Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 e 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 e 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) e CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira e A. A. F. Oliveira receberam bolsas de estudo da FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) e CAPES (coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva e A. P. M. Loureiro receberam bolsas do CNPq.
Algumas figuras e tabelas presentes neste trabalho foram originalmente publicadas em Oliveira A.A.F. et al. efeitos genotóxicos e epigenotóxicos em camundongos expostos a matéria particulada de partículas finas (PM2,5) da cidade de São Paulo, Brasil. Toxicologia de partículas e fibras. 15, 40 (2018).

Camundongos a/J machos de quatro semanas de idade, sem patógenos específicos, foram obtidos do centro reprodutor de animais de laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, e foram tratados de acordo com o Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de São Paulo (protocolo n º 1310/09).
1. coleção de tecidos de camundongos
<ol><li>Anestesie o animal com xilazina e cetamina. Para um rato com 30 g de peso corporal, injete uma soluç?...

Um problema principal encontrado nas análises 8-oxodguo por métodos da HPLC é a indução possível de sua formação durante os procedimentos do workup da extração do ADN, da hidrólise do ADN, e da concentração de hidrolisados do ADN22,38. A fim de minimizar o problema da formação vesícula 8-oxodguo, recomenda-se a adição de deferoxamina a todas as soluções de extração de DNA, armazenamento e hidrólise, o uso do método de iodeto de sódio agen...

