Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Фундасао де ампаро à Пескиса ду Сан-Паулу, proc. 2012/22190-3 и 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 и 429184/2016-6), накидки, PRPUSP (про-Рейториа де Пескиса Da Universidade de Сан-Паулу), ИНКТ ИНАРА (ПРМ/CNPq/ННКТ/МЫСЫ/ FAPEMIG/FАПЕРJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), ИНКТ (FAPESP/CNPq/МЫСЫ; Proc. 573530/2008-4), НПД Реддоксома (ПРПУПП; Proc. 2011.1.9352.1.8) и СЕПИД Ресдокома (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). Т. ф. Оливейра и а. а. ф. Оливейра получил стипендии от FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) и МЫСОВ (coordenação de Аперфечоаменту де Пессоаль де Нивель). Стипендиаты из CNPq получили м. х. г. Медейрос, Пи ди Массио, P. H. N. Saldiva и а. м. Лурейро.
Некоторые цифры и таблицы, присутствующие в этой работе были первоначально опубликованы в Оливейра А.А.Ф. et al. генотоксические и эпигентоксические эффекты у мышей, подверженных воздействию концентрированных окружающих мелких твердых частиц (PM2,5) из города Сан-Паулу, Бразилия. Частица и клетчатка токсикологии. 15, 40 (2018).

Четыре недели старый мужчина A/J мышей, конкретных патогенов бесплатно, были получены из центра разведения лабораторных животных Фундасао Освальдо Крус (ФИОКРУЗ), Рио-де-Жанейро, Бразилия, и были обработаны в соответствии с Комитетом по этике медицинский факультет, университет Сан-Паулу...

Основная проблема, найденная в 8-окродго анализы методами HPLC является возможная индукция его образования во время обследование процедур извлечения ДНК, ДНК-гидролиза, и концентрация ДНК-гидролизатов22,38. Для минимизации проблемы 8-Оксодго артифактологич?...

Некоторые активные виды кислорода (ROS) способны окислять двойные углеродные связи баз ДНК и некоторые углероды в дезоксирибозе, создавая окисленные базы и разрывы ДНК-нити1. В качестве отрицательно заряженной молекулы, богатой атомами азота и кислорода, ДНК также является мишенью для электрофильных групп, которые ковалентно реагируют с нуклеофильных участков (азота и кислорода), давая продукты, которые называются ДНК аддуктов2. Таким образом, ДНК-аддукты и окисленные базы ДНК являются примерами повреждений ДНК, которые являются полезными биомаркерами для оценки токсичности веществ, которые электрофильные, генерировать реактивные электрофилы при биотрансформации, или индуцировать окислительный стресс1, 2. Хотя модифицированные базы ДНК могут быть удалены из ДНК с помощью базы или эксцизии нуклеотидов (BER или NER), индукция дисбаланса между генерацией и удалением поражений ДНК в пользу первого приводит к чистому увеличению их уровней в сверхурочных ДНК3 < /C5 >. Результаты являются увеличение скорости мутации ДНК, снижение экспрессии генов, и уменьшилась активность белка2,4,5,6,7, эффекты, которые тесно связаны с развития болезней. Мутации ДНК могут влиять на различные клеточные функции, такие как клеточная сигнализация, клеточный цикл, целостность генома, стабильность теломер, эпигеном, Структура хроматина, РНК-сплайсинг, протеиновый гомеостаз, метаболизм, апоптоз и клеточная дифференциация8 ,9. Стратегии, направленные на замедление темпов мутации клеток и развитие хронических заболеваний (например, рак, нейродегенеративные заболевания) проходят через знание источников мутации, среди них, поражения ДНК и их причины.
