Aldehyder og epoxyaldehydes som følge av lipid peroxidation prosessen er Elektrofil molekyler i stand til å danne mutagent exocyclic DNA addukter, slik som etheno addukter 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,N2- εdGuo) og 1,n6-etheno-2'-Deoksyadenosinregionen (1,n6-εdAdo), som har blitt foreslått som potensielle biomarkører i patofysiologi av betennelse. Selektive og følsomme metoder for deres kvantifisering i DNA er nødvendig for utvikling av forebyggende strategier for å bremse celle mutasjon priser og kronisk sykdom utvikling (f. eks, kreft, nevrodegenerative sykdommer). Blant de sensitive metoder tilgjengelig for deteksjon (høy ytelse flytende kromatografi koplet til elektrokjemiske eller tandem masse massespektrometri detektorer, komet analysen, immunanalyser, 32P-postlabeling), den mest selektive er de basert på høy ytelse flytende kromatografi koplet til tandem Mass massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS). Selektivitet er en viktig fordel når analysere komplekse biologiske prøver og HPLC-ESI-MS/MS utviklet seg som gullstandarden for kvantifisering av modifiserte nucleosides i biologiske matriser, som DNA, urin, plasma og spytt. Bruken av isotopically merket interne standarder legger til fordel for rettelser for molekylet tap under DNA hydrolyse og analytt berikelse skritt, samt for forskjeller i analytt ionisering mellom prøvene. Den likeledes hjelpemidler inne identifikasjonen av det korrekt kromatografiske fjellpigg når mer enn ettall fjellpigg er gave.
Vi presenterer her validert sensitiv, nøyaktig og presis HPLC-ESI-MS/MS metoder som ble med hell søkt om kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo og 1,n2-dGuo i lunge, lever og nyre DNA av A/J mus for vurderingen av virkningene av ambient PM2,5 eksponering.

Gjennomsnittlig DNA-konsentrasjoner (± SD) innhentet fra mus leveren (~ 1 g vev), lunge (~ 0,2 g vev) og nyre (~ 0,4 g vev) var henholdsvis 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021, og 3 223 ± 723 μg/mL i det endelige volumet av 200 μL. En representativ kromatogram innhentet av HPLC-pappa av renset DNA er vist i Figur 3. Tilstedeværelsen av de fire 2 '-deoxynucleosides, fri fra RNA ribonucleosides, som eluere umiddelbart før tilsvarende 2 '-deoxynucleosides, demo...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Kvantifisering av tre DNA lesjoner ved Mass massespektrometri og vurdering av deres nivåer i vev av mus utsatt for ambient Fine partikler