Algumas espécies reativas de oxigênio (ROS) são capazes de oxidar ligações duplas de carbono de bases de DNA e alguns carbonos na fração desoxirribose, gerando bases oxidadas e quebras de fio de DNA1. Como uma molécula carregada negativamente rica em átomos de nitrogênio e oxigênio, o DNA também é um alvo para grupos eletrofílicos que reagem covalentemente com os sítios nucleofílicos (nitrogênio e oxigênio), dando produtos que são chamados de adutos de DNA2. Assim, os adutos do ADN e as bases oxidadas do ADN são exemplos de lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrofílicas, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo1, o 2. Embora as bases modificadas do ADN possam ser removidas do ADN pela base ou pelo reparo da excisão do nucleotide (BER ou NER), a indução de um desequilíbrio entre a geração e a remoção de lesões do ADN em favor do anterior conduz a um aumento líquido de seus níveis no tempo estipulado do ADN3 < /C5 >. Os resultados são o aumento das taxas de mutação do DNA, a redução da expressão gênica e a diminuição da atividade protéica2,4,5,6,7, efeitos que estão intimamente relacionados com a desenvolvimento de doenças. As mutações do DNA podem afetar diversas funções celulares, como sinalização celular, ciclo celular, integridade do genoma, estabilidade do telômero, epigenome, estrutura da cromatina, splicing de RNA, homeostase proteica, metabolismo, apoptose e diferenciação celular8 ,9. Estratégias para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas) passam pelo conhecimento das fontes de mutação, entre elas, as lesões do DNA e suas causas.
ROS gerados endogenamente em excesso, devido à exposição ao poluente, inflamação persistente, fisiopatologia da doença (por exemplo, diabetes), etc., são causas importantes de dano da biomolécula, incluindo o DNA e o dano lipídico1. Como exemplo, o radical hidroxila altamente reativo (OH) formado a partir de H2O2 redução por íons metálicos de transição (FE2 +,+ +) oxida as bases de DNA, a fração de açúcar de DNA e os ácidos graxos poliinsaturados em controle de difusão taxas de10. Entre os 80 já caracterizados nucleobases oxidadas3, o mais estudado é 8-oxo-7,8-diidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-Desoxiguanosina (8-oxodGuo, Figura 1), uma lesão que é capaz de induzir transversões gt em células mamíferas10,11. É formado pela oxidação eletrônica mono da guanina, ou pelo ataque de oxigênio radical hidroxila ou singlet de guanina no DNA1. Os ácidos graxos poliinsaturados são outros alvos importantes de oxidantes altamente reativos, como •Oh, que iniciam o processo de peroxidação lipídica1,12. Ele dá origem a hidroperóxidos de ácidos graxos que podem se decompor a aldeídos eletrofílicos e epoxialdeídos, tais como malondialdeído, 4-hidroxi-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4, 5-epóxi-(2E)-decenal, hexenal, acroleína, crotonaldeído, que são capaz de formar adutos de DNA exocílicos mutagénicos, como os adutos de malondialdeído, propano ou eteno1,12,13. Os adutos de eteno 1,n2-eteno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo , Figura 1) e 1,n6-eteno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-εdado, Figura 1 ) têm sido sugeridas como potenciais biomarcadores na fisiopatologia da inflamação14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Figura 1. Estruturas químicas das lesões de DNA quantificadas no presente estudo. dR = 2 ́-desoxirribose. Este número foi modificado de Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Estudos realizados no início da década de 1980 permitiram a detecção sensível de 8-oxodGuo por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção eletroquímica (HPLC-ECD). A quantificação de 8-oxodguo por HPLC-ECD em diversos sistemas biológicos sujeitados às circunstâncias oxidantes conduziu ao Recognition de 8-oxodguo como um biomarcador de dano de base oxidativamente induzido no ADN1,16. Embora robusto e permitindo a quantificação de 8-oxodguo na escala baixa de fmol17, as medidas do HPLC-ECD confiam na exatidão do tempo da retenção do analito para a identificação do analito e na definição da cromatografia para evitar interferências de outros constituintes da amostra. Como a detecção eletroquímica requer o uso de sal (por exemplo, fosfato de potássio, acetato de sódio) na fase móvel, a manutenção de condições analíticas adequadas precisa de rotina de coluna e tempo de limpeza do equipamento.
Alternativamente, o uso do DNA bacteriano da enzima de reparo do ADN glicosilase do formamidopyrimidine (fpg) e, mais tarde, o glicolisase 1 do humano 8-oxoguanine (hOGG1), para a deteção e a remoção de 8 oxogua do ADN, emergiu como uma maneira para a indução do lábil do alcalóide do ADN Sites. Os locais lábeis do alcalóide são convertidos às rupturas da costa do ADN e permitem a quantificação indireta muito elevada sensível de 8 oxoGua pela electroforese alcalina do gel da única pilha ("ensaio do cometa"). A alta sensibilidade e a realização das análises sem a necessidade de extração de DNA celular são as principais vantagens deste tipo de ensaio. Dá os níveis os mais baixos do estado estacionário de 8 oxoGua no ADN, tipicamente 7-10 vezes mais baixos do que os níveis obtidos por métodos bioanalíticos baseados no HPLC. No entanto, é uma medida indireta de 8-oxogua e algumas desvantagens são a falta de especificidade ou a eficiência desconhecida das enzimas de reparo utilizadas1,16,18.
Os imunoensaios são outro conjunto de métodos utilizados para a detecção de 8-oxoGua1 e ADUTOS de DNA exocídrico, como 1,n6-dAdo e 1,n2-dguo12. Apesar da sensibilidade, uma lacuna do uso de anticorpos para a detecção de lesões de DNA é a falta de especificidade devido à reatividade cruzada a outros componentes de amostras biológicas, incluindo as bases normais de DNA1,12. Os adutos exocílicos de DNA, incluindo 1, n6-DAdo e 1, n2-dguo, também podem ser detectados e quantificados por ensaios altamente sensíveis de 32P-postetiquetagem12. A sensibilidade elevada de 32P-postrotulagem permite o uso de quantidades muito pequenas de ADN (por exemplo, 10 μg) para a deteção de aproximadamente 1 aduto por 1010 bases normais19. No entanto, o uso de radioquímicos, a falta de especificidade química e a baixa acurácia são algumas desvantagens19,20.
Uma limitação compartilhada dos métodos citados acima é a baixa seletividade ou especificidade para a detecção das moléculas desejadas. Nesse cenário, a HPLC acoplada à espectrometria de massas em tandem de ionização por electrospray (HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-MS3) evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva 1. º , 19 anos de , 20. vantagens dos métodos de HPLC-ESI-MS/MS são a sensibilidade (tipicamente na baixa escala do fmol) e a especificidade elevada fornecida por i) a separação cromatográfica, II) o teste padrão característico e conhecido da fragmentação da molécula dentro da massa Câmara de colisão do espectrómetro, e III) a medida exata da massa selecionada para carregar a relação (m/z) no modo múltiplo da monitoração da reação1,19. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Auxilia também na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente1,12,19,20.
Vários métodos baseados em HPLC-ESI-MS/MS têm sido utilizados para quantificação de 8-oxodguo, 1,n6-dAdo e 1,n2-dguo em DNA extraído de diferentes amostras biológicas12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Partículas finas (PM2,5) transportar produtos químicos orgânicos e inorgânicos, tais como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHS), Nitro-PAHS, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, quinolinas, metais e íons solúveis em água, que podem induzir inflamação e estresse oxidativo, condições que favorecem a ocorrência de danos biomoléculas e doença30,31,32,33. Nós apresentamos aqui métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, de 1, den6-dAdo e de 1, den2-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de a/J para a avaliação do efeitos do ambiente PM2,5 exposição34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