ROS генерируемые эндогенно в избытке, из-за воздействия загрязнителей, стойкие воспаления, патофизиологии болезни (например, диабет) и т.д., являются важными причинами био повреждения, включая ДНК и повреждение липидов1. В качестве примера, Высокореактивные гидроксильные радикальные (OH) формируется из H2O2 уменьшение переходных ионов металлов (Fe2 +, Cu+) окисляет ДНК баз, ДНК сахара Моисея и полиненасыщенных жирных кислот при диффузии контролируемых ставки10. Среди 80 уже охарактеризовано окисленные нуклеобазы3, наиболее изученное из них-8-оксо-7, 8-дигидрогуанин (8-оксигуа) или 8-оксо-7, 8-diгидро-2'-дезоксигуаньозин (8-Окродго, рис. 1 клетки млекопитающих10,11. Он формируется моноэлектронным окислением гуанина, или гидроксильных радикалами или сингзным кислородной атакой гуанина в ДНК1. Полиненасыщенные жирные кислоты являются другими важными целями высокореактивных окислители, такие как •Oh, которые инициируют процесс перекисного окисления липидов1,12. Он порождает гидропероксиды жирных кислот, которые могут разлагаться на электрофильные альдегиды и эпоксидииды, такие, как малондиалдегид, 4-гидрокси-2-нонеал, 2, 4-decadienal, 4, 5-эпоксидной-(2е)-decenal, гексенал, акролейн, кротональдегид, которые являются способны образовывать мутагенное экзоцикловую ДНК-аддукты, такие как малондиалдегид-, пропано-, или этено аддукс1,12,13. Этено-аддукты 1,n2-этоно-2'-дезокгугуаньозин (1,n2-в., рис. 1) и 1,n6-Этоно-2'-дезоксиаденозин (1,n6-, на рисунке 1 ) были предложены в качестве потенциальных биомаркеров в патофизиологии воспаления14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> На рисунке 1. В настоящем исследовании количественно определены химические структуры повреждений ДНК. dR = 2 ́-дезоксирибоза. Эта цифра была изменена с Оливейра et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
Исследования, проведенные в начале 1980-х годов, позволили чувствительное обнаружение 8-Окродго высокой производительностью жидкой хроматографии, связанной с электрохимическим обнаружением (HPLC-РДРВ). Количественное определение 8-окродго путем HPLC-РДРВ в нескольких биологических системах, подвергшихся окислительной конъюнкции, привело к распознаванию 8-окродго как биомаркера оксидативно индуцированного базового повреждения в ДНК1,16. Несмотря на прочность и возможность количественной оценки 8-oxodGuo в низком диапазоне17, HPLC-РДРВ измерений полагаться на точность анализатор времени удержания для анализа идентификации и на разрешение хроматографии, чтобы избежать помех других составляющих выборки. Поскольку для электрохимического обнаружения требуется использование соли (например, фосфата калия, ацетат натрия) на подвижной фазе, поддержание адекватных аналитических условий требует регулярной очистки времени и оборудования.
С другой стороны, использование бактериального ДНК репарации фермента формаламидина ДНК гликозилазы (ФПГ) и, впоследствии, человеческий 8-оксигуанин гликозиназы 1 (hOGG1), для обнаружения и удаления 8-Oxoгуа из ДНК, возникла как способ для индукции ДНК щелочных лабильных Сайтов. Щелочные лабильные узлы преобразуются в разрывы в ДНК и позволяют очень высоко чувствительным косвенным количественному измерению 8-oxoGua путем щелочного электрофореза одноклеточного геля ("анализ кометы"). Высокая чувствительность и выполнение анализов без необходимости клеточной экстракции ДНК являются основными преимуществами этого типа анализа. Он дает самые низкие устойчивые-государственные уровни 8-oxoGua в ДНК, как правило, 7-10 раз ниже, чем уровни, полученные биоаналитическими методами, основанными на HPLC. Однако, это косвенное измерение 8-oxogua и некоторые недостатки являются отсутствие специфики или неизвестной эффективности ремонтных ферментов, используемых1,16,18.