Vi beskriver her metoder for sensitiv og nøyaktig kvantifisering av lesjoner 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-Deoksyadenosinregionen (1,n6-dAdo) og 1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) i DNA. Metodene ble brukt på vurderingen av virkningene av svevestøv partikler (PM2,5) i vev (lunge, lever og nyre) av eksponerte A/J mus.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Metodene som presenteres her tillater kvantifisering av DNA-lesjoner indusert av oksidativt stress, noe som bidrar til forståelsen av patofysiologiske mekanismer som kan være mål for forebygging og behandling av sykdommer. Selektivitet og følsomhet er de viktigste fordelene. Selektivitet er en viktig fordel når du arbeider med komplekse biologiske prøver.HPLC kombinert med tandemmassespektrometri utviklet seg som gullstandarden for denne typen kvantifisering med biologiske matriser. Oksidativt stress er en vanlig hendelse for forskjellige patofysiologiske prosesser. Økte nivåer av etheno adducts har blitt påvist i vev eller urin hos pasienter med inflammatoriske sykdommer.DNA-lesjonene gir også informasjon om endogene hendelser utløst av eksponering for forurensende stoffer. Hvis DNA-lesjonene økes, kan eksponeringen være på det nivået som øker risikoen for kreftutvikling, for eksempel. Lesjonene kan kvantifiseres i DNA fra ethvert cellulært system og alternativt i urin, plasma, spyttkulturmed tilpasninger i prøvepreparatet.Til å begynne med, bruk en kulturplate plassert på is som base for å kutte et stykke vev med en skalpell. Vei ett gram av vevet i hvert 50-milliliter avkortet rør for umiddelbar bruk. Hold det gjenværende vevet på tørris før du lagrer på minus 80 grader Celsius.Til hvert rør, tilsett 10 milliliter av den kommersielle cellelyseløsningen som inneholder 0,5 millimolar deferoksamin, og hold på is. Sett vevhomogenisatoren til lav hastighet, rundt 60 til 90 o/min. Homogeniser vevet på is i noen minutter til løsningen er uten vevfragmenter.Deretter legger du til 150 mikroliter proteinase K-løsning til hver homogeniserte prøve. Rist rørene ved inversjon, og hold dem ved romtemperatur over natten. Om morgenen legger du til 40 mikroliter ribonuclease En løsning, rist ved inversjon og hold rørene ved romtemperatur i to timer.Tilsett fem milliliter kommersiell proteinnedbørløsning, vortex kraftig og sentrifuge ved 2000 ganger g, fire grader Celsius, i 10 minutter. Overfør supernativa til 50-milliliter avkortet rør som inneholder 10 milliliter kald isopropanol. Inverter rørene forsiktig flere ganger til observasjon av utfelt DNA.Bruk en Pasteur pipette lukket på slutten for å samle inn det utfelte DNA. Overfør det innsamlede DNA-et til rør som inneholder fire milliliter med 10 millimolar Tris-buffer og en millimolar deferoksamin ved pH syv for å oppløse. Etter at DNA er fullstendig oppløst i rørene, tilsett fire milliliter av en kloroformløsning som inneholder 4% isoamylalkohol til hvert rør.Inverter rørene 10 ganger for homogenisering, sentrifuge ved 2000 ganger g, fire grader Celsius, i 10 minutter, og overfør de øvre fasene til nye rør. Gjenta vasken av den øvre fasen med kloroformoppløsningen to ganger til. Deretter legger du til åtte milliliter absolutt etanol og 0,4 milliliter av en fem-molar natriumkloridløsning for å utløse DNA.Igjen, samle det utløste DNA, og overføre den til tre milliliter på 70% etanol. Gjenta vasken med 70% etanol en gang til. Kast etanoloppløsningen med forsiktighet, og inverter rørene som inneholder det utfelte DNA-et på absorberende papir for å fjerne overflødig oppløsning.Etter å ha forberedt DNA hydrolyse prøver med 15N5 isotopisk standard på 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 15N5 isotopisk standard på 1, N2-etheno-deoxyguanosine i henhold til manuskriptet, overføre 10 mikroliter av hver prøve til rør for kvantifisering av normale deoksynukleosider av HPLC-UV. Utvis restvolumet til solidfaseutvinning. Hvis du vil utføre HPLC, må du først elute en C18-kolonne festet til en C18 SecurityGuard-kassett med en gradient på 0,1 % maursyre og metanol.Sett opp gradientprogrammet til å kjøre fra null til 25 minutter med null til 18% metanol, fra 25 til 27 minutter med 18 til 0% metanol, deretter fra 27 til 37 minutter med 0% metanol med en strømningshastighet på en milliliter per minutt og 30 grader Celsius. Deretter injiserer du et volum mellom to og seks mikroliter for hver prøve reservert for normal deoksynukleosider kvantifisering. Sett DAD-detektoren på 260 nanometer for integrering av deoksyguanosin- og deoksyadenosintoppene.For å utføre solid-fase ekstraksjon for analyser av 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 1, N2-etheno-deoxyguanosine, først laste patronene med en rekke løsninger med et volum på en milliliter. Tilsett 100% metanol, deionisert vann, hydrolysert DNA-prøve, deionisert vann, 10% metanol, 15% metanol, og til slutt 100% metanol for innsamling. Deretter fortsetter du i henhold til manuskriptet.Etter klargjøring