Os adutos do DNA e as bases oxidadas do ADN são exemplos das lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrophilic, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo. Dentre as nucleobases oxidadas, a mais estudada é a 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-Desoxiguanosina (8-oxodGuo), um biomarcador de dano base oxidativamente induzido no DNA. Os aldeídos e os epoxyaldehydes resultantes do processo da peroxidação do lipido são as moléculas substituição capazes de dar forma aos adutos exocíclicas mutagénicas do ADN, tais como os adutos 1,n2-eteno-2'-deoxyguanosine do eteno (1,n2- εdGuo) e 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-εdado), que foram sugeridos como biomarcadores potenciais na fisiopatologia da inflamação. Métodos seletivos e sensíveis para sua quantificação no DNA são necessários para o desenvolvimento de estratégias preventivas para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas). Entre os métodos sensíveis disponíveis para sua detecção (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detectores de espectrometria de massas eletroquímicas ou em tandem, ensaio cometa, imunoensaios, 32P-pós-rotulagem), os mais seletivos são aqueles baseados em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-ESI-MS/MS). A seletividade é uma vantagem essencial na análise de amostras biológicas complexas e a HPLC-ESI-MS/MS evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Também auxilia na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente.
Nós apresentamos aqui métodos sensíveis, exatos e precisos da HPLC-ESI-MS/MS validados que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo e 1,n2-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de A/J para a avaliação dos efeitos da exposição ambiental PM2,5 .

As concentrações médias de DNA (± DP) obtidas do fígado de camundongos (tecido ~ 1 g), pulmão (tecido de ~ 0,2 g) e rim (tecido ~ 0,4 g) foram, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 e 3.223 ± 723 μg/mL no volume final de 200 μL. Um cromatograma representativo obtido por HPLC-DAD do DNA purificado é mostrado na Figura 3. A presença dos quatro 2 '-deoxynucleosides, livre dos ribonucleosides do RNA, que eluir imediatamente antes dos 2 '-deox...

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Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Os métodos aqui apresentados permitem a quantificação de lesões de DNA induzidas pelo estresse oxidativo, contribuindo para a compreensão de mecanismos fisiofisiológicos que possam ser alvo de prevenção e tratamento de doenças. Seletividade e sensibilidade são as principais vantagens. A seletividade é uma vantagem essencial ao trabalhar com amostras biológicas complexas.O HPLC acoplado à espectrometria de massa tandem evoluiu como padrão-ouro para este tipo de quantificação com matrizes biológicas. O estresse oxidativo é um evento comum a diferentes processos fisiopatológicos. Níveis aumentados de adutos de etheno foram detectados em tecidos ou urina de pacientes com doenças inflamatórias.As lesões de DNA também fornecem informações sobre eventos endógenos desencadeados pela exposição a poluentes. Se as lesões de DNA forem aumentadas, a exposição pode estar no nível que aumenta o risco de desenvolvimento do câncer, por exemplo. As lesões podem ser quantificadas no DNA de qualquer sistema celular e, alternativamente, na urina, plasma, meio de cultura saliva com adaptações na preparação da amostra.Para começar, use uma placa de cultura colocada no gelo como base para cortar um pedaço de tecido com um bisturi. Pesar um grama do tecido em cada tubo tampado de 50 mililitros para uso imediato. Mantenha o tecido restante em gelo seco antes de armazenar a menos 80 graus Celsius.Em cada tubo, adicione 10 mililitros da solução comercial de lise celular contendo deferoxamina de 0,5 mililamlar, e mantenha no gelo. Coloque o homogeneizador de tecido em baixa velocidade, em torno de 60 a 90 rpm. Homogeneize os tecidos no gelo por alguns minutos até que a solução esteja sem fragmentos de tecido.Em seguida, adicione 150 microliters de solução proteinase K a cada amostra homogeneizada. Agite os tubos por inversão, e mantenha-os à temperatura ambiente durante a noite. Pela manhã, adicione 40 microliters de ribonuclease Uma solução, agite pela inversão e mantenha os tubos em temperatura ambiente por duas horas.Adicione cinco mililitros de solução comercial de precipitação de proteína, vórtice vigorosamente, e centrífuga a 2.000 vezes g, quatro graus Celsius, por 10 minutos. Transfira os supernantes para tubos tampados de 50 mililitros contendo 10 mililitros de isopropanol frio. Inverta os tubos suavemente várias vezes até a observação do DNA precipitado.Use uma pipeta Pasteur fechada no final para coletar o DNA precipitado. Transfira o DNA coletado para tubos contendo quatro mililitros de tampão Tris de 10 mililitros e deferoxamina de um mililitro em pH 7 para dissolver. Depois que o DNA for completamente dissolvido nos tubos, adicione quatro mililitros de uma solução de clorofórmio contendo 4% de álcool isoamyl em cada tubo.Inverta os tubos 10 vezes para homogeneização, centrífuga a 2.000 vezes g, quatro graus Celsius, por 10 minutos, e transfira as fases superiores para novos tubos. Repita a lavagem da fase superior com a solução de clorofórmio mais duas vezes. Em seguida, adicione oito mililitros de etanol absoluto e 0,4 mililitros de uma solução de cloreto de sódio de cinco molares para precipitar o DNA.Novamente, coletar o DNA precipitado, e transferi-lo para três mililitros de 70% de etanol. Repita a lavagem com 70% de etanol mais uma vez. Descarte a solução de etanol com cautela e inverta os tubos contendo o DNA precipitado em papel absorvente para remover o excesso de solução.Depois de preparar amostras de hidrólise de DNA com padrão isotópico de 1, N6-etheno-desoxyadenosine e padrão isotópico de 15N5 de 1, N2-etheno-deoxyguanosine de acordo com o manuscrito, transfira 10 microliters de cada amostra em tubos para quantificação de desoxynucleosídeos normais por HPLC-UV. Sujeito o volume residual à extração em fase sólida. Para executar o HPLC, primeiro elute uma coluna C18 anexada a um cartucho C18 SecurityGuard com um gradiente de ácido fórmico de 0,1% e metanol.Configure o programa de gradiente para funcionar de zero a 25 minutos com zero a 18% de metanol, de 25 a 27 minutos com 18 a 0%de metanol, depois de 27 a 37 minutos com 0%metanol a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e 30 graus Celsius. Depois disso, injete um volume entre dois e seis microliters para cada amostra reservada para quantificação normal de desoxynucleosídeos. Coloque o detector PAI em 260 nanômetros para integração dos picos de desoxiguanosina e desoxiinonosina.Para realizar a extração em fase sólida para análises de 1, N6-etheno-desoxyadenosine e 1, N2-etheno-deoxyguanosine, primeiro carregue os cartuchos com uma série de soluções a um volume de um mililitro. Adicione 100% de metanol, água deionizada, amostra de DNA hidrolisado, água deionizada, 10% metanol, 15% metanol e, por último, 100% metanol para coleta. Então, prossiga de acordo com o manuscrito.Após o preparo das amostras de hidrólise de DNA 15N5 padrão isotópico de 8-oxo-desoxyguanosina, transfira 80 microlitadores de cada amostra em frascos para análise no sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reserve os 20 microliters restantes para quantificação de desoxyguanosina no HPLC-UV, como feito anteriormente. Para análise de 8-oxo-desoxyguanosine no HPLC-ESI-MS/MS, elute a coluna C18 Acoplado a um cartucho C18 SecurityGuard com um gradiente de solvente A e B a uma taxa de fluxo de 150 microliters por minuto e 25 graus Celsius.Execute a bomba binária com zero a 15% de solvente B durante os primeiros 25 minutos, 15 a 80% de solvente B de 25 a 28 minutos, 80% de solvente B de 28 a 31 minutos, 80 a 0% de solvente B de 31 a 33 minutos, e 0% de solvente B de 33 a 46 minutos. Direcione os primeiros 16 minutos da coluna A eluente para o lixo. Condição coluna B pela bomba isocrática com uma solução de 15% de metanol na água contendo ácido fórmico de 0,1% a uma taxa de fluxo de 150 microliters por minuto.Após seis minutos, verifique o cromatógrama para garantir os elutos padrão de 8 oxo-desoxiguanosina da coluna A.Durante o intervalo de 16 a 32 minutos, mude a válvula para a posição permitindo a conexão entre a coluna A e a coluna B.Feche a válvula em 32 minutos para eluto 8-oxo-deoxyguanosine da segunda coluna e obtenha um pico cromatográfico afiado. Para análise de 1, N6-etheno-desoxyadenosine e 1, N2-etheno-desoxyguanosine, elute uma coluna C18 acoplado a um cartucho C18 SecurityGuard com um gradiente de solvente A e B a uma taxa de fluxo de 130 microliters por minuto e 25 graus Celsius. Execute a bomba binária com 0% de solvente B durante os primeiros 10 minutos, zero a 20% do solvente B por 10 a 39 minutos, 20 a 75% de solvente B de 39 a 41 minutos, 75% do solvente B de 41 a 46 minutos, 75 a 0% de solvente B de 46 a 47 minutos, e 0% de solvente B de 47 a 60 minutos.Use a válvula de comutação para direcionar os primeiros 35 minutos de eluent para o desperdício e a fração de 35 a 42 minutos para a fonte ESI. Certifique-se de que os padrões de aduto elute da coluna no intervalo definido. Integre os picos de 8-oxo-desoxyguanosine 15N5 padrão isotópico de 8-oxo-desoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 15N5 padrão isotópico de 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, e 15N5 padrão isotópico de 1, N2-etheno-deoxyguanosine das análises HPLC-ESI-MS/MS.Calcule as razões de área para as curvas de calibração e as amostras. Estabeleça as curvas de calibração e calcule as quantidades de lesões em cada amostra injetada. Integre os picos de desoxyguanosina e desoxyadenosine das análises HPLC-UV.Use as áreas para estabelecer as curvas de calibração e calcular as quantidades de desoxiguanosina e desoxiinonosina em animais em cada amostra injetada. Calcule as frações molares para 8-oxo-desoxyguanosine sobre desoxiguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosine sobre desoxyadenosine, e 1, N2-etheno-deoxyguanosine sobre desoxyguanosine, que dão o número de lesões por um milhão de desoxyguanosina normal ou denosyadeine. Um cromatógrafo representativo do DNA purificado obtido pelo HPLC-UV mostra a presença dos quatro desoxirimentos normais, livres das ribonucleosídeos de RNA, demonstrando a pureza do DNA.Cromatógramas representativos do HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxo-desoxyguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, e 1, N2-etheno-deoxyguanosine em amostras de DNA de tecido de camundongos são mostrados. O cromatógrama obtido com a detecção de UV mostra os quatro desoxinucleosídeos normais eluvando da primeira coluna até cerca de 10 minutos, com uma boa separação de 8-oxo-desoxyguanosine, eliminando interferências indesejadas. Uma coisa importante a ser lembrada para quantificações exatas é ter sempre as mesmas quantidades de padrões internos no volume de injeção nas curvas de calibração e amostras.Os métodos aqui apresentados podem ser adaptados para a quantificação de outros desoxiúmônios modificados. A expansão da banda de desoxynucleosídeos modificados permite uma melhor compreensão dos mecanismos fisiofisiológicos subjacentes. Podemos investigar o papel dos danos oxidativos em diferentes situações, como exposição a xenobióticos, diabetes e transformação maligna celular, auxiliando, assim, o desenvolvimento de estratégias preventivas e de tratamento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Microondas Assistida Diagnóstico Rápido de Doenças vírus de planta por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Imunologia e Infecção

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

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Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Usando a análise filogenética para investigar a origem de genes eucariontes

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