Иммуноанализы представляют собой другой набор методов, используемых для обнаружения 8-Оксикогуа1 и экзоцикликс ДНК-аддуктов, таких как 1,n6-Дадо и 1,n2-ДГО12. Несмотря на чувствительность, недостатком использования антител для выявления повреждений ДНК является отсутствие специфики из-за перекрестной реактивности других компонентов биологических образцов, в том числе нормальных баз ДНК1,12. ДНК экзоциклика, в том числе 1,n6-Дадо и 1,n2-ДГО, также могут быть обнаружены и количественно по высокочувствительным 32P-postlabeling анализ12. Высокая чувствительность 32P-постмаркировки позволяет использовать очень небольшое количество ДНК (например, 10 мкг) для обнаружения около 1 аддода на 1010 нормальных баз19. Однако использование радиохимикатов, отсутствие химической специфичности и низкая точность являются некоторыми недостатками19,20.
Общим ограничением указанных выше методов является низкая избирательность или специфичность для обнаружения желаемых молекул. В этом сценарии, HPLC в сочетании с электрораспылителем ионизации тандем масс-спектрометрии (HPLC-ЭСИ-МС/МС и HPLC-MS3) превратилась в золотой стандарт для количественной оценки модифицированных нуклеолы в биологических матрицах, таких как ДНК, моча, плазма и слюна 1 , в 19 , 20. преимуществами HPLC-ЭСИ-МС/МС являются чувствительность (как правило, в низком диапазоне фмоль) и высокая специфичность, предоставляемая i) Хроматографическое разделение, II) Характеристика и известный образец фрагментации молекул внутри массы спектрометр столкновение камеры, и III) точное измерение выбранной массы для зарядки соотношение (m/z) в нескольких режиме мониторинга реакции1,19. Польза изотопно чистых маркированные внутренне стандарты добавляет преимущество коррекций для потерь молекулы во время этапов гидролиза дна и анализата обогащения, также, как для разницы анализирована ионизации между образцами. Он также помогает в определении правильного хроматографического пика, когда более чем один пик присутствует1,12,19,20.
Несколько методов, основанных на хплс-Нези-МС/МС были использованы для количественной оценки 8-окродго, 1,N6-Дадо и 1,N2-ДГО в ДНК, извлеченные из различных биологических образцов12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Мелкие частицы (PM2,5) несут органические и неорганические химические вещества, такие как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), нитро-ПАУ, альдегиды, кетоны, карбокфильные кислоты, хинолинов, металлы и водорастворимые ионы, которые могут вызывать воспаление и окислительный стресс, условия, благоприятствуют возникновению био повреждений и заболеваний30,31,32,33. Мы представляем здесь подтверждены HPLC-НЕЗИ-МС/МС методы, которые были успешно применены для количественной оценки 8-oxodGuo, 1,N6-Дадо и 1,N2-ДГО в легких, печени и почек ДНК A/J мышей для Оценка воздействия окружающего PM2,5 экспозиции34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

ДНК-протоки и окисленные базы ДНК являются примерами повреждений ДНК, которые являются полезными биомаркерами для оценки токсичности веществ, которые электрофильные, генерировать реактивные электрофилы при биотрансформации, или индуцировать окислительный стресс. Среди окисленных нуклеобаз наиболее изученной является 8-оксо-7, 8-дигидрогуанин (8-Оксигуа) или 8-оксо-7, 8-дгидро-2'-дезоксигуаньзин (8-Окродго), биомаркер окислительно индуцированного базового повреждения в ДНК. Альдегиды и эпоксидииды в результате процесса перекисного окисления липидов являются электрофильными молекулами, способными образовывать мутагенные экзоциклические ДНК-протоки, такие как эгенские аддукты 1,n2-этено-2'-дезоксигуанозин (1,n2- в) и 1,n6-этено-2'-дезоксиаденозин (1,n6-на-в), которые были предложены в качестве потенциальных биомаркеров в патофизиологии воспаления. Селективные и чувствительные методы для их количественной оценки в ДНК необходимы для разработки профилактических стратегий для замедления темпов мутации клеток и развития хронических болезней (например, рака, нейродегенеративных заболеваний). Среди чувствительных методов их обнаружения (высокопроизводительного жидкостного хроматографии в сочетании с электрохимическим или тандем масс-спектрометрических детекторов, кометы анализ, иммуноанализы, 32P-постмаркировки), наиболее избирательным являются те, основанные на высокой производительности жидких хроматографии в сочетании с тандем масс-спектрометрии (HPLC-ЭСИ-МС/МС). Селективность является существенным преимуществом при анализе сложных биологических образцов и HPLC-НЕЗИ-МС/МС превратилась в золотой стандарт для количественной оценки модифицированных нуклеолы в биологических матрицах, таких как ДНК, моча, плазма и слюна. Польза изотопно чистых маркированные внутренне стандарты добавляет преимущество коррекций для потерь молекулы во время этапов гидролиза дна и анализата обогащения, также, как для разницы анализирована ионизации между образцами. Это также помогает в идентификации правильной хроматографической пик, когда более чем один пик присутствует.
Мы представляем здесь проверены чувствительной, точной и точной HPLC-НЕЗИ-MS/MS методы, которые были успешно применены для количественной оценки 8-oxodGuo, 1,N6-Дадо и 1,n2-ДГО в легких, печень и почки ДНК A/J мышей для Оценка воздействия окружающей среды ТЧ2,5 .

Средние концентрации ДНК (± SD), полученные из печени мышей (~ 1 г ткани), легких (~ 0,2 г ткани) и почек (~ 0,4 г ткани), соответственно, 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 и 3 223 ± 723 мкг/мл в окончательном объеме 200 мкл. Репрезентативная Хроматограмма, получаемая HPLC-Папой очищенной ДНК показана на <str...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Количественное определение трех поражений ДНК с помощью масс-спектрометрии и оценки их уровней в тканях мышей, подвергшихся воздействию мелких твердых частиц

Мы описываем здесь методы для чувствительной и точной количественной оценки поражений 8-оксо-7, 8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-Окродго), 1,n6-этено-2'-дезоксиаденозин (1,n6-Дадо) и 1,n2- этено-2'-дезоксигуаньзин (1,N2-ДГО) в ДНК. Эти методы применялись при оценке воздействия мелких твердых частиц (ТЧ2,5) в тканях (легких, печени и почек) подвергшихся воздействию A/J мышей.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Представленные здесь методы позволяют количественно оценить поражения ДНК, вызванные окислительным стрессом, способствуя пониманию патофизиологических механизмов, которые могут быть направлены на профилактику и лечение заболеваний. Избирательность и чувствительность являются основными преимуществами. Избирательность является существенным преимуществом при работе со сложными биологическими образцами.HPLC в сочетании с тандемом масс-спектрометрии развивалась как золотой стандарт для этого типа количественной оценки с биологическими матрицами. Окислительный стресс является общим событием для различных патофизиологических процессов. Повышенный уровень этино аддуктов были обнаружены в тканях или моче пациентов с воспалительными заболеваниями.Поражения ДНК также предоставляют информацию об эндогенных событиях, вызванных воздействием загрязняющих веществ. Если поражения ДНК увеличиваются, воздействие может быть на уровне, который увеличивает риск развития рака, например. Поражения могут быть количественно в ДНК из любой клеточной системы и в качестве альтернативы в моче, плазме, слюне культуры среды с адаптацией в подготовке образца.Для начала используйте культурную тарелку, помещенную на лед в качестве основы, чтобы вырезать кусок ткани скальпелем. Взвесить один грамм ткани в каждой 50-миллилитровой крышкой трубки для немедленного использования. Держите оставшиеся ткани на сухом льду перед хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию.К каждой трубке добавьте 10 миллилитров раствора коммерческого клеточного лиза, содержащего 0,5-миллимолярный дефероксамин, и держите на льду. Установите гомогенизатор ткани на низкой скорости, около 60 до 90 об/мин. Гомогенизировать ткани на льду в течение нескольких минут, пока раствор без фрагментов тканей.Затем добавьте 150 микролитров раствора протеиназы K в каждый гомогенизированный образец. Встряхните трубки инверсией и держите их при комнатной температуре на ночь. Утром добавьте 40 микролитров раствора рибонуклеазы А, встряхните инверсией и держите трубки при комнатной температуре в течение двух часов.Добавьте пять миллилитров раствора коммерческих белковых осадков, вихрь энергично, и центрифуга в 2000 раз г, четыре градуса по Цельсию, в течение 10 минут. Перенесите супернатанты на 50-миллилитровые трубки с 10 миллилитров холодного изопропанола. Переверните трубки осторожно несколько раз до наблюдения осажденной ДНК.Используйте трубку Pasteur закрытую в конце для того чтобы собрать осаждаемую дна. Передача собранной ДНК в трубки, содержащие четыре миллилитров 10-миллимолярный буфер Tris и один миллимолярный удополномочных препаратов при рН семь для растворения. После того, как ДНК полностью растворяется в трубках, добавьте четыре миллилитра хлороформного раствора, содержащего 4%изоамиловый спирт в каждую трубку.Переверните трубки 10 раз для гомогенизации, центрифугу при 2000 раз г, четыре градуса по Цельсию, в течение 10 минут, и перенесите верхние фазы в новые трубы. Повторите промывку верхней фазы с раствором хлороформа еще два раза. Затем добавьте восемь миллилитров абсолютного этанола и 0,4 миллилитров пятимолярного раствора хлорида натрия для осаждения ДНК.Опять же, собирать осаждаемую ДНК, и передать его в три миллилитров 70% этанола. Повторите мыть с 70%этанол еще раз. Отбросьте раствор этанола с осторожностью, и инвертировать трубки, содержащие осаждаемую ДНК на абсорбативной бумаге, чтобы удалить избыток раствора.После подготовки образцов гидролиза ДНК с изотопным стандартом 15N5 1, N6-этино-деоксиаденозин и 15N5 изотопный стандарт 1, N2-этино-деоксигуанозин в соответствии с рукописью, передача 10 микролитров каждого образца в трубки для количественной оценки нормальных дезоксинуэзидов HPLC-UV. Подвергаем остаточный объем твердой фазе извлечения. Для выполнения HPLC, первый elute C18 колонке прилагается к картриджу C18 SecurityGuard с градиентом 0,1% formic кислоты и метанола.Настройка градиентной программы для запуска от нуля до 25 минут с нулем до 18%метанола, от 25 до 27 минут с 18 до 0%метанол, затем от 27 до 37 минут с 0%метанол при скорости потока один миллилитр в минуту и 30 градусов по Цельсию. После этого ввимит объем от двух до шести микролитров для каждого образца, зарезервированного для нормальной количественной оценки деоксинуклеозидов. Установите детектор DAD на 260 нанометров для интеграции пиков деоксигуанозина и деоксяденозина.Для выполнения твердой фазы экстракции для анализа 1, N6-этино-деоксяденозина и 1, N2-этино-дезигуанозина, сначала загрузите картриджи серией растворов объемом в один миллилитр. Добавьте 100% метанол, деионизированную воду, гидролизованный образец ДНК, деионизированную воду, 10%метанол, 15% метанол и, наконец, 100% метанол для сбора. Затем, продолжайте в соответствии с рукописью.После подготовки образцов гидролиза ДНК 15N5 изотопного стандарта 8-оксо-дезигуанозина, перенесите 80 микролитров каждого образца во флаконы для анализа в системе HPLC-ESI-MS/MS. Зарезервировать оставшиеся 20 микролитров для количественной оценки деоксигуанозина на HPLC-UV, как это было сделано ранее. Для анализа 8-oxo-deoxyguanosine на HPLC-ESI-MS/MS, elute C18 колонка A в сочетании с картриджем C18 SecurityGuard с градиентом растворителя A и B со скоростью потока 150 микролитров в минуту и 25 градусов по Цельсию.Запустите бинарный насос с нулем до 15% растворителя B в течение первых 25 минут, от 15 до 80% растворителя B от 25 до 28 минут, 80% растворителя B от 28 до 31 минут, от 80 до 0% растворителя B от 31 до 33 минут, и 0% растворителя B от 33 до 46 минут. Навемите первые 16 минут колонки A eluent на отходы. Состояние колонки B от изократического насоса с раствором 15%метанола в воде, содержащей 0,1%-ю микроматическую кислоту при скорости потока 150 микролитров в минуту.Через шесть минут проверьте хроматограмму, чтобы обеспечить 8-oxo-deoxyguanosine стандартные элюты из столбца A.During интервала от 16 до 32 минут, переключите клапан на положение, позволяющее соединение между колонкой А и колонкой B.Close клапан на 32 минуты, чтобы elute 8-oxo-deoxyguanosine из второй колонки и получить резкий хроматографический пик. Для анализа 1, N6-etheno-deoxyadenosine и 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute колонка C18 соединенная к патрону C18 SecurityGuard с градиентом растворителя a и b на тарифе потока 130 микролитров в минуту и 25 градусов Celsius. Запустите бинарный насос с 0% растворителя B в течение первых 10 минут, от нуля до 20% растворителя B в течение 10 до 39 минут, от 20 до 75% растворителя B от 39 до 41 минут, 75% растворителя B от 41 до 46 минут, от 75 до 0% растворителя B от 46 до 47 минут, и 0% растворителя B от 47 до 60 минут.Используйте клапан переключения, чтобы направить первые 35 минут элюента на отходы и от 35 до 42 минут фракции к источнику ESI. Убедитесь, что стандарты аддука утеха от столбца в установленной интервале. Интегрируйте пики 8-оксо-дезигуанозина 15N5 изотопного стандарта 8-оксо-дезигуанозина, 1, N6-этино-деоксиаденозин, 15N5 изотопный стандарт 1, N6-этино-деоксиаденозин, 1, N2-этино-дезигуанозин, и 15N5 изотопный стандарт 1, N2-этино-deoxyguanosine от HPLC-ESI-MS/MS анализов.Рассчитайте соотношения площади для кривых калибровки и образцов. Установите кривые калибровки и вычислите количество повреждений в каждом инъекционной выборке. Интегрируйте пики дезоксигуанозина и деоксиаденозина из анализа HPLC-UV.Используйте области для установления кривых калибровки, и рассчитать количество дезоксигуанозина и дезоксяденозина у животных в каждом введенном образце. Рассчитайте молярные фракции для 8-oxo-deoxyguanosine над дезоксигуанозином, 1, N6-этино-деоксиаденозин над дезоксаденозином, и 1, N2-этино-деоксигуанозин над дезоксигуанозином, которые дают количество поражений на один миллион нормальных дезоксигуано. Репрезентативная хроматограмма очищенной ДНК, полученная HPLC-UV, показывает наличие четырех нормальных деоксинуклеозидов, свободных от РНК рибонуклеозидов, демонстрирующих чистоту ДНК.Показаны репрезентативные хроматограммы из HPLC-ESI-MS/MS 8-оксо-дезигуанозина, 1, N6-этино-деоксиаденозина и 1, N2-этино-дезигуанозин в образцах ДНК тканей мышей. Хроматограмма, полученная с помощью УФ-обнаружения, показывает, что четыре нормальных дезоксинулозида вытугнули из первой колонки примерно до 10 минут, с хорошим отделением от 8-оксо-дезигуаносина, устраняя нежелательные помехи. Важно помнить о точных количественных данных, чтобы всегда иметь одинаковое количество внутренних стандартов в объеме впрыска в кривых калибровки и образцов.Представленные здесь методы могут быть адаптированы для количественной оценки других модифицированных дезоксинуклеозидов. Расширение полосы модифицированных деоксинуклеозидов позволяет лучше понять лежащие в основе патофизиологические механизмы. Мы можем исследовать роль окислительного повреждения в различных ситуациях, таких как воздействие ксенобиотики, диабет, и злокачественные преобразования клеток, тем самым помогая развитию превентивных и лечебных стратегий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Микроволновая печь Assisted экспресс-диагностики болезней растений Вирус помощью просвечивающей электронной микроскопии

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Трансформация пробиотических дрожжей и их восстановление из желудочно-иммунных тканей После желудочный зонд у мышей

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Использование филогенетический анализ расследовать эукариотический геном происхождения

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Обогащение бактериальных липопротеинов и подготовка N-терминальный Lipopeptides структурные определения по масс-спектрометрии

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...