av DNA hydrolyse prøver 15N5 isotopisk standard på 8-okso-deoksyguanosin, overføre 80 mikroliter av hver prøve til hetteglass for analyse i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Reserver de resterende 20 mikroliter for kvantifisering av deoksyguanosin på HPLC-UV, som gjort tidligere. For analyse av 8-okso-deoksyguanosin på HPLC-ESI-MS/MS, elute C18-kolonnen A sammenlignet med en C18 SecurityGuard-kassett med en gradient av oppløsningsvæske A og B med en strømningshastighet på 150 mikroliter per minutt og 25 grader Celsius.Kjør den binære pumpen med null til 15% av løsemiddel B i løpet av de første 25 minuttene, 15 til 80% av løsningsmidlet B fra 25 til 28 minutter, 80% av løsningsmidlet B fra 28 til 31 minutter, 80 til 0% av løsningsmiddel B fra 31 til 33 minutter, og 0% av oppløsningsmiddel B fra 33 til 46 minutter. Rett de første 16 minuttene av kolonne A eluent til avfall. Tilstandskolonne B av isokratisk pumpe med en løsning på 15% metanol i vann som inneholder 0,1% maursyre med en strømningshastighet på 150 mikroliter per minutt.Etter seks minutter, sjekk kromatrammet for å sikre 8-oxo-deoxyguanosine standard elutes fra kolonne A.Under 16 til 32 minutter intervall, bytte ventilen til posisjonen slik at forbindelsen mellom kolonne A og kolonne B.Lukk ventilen på 32 minutter for å elute 8-oxo-deoxyguanosine fra den andre kolonnen og få en skarp kromatografisk topp. For analyse av 1, N6-etheno-deoxyadenosin og 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute en C18 kolonne sammenlignet med en C18 SecurityGuard patron med en gradient av løsemiddel A og B med en strømningshastighet på 130 mikroliter per minutt og 25 grader Celsius. Kjør den binære pumpen med 0% av løsningsmidlet B de første 10 minuttene, null til 20% av løsningsmidlet B i 10 til 39 minutter, 20 til 75% av løsningsmidlet B fra 39 til 41 minutter, 75% av løsningsmiddel B fra 41 til 46 minutter, 75 til 0% av løsningsmiddel B fra 46 til 47 minutter, og 0% av løsningsmiddel B fra 47 til 60 minutter.Bruk koblingsventilen til å rette de første 35 minuttene av eluent til avfall og 35 til 42 minutter fraksjon til ESI-kilden. Kontroller at tilleggsstandardene elute fra kolonnen i det angitte intervallet. Integrer toppene av 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 isotopisk standard på 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoksyadenosin, 15N5 isotopisk standard på 1, N6-etheno-deoksyadenosin, 1, N2-etheno-deoksyguanosin og 15N5 isotoppisk standard på 1, N2-etheno-deoksyguanosin fra HPLC-ESI-MS/MS-analysene.Beregn arealforholdene for kalibreringskurvene og prøvene. Opprett kalibreringskurvene, og beregn mengden lesjoner i hver injiserte prøve. Integrer toppene av deoksyguanosin og deoksyadenosin fra HPLC-UV-analysene.Bruk områdene til å etablere kalibreringskurvene, og beregne mengdene deoksyguanosin og deoksyadenosin hos dyr i hver injiserte prøve. Beregn molarfraksjonene for 8-okso-deoksyguanosin over deoksyguanosin, 1, N6-etheno-deoksyadenosin over deoksyadenosin, og 1, N2-etheno-deoksyguanosin over deoksyguanosin, som gir antall lesjoner per en million normal deoksyguanosin eller deoksyadenosin. Et representativt kromatrammet av det rensede DNA-et oppnådd av HPLC-UV viser tilstedeværelsen av de fire normale deoksynukleotider, fri for RNA ribonucleosides, som viser DNA-renheten.Representative kromatogrammer fra HPLC-ESI-MS/MS av 8-oxo-deoxyguanosin, 1, N6-etheno-deoksyadenosin og 1, N2-etheno-deoksyguanosin i mus vev DNA-prøver er vist. Kromatrammet oppnådd med UV-deteksjon viser de fire normale deoksynukleosider som eluting fra den første kolonnen til ca 10 minutter, med en god separasjon fra 8-oxo-deoxyguanosin, eliminere uønskede forstyrrelser. En viktig ting å huske for nøyaktige kvantifiseringer er å ha alltid de samme mengdene interne standarder i injeksjonsvolumet i kalibreringskurvene og prøvene.Metodene som presenteres her kan tilpasses kvantifiseringen av andre modifiserte deoksynukleosider. Å utvide bandet av modifiserte deoksynukleosider gir en bedre forståelse av de underliggende patofysilogiske mekanismene. Vi kan undersøke rollen som oksidativ skade i ulike situasjoner som eksponering for xenobiotika, diabetes og celle ondartet transformasjon, og dermed hjelpe utviklingen av forebyggende og behandlingsstrategier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Transformasjon av Probiotiske gjær og deres utvinning fra Gastrointestinale immun Vev Etter oralt inntak i Mus

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøvetaking slimhinnene slimhinnen væske for kvantifisering av In Vivo øvre luftveier immun-megler nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Bruke fylogenetisk analyse å undersøke eukaryote Gene opprinnelse

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Anriking av bakteriell lipoproteiner og utarbeidelse av N-terminal Lipopeptides for strukturelle fastsettelse av massespektrometri